자궁경부암 세포주들에서 리포좀을 이용한 종양억제 유전자 [pRcCMVp53/liposome]의 직접 이입법에 의한 세포 성장 억제 효과

김승조,이헌영,남궁성은,김수평,이준모,안웅식,김종국,박순희,박용석,김진철,한유진,양재명,신봉영,서상용,김동재 대한산부인과학회 1999 Obstetrics & Gynecology Science Vol.42 No.4

목적: 자궁경부암 유전자 치료를 위하여 자궁경부암 세포주들에 리포좀을 이용한 종양억제 유전자[wild-type p53 gene]의 직접 이입을 통하여 세포성장 억제효과를 보고자 하였다. 방법: 자궁암세포주들 [CaSki, SiHa, HeLa, HeLaS3, C33A, HT3]을 12 well에 104, 96 well에 5×103의 수로 triplicate를 형성한 뒤 대조군, pRcCMVp53, lipofectin, pRcCMV/lipofectin, pRcCMVp53/lipofetin이 함유되있는 것 을 각기 12 well에 20 ㎕씩 96 well에는 10 ㎕씩을 투여한 다음 7일간 배양하였다. 세포수 측정, ELISA [neutral red] assay, MTT등을 이용하여 세포성장과 cell viability를 측정하고 이를 one-way ANOVA F-test, multiple comparison Tukey method에 의해 날짜별 서로 군의 차이를 비교 하였다. 결과: p53 유전자에 의한 자궁경부암 세포주의 성장억제를 확인하기 위하여 세포 수 측정, ELISA assay, MTT assay를 시행하였으며 각각의 assay에 대한 측정 마지막날인 6일째를 기준으로 정상대조군 세포와 비교한 결과 세 포수 측정에서는 CaSki[89%], SiHa[59.2%], HeLa[86%], HeLaS3[78%], C33A[91%] 그리고 HT3[74%] 성장억제를 나타냈다. 또한 Neutral red를 이용한 세포 viability assay 에서는 CaSki[70%], SiHa[93%], HeLa[73%], HeLaS3[50%], C33A[67%] 그리고 HT3[52%]에서 는 52%의 세포감소를 보여주었다. MTT assay를 통한 각각의 자궁경부암 세포주의 세포성장억제 결과는 CaSki[38%], SiHa[72%], HeLa[53%], HeLaS3[28%], C33A[33%]그리고 HT3[53%]였다. 결론: 자궁경부암 세포주에 직접 이입법을 통한 유전자 전달 후 세포성장 억제는 매우 유익하게 감소되었으며 이와같은 결과는 향후 유전자 직접 이입법에 의한 자궁경부암 환자에 있어서 유전자 치료를 실시할 수 있는 새로운 장으 로 생각이 되어진다. Purpose: We investigated cell growth inhibitory effect of the wild type p53 gene into the cervical cancer cells via the recombinant p53 plasmid, pRcCMVp53 with lipofectin. Method: Inhibition of the growth of cervical cells as determined by a cell count assay. The cells were inoculated at density of 104 cells/well in each 12 well plate, 24 hrs before infection. At each indicated point, cells in three wells on each well plate were trypsinized and counted. The mean cell counts of triplicated well after transfection at day 1~6 was checked. Inhibition of the growth of cervical cells were checked by ELISA assay, MTT assay. The cells inoculated at densities of 5×103/well in each 96 plate 24 hrs before infection. At each indicated point cells of three wells were transfected for 6 days, harvested and counted by liquid scintillation counter the mean cpm per triplicate wells were plated for ELISA and MTT assay. One-way ANOVA F-test and multiple comparison Tukey method was used for statistical analysis. Result: Inhibition of the growth of cervical cells in cell count showed CaSki[89%], SiHa[59.2%], HeLa[86%], HeLaS3[78%], C33A[91%] and HT3[74%]. ELISA assay showed CaSki[70%], SiHa[53%], HeLa[73%], HeLaS3[50%], C33A[67%] and HT3[73%]. MTT assay showed HeLa[33%], HeLaS3[28%], SiHa[75%], CaSki[38%], C33A[33%] and HT3[53%]. Conclusion: These results indicate that transfection of cervical cancer cells with the wild type p53 gene via pRcCMVp53 with lipofectin is a potential novel approach to the gene therapy of cervical cancer.

Two Noble heparin lyases from Bacteroides stercoris HJ-15, a human Intestinal Bacterium

BT Kim,WS Kim,YS Kim,DH Kim 대한약학회 1999 大韓藥學會 總會 및 學術大會 Vol.48 No.-

ATP-sensitive K+ Channel Attenuates Mitochondrial Superoxide Production Induced by Ischemia

Cuong DV,Kim NR(김나리),Youm JB(염재범),Joo H(주현),Park WS(박원선),Kang SH(강성현),Kim TH(김태호),Kim HK,Kim HJ,Moon HJ,Lee HS,Khoa TM,Thu VT,Kim EY(김의용),Han J(한진) 한국생물공학회 2005 한국생물공학회 학술대회 Vol.2005 No.10

Change of Nitric Oxide Synthasesfrom Epicardium to Endocardium in Rat Cardiac Ventricular During Ischemic Preconditioning

Chong DV,Kim NR(김나리),Youm JB(염재범),Joo H(주현),Park WS(박원선),Kang SH(강성현),Kim TH(김태호),Kim HK(김형규),Kim HJ(김현주),Moon HJ(문혜진),Lee HS(이현숙),Khoa TM,Thu VT,Kim EY(김의용),Han J(한진) 한국생물공학회 2005 한국생물공학회 학술대회 Vol.2005 No.10

Cytosolic and Mitochondrial Calcium Transient During the Release of Histamine Induced by Beta-1,3-Glucan in Bone Marrow Mast Cells

Cuong DV,Youm JB(염재범),Kim N(김나리),Joo H(주현),Park WS(박원선),Kang S(강성현),Kim T(김태호),Kim H(김형규),Kim H(김현주),Moon H(문혜진),Lee H(이현숙),Khoa TM,ThuVT,Kim E(김의용),Han J(한진) 한국생물공학회 2005 한국생물공학회 학술대회 Vol.2005 No.10

자궁경부암 세포주들에서 리포좀을 이용한 아데노 연관 바이러스 종양억제 유전자 [pAAVCMVp53]의 직접 이입법에 의한 세포 성장 억제 효과

김승조,이헌영,남궁성은,김수평,이준모,안웅식,이지영,김종국,박순희,박용석,한유진,양재명,서상용,김동재,조규남 대한산부인과학회 1999 Obstetrics & Gynecology Science Vol.42 No.5

목적: 자궁경부암 유전자 치료를 위하여 자궁경부암 세포주들에 리포좀을 이용한 아데노 연관 바이러스 종양억제 유전자[pAAVCMVp53]의 직접 이입효과와 이를 통한 세포성장 억제효과를 보고자 하였다. 방법: 자궁암 세포주들 [CaSki, SiHa, HeLa, HeLaS3, C33A, HT3]은 각각 12well plate에 104/well, 96 well plate에 5×103/well수로 triplicate를 하였다. 또한, 대조군pAAVCMVp53, lipofectin, pAAVCMVp53/lipo fectin, pAAVCMV/리포펙틴이 함유되있는 것을 각12 well에 20 ㎕씩 96 well에는 10 ㎕씩을 투여한 다음 7일간 배양하였다. 세포수 측정, ELISA [neutral red] assay, MTT assay와 tritium thymidine incorporation assay등을 이용하여 세포성장과 세포 생육성을 측정하고 이를 one-way ANOVA F-test, multiple comparison Tukey method에 의해 차이를 비교하였다. 결과: p53 단백질의 발현은 배양 3일째 최고치를 나타냈으며, 이입율은 자궁경부암 세포들의 종류별로 약 10%∼37.5% 이었다. 도입 후 6일 기준으로 정상 대조군 세포와 비교한 결과 CaSki의 경우 세포수는 60.8%, Neutral red assay는 26.2%, MTT assay는 41.8%, tritium thymidine assay는 66.6%의 감소를 보였고, SiHa는 각각 58.5%, 32.4%, 51%, 88%, HeLa는 35.5%, 53.3%, 42.2%, 42.5%, HeLa S3는 67.4%, 24.5%, 21.6%, 71.1%, C33A는 53.1%, 44.2%, 36.8%, 76%, HT3는 86.9%, 50.4%, 6.3%, 26.5%의 감소를 보였다. 결론: 자궁경부암 세포주에 직접 이입법을 통한 p53 유전자 전달 후 세포의 성장은 유의하게 억제되었다. 이와같은 결과는 향후 자궁경부암 환자에 있어서 아데노 연관 바이러스를 이용한 억제 유전자의 직접 이 입법에 의한 유전자 치료를 실시할 수 있는 새로운 장으로 생각되어진다. Purpose: Cervical cancer is strongly associated with human papilloma virus [HPV] and the transforming viral genes E6 and E7 are steadily expressed by the tumor cells. To evaluate the transfection efficiency of pAAVCMVp53 by lipofectin and explore the growth inhibitory potential of an pAAVCMVp53 in various cervical cancer cell lines, we constructed pAAVCMVp53. Methods: CaSki, SiHa, HeLa, HeLaS3, C33A and HT3 cervical cancer cell lines were used for evaluate the growth inhibitory effect of pAAVCMVp53 transferred by lipofectin. These cells were cultured for 6 days, we divided transfection groups into five groups, control, pAAVCMVp53, lipofectin, pAAVCMVp53/lipofectin and pAAVCMV/lipofectin. Cell proliferation was checked by cell counting after Trypan blues staining, cell viability assay by ELISA method stained by neutral red, MTT assay and [3H] Thymidine incorporation assay. And Western blot was performed for confirming p53 gene expression after 1, 3, 5 days. For the statistical analysis one-way ANOVA F-test, multiple comparison Tukey method was used. Results: The third day after gene transfection showed the highest expression of p53 protein. Transfection efficiency was about 10%∼37.5%. pAAVCMVp53 inhibited cell growth with lipofection by cell counting after 6 day culture about 60.8% CaSki and 58.5% in SiHa cells, 35.5% in HeLa and 67.4% in HeLaS3, 53.1% in C33A and 86.9% in HT3 compared to control cells. Conclusion: These data suggest that transfection of cervical cancer cells with pAAVCMVp53 with lipofectin is a potential novel approach to the gene therapy of cervical cancer.

전이성 저위험군 융모성질환에서 MTX와 EMA 화학요법제의 치료효과에 대한 비교연구

김승조,정재근,배석년,남궁성은,김종호,곽은정,주수만,김옥화,백남규,변철,손우석 대한산부인과학회 1995 Obstetrics & Gynecology Science Vol.38 No.5

1984년 3월부터 1994년 6월까지 가톨릭대학교 의과대학 부속 강남성모병원을 내원하여 임신 성융모성 질환으로 진단받은 환자들중 ,FIGO의 해부학적 분류에 따른 임상기 결정과 WHO 의 항암제 내성 예측을 위한 인자에 근거한 예후점수제에 의해 병기 III의 저위험군으로 분류된 35명에서 일차약제로 MTX 와 FA를 단독으로 사용한 단일 화학요법군 22명과 EMA(VP-16, MTX 그리고 Act-D)를 사용한 복합 화학요법군 13명으로 나누어 각각의 치료효 과를 약제독성, 경쾌율, 약제 내성발현, 치료횟수, 치료기간 및 치료경비 등을 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 두 군간에 예후인자에 따른 임상적 특징에 차이는 없었다. (p$gt;0.05). MTX 예민군과 저항 군들 사이에도 예후인자에 따른 임상적 특징에 차이가 없었다. (p$gt;0.05). 2. MTX 군은 22명중 MTX만으로 경쾌에 이른 경우는 10명(45.5%)였고 12명(54.5%)은 MTX에 대한 약제내성을 나타내어 이차약제를 사용하였다. MTX군의 전체적인 경쾌율은 95.5%였고, 반면에 EMA군에서는 약제내성을 나타낸 경우 없이 100%의 경쾌율을 보였다. 3. 완전경쾌까지의 평균 치료 횟수는 MTX군에서 5.8회(range 3-10)로 EMA군의 3.9회(3-6)에 비하여 현저히 많은 횟수의 화학요법제 사용이 필요하였다. (p$lt;0.05). 화학요법 시작부터 완 전경쾌까지의 평균 치료기간은 MTX군에서 평균 14.3주 (8.4-23.9)였고 EMA군에서는 평균 7.6주(4.9-10.6)로 EMA군의 치료기간이 MTX군에 비해 현저히 짧았다(p$lt;0.05). 4. 약제독성은 두군간에 차이가 없었다. (p$gt;0.05). 5. 완전경쾌까지의 평균 총치료경비는 EMA군이 MTX군에 비하여 현저히 낮았다. (p$lt;0.05). 이상의 결과를 종합해보면 병기 III의 저위험군 환자에서 지금까지 일차약제로 사용하고 있 는 MTX와 FA 단독요법으로 많은 환자에서 만족스러운 결과를 보이고는 있지만 EMA 의 사 용으로 비교적 적은 독성과 약제내성의 발현없이 높은 관해율을 구할 수 있을 뿐만아니라 단일화학요법군에 비하여 치료횟수와 기간이 짧고 경비를 절감할 수 있었다. 따라서 저위험 군 전이성 임신성 융모성 질환환자에서 EMA는 MTX단독사용에 비하여 더 효과적인 치료 법으로 사용될 수 있을것으로 사료되며 향후 더 많은 임상 자료의 축적이 요구된다. From March 1984 through June 1994 thirty-five patients with stage III GTT at low risk were involved in this study. patients were randomly subdivided into two groups according to the first line chemotherapy regimen. Twenty-two patients had Methotrexate(MTX) with folinic and (FA). Thirteen patients had normal hCG value for 3 consecutive weeks, we comsidered is as remission. If the patients show plateau for more than 2 consecutive weeks we considered of hCG and if there is new evidence of metastasis we used second line chemotherapy . In the MTX group , 12 patients (54.5%) showed MTX-resistance and required second line chemotherapy , In contrast, of those 13 patients initially treated with EMA, no one showed chemoresistant disease. In the sensitive cases of MTX group , complete remission (CR) was achieved by 4.3 courses of chemotherapy (range, 3-6). In the EMA group 3.9 couses(range, 3-6) were required for CR. The mean interval between the initiaion of chemotherapy and induction of CR was significantly reduced in the EMA group than sensitive cases of MTX group (7.6 vs 11.1 weeks). The costs of therapy to induce CR in two groups were compared. The overall cost of EMA group was less expensive than that of MTX groups. In both treatment group , there was no significant difference with toxicity of drugs. Accordiong to the results of this study, we expected that EMA regimen seems to be more effective than MTX with FA in the management of stage III GTT patients at low risk. EMA regimen also seems to prevent the development of chemoresistant cases.

후레자일 X 증후군의 분자유전학적 진단 (I)

김승보,이숙환,곽인평,차광열,김종욱,이우식,김언경 대한산부인과학회 1995 Obstetrics & Gynecology Science Vol.38 No.12

본 연구는 1993년 11월부터 1994년 12월까지 차병원 산부인과,기초의학연구소,소화아동병원 및 순천향대학병원에서 후레자일 X 증후군의 진단을 위해 내원한 94명을 대상으로 말초 혈액에서 DNA를 추출후 써던 블롯팅과 중합효소연쇄반응을 이용하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 남녀 환자, 보인자의 빈도는 남자환자가 6.4%, 여자환자가 2.1%이었고, 남녀보인자는 각각 4.3%로 일반적으로 알려져있는 general population 빈도보다 월등히 높았다. 이는 본 연구에서 시행된 94예가 후레자일 X 증후군의 의심하여 그 진단을 위해 의뢰된 것이기 때문이며 아직까지 치료방법이 개발되어 있지않는 본 증후군의 예방적인 차원에서 앞으로 우리나라에서도 general population에서의 후레자일 X 증후군의 빈도에 대한 연구가 필요하리라 본다. 2. 분자유전학적 진단방법의 하나로 써던 블롯팅은 EcoRI,Eagl의 두 가지 제한 효소의 이중 절단작용으로 정상 남녀에서는 각각 2.8kb, 2.8kb와 5.2kb의 band를, 그리고 남자보인자인 경우 2.8kb보다 높은 즉 크기(size)가 큰 band를 보이며 여자 보인자의 경우,2.8kb, $gt; 2.8kb 그리고 5.2kb의 세 band를 보이게 된다. 남녀 환자에서는 5.2kb에서 적어도 1kb이상 떨어진 부위에서 메칠화를 보이게 되는데 이런 메칠화현상은 CGG 반복수가 200개 이상으로 증폭되면서 FMRI유전자의 mRNA발현이 소실되는 과정의 late event가 그 분자학적인 병인으로 설명될 수 있다. 반면 보인자에서 볼 수 있는 band의 양상은 CGG 반복수가 54-200개 미만으로, 메칠화는 볼 수 없고 활성화된 X염색체 위에서는 발현되기 때문이다. 3. 중합효소연쇄반응을 이용한 진단방법은 정확하게 CGG의 반복수를 알 수 있다는 점과 써던 블롯팅보다 아주 적은 량의 DNA로 신속하게 결과를 얻을 수 있다는 점이 장점이 될 수 있으나, CGG의 반복수가 비교적 큰 premutation이나 CGG 반복수가 200개이상으로 늘어난 full mutation인 경우 증폭이되지 않기 때문에 band를 얻을 수가 없으므로 아직까지는 중합효소연쇄반응을 만으로 남녀보인자나 환자의 진단에는 상당한 주의가 요하고 반드시 그 결과를 써던 블롯팅으로 확인하는 것이 중요하다. 이와 같이 아직은 써던 블롯팅보다 중합효소연쇄반응을 이용한 진단율은 떨어지나, 신속하면서도 적은양의 DNA를 쓸 수 있다는 점에서 premutation 및 full mutation을 정확히 진단할 수 있는 중합효소연쇄반응을 이용한 실험방법의 개발이 시급할 것으로 생각된다. Background : The fragile X syndrome, the most common form of inherited mental retardation, is caused by mutations that increase the size of a specific DNA fragment of the X chromosome(Xq 27.3). In Korea, we don`t have molecular study analysis about the fragile X syndrome which never fount geographic, racial or ethnic clustering of this syndrome. We have analyzed fragile X syndrome in terms of molecular method. Patients and Methods : Ninety-four patients who were referred to Human Genetics Center of Cha General Hospital under the tentative impression of fragile X syndrome were studied using mutation analysis with Southern blotting and polymerase chain reaction (PCR). Mutations and abnormal methylation were detected by Southern blotting with a probe adjacent to the mutation target. Their size of the repeat region was also determined by a second method, polymerase chain reaction(PCR). The DNA in this region was amplified by the PCR and the size of the amplification products were determined. Result : DNA analysis unambiguously established the genetic status at the fragile X locus for all samples test. 8 in 94 patients(8.5%) were affected and 9 in 94 patients (9.6%) were carrier status. Conclusion : Southern blotting was more powerful and reliabla than cytogenetic testing or segregation studies with colsely linked polymorphic markers. PCR may help to analyze the size of the repeat region which led to determine the status of some carriers and normal individuals. The discrete bands in affected and carrier status detected by PCR were not always seen on the direct analysis. Therefore, caution should be exercised in interpreting PCR results alone for diagnosis of affected and some carrier individuals. we suggest that if altered allele are detected by PCR, confirmatory direct genomic Southern analysis sould be offered.

운동부하시 과도한 혈압반응의 의미와 좌심실 비대와의 연관성

김학진,이왕수,권정혜,송영빈,안지현,이상엽,이광제,김상욱,김태호,류왕성 대한순환기학회 2001 Korean Circulation Journal Vol.31 No.8

자궁경부암 유전자 치료를 위한 재조합 p53 아데노바이러스 (Ad5CMVp53) 의 제조

김승조,김진우,남궁성은,이준모,안웅식,김종국,박순희,박용석,조성대,한유진,양재명 대한산부인과학회 1998 Obstetrics & Gynecology Science Vol.41 No.5

유전자치료에 있어서 재조합 아데노바이러스는 현재 사용되고 있는 유전자 전달 시스템 중 하나로서 유전자 치료뿐만 아니라 백신개발 분야 등에 큰 잠재력을 가지고 있다. p53 재조합 아데노바이러스를 이용하여 각종 종양들을 치료하기 위한 노력들이 지금 현재에도 많은 연구소에서 활발히 진행되고 있고 특히 p53 유전자의 돌연변이가 원인이 된 종양에서는 실제로 in vitro는 물론 in vivo에서도 좋은 결과를 보여 임상실험에까지 적용했다는 보고도 있다. 한편 최근들어 표적세포에 유전자를 이입하는 방 법 중 cationic liposome을 이용하는 방법이 많은 발 전을 거듭하고 있다. cationic liposome의 빠른 발전과 치료에의 적용은 다른 방법과 비교했을 때 안정성과 생체 내로의 간단한 주입 등의 장점에 기인한 것이 다. 또한 transfection을 실시할 때 준비가 간단하며, 거의 100%에 가깝게 DNA와 complex를 이룰 수 있 으며, retroviral vector가 크기에 제한을 받아 사용에 제한을 받는 반면, 어떤 유형의 DNA 또는 RNA와도 크기에 제한없이 complex를 이룰 수 있다는 장점과 다른 방법에서 나타나는 면역반응을 극복할 수 있 다. 새롭고 향상된 liposome이 향후 계속 유용하게 쓰일 것이고, 유전자요법의 체계를 고도로 개선하여 유전자 요법의 활용성을 더욱 높이는 데 기여하리라 생각한다. 저자들도 아데노바이러스 lipofectin 암억제 유전자를 재조합하는 기술을 습득함으로써 AAVp53 등 다른 유전자 전달 벡터를 제조하는 기술을 자연 히 습득하게 될 것이며 새롭고 향상된 liposome을 개 발해 자궁경부암의 유전자치료에 유용하게 사용될 것으로 보여진다. Human papillomavirus (HPV) has been identified in the majority of invasive cervical cancer patient and has been found to contribute in a significant way to the genesis of human cervical cancer. HPV has two transforming genes that encode the oncoproteins E6 and E7, E6 can form complexes with p53 and promote p53 degradation, E7 inhibit reninoblastoma protein (RB). The p53 protein was first identified in the late 1970s as a phosphoprotein which co-immunoprecipitated with the SV40 T-Antigen. The wild type p53 protein was capable of suppressing the tumorigenic phenotype and regulating cell cycle. Human adenoviruses (Ad) are double-stranded DNA viruses with genome sizes of approximately 36 kb. This group of viruses is easy to grow and manupulate, and they exhibit a broad host range in vivo and in vitro. Adenovirus vectors for gene transfer have distinct advantages when compared with vectors derived from other DNA viruses or from retroviruses. In order to introduce wild type p53 into a cervical cancer for gene therapy, We had constructed p53 recombinant adenovirus (Ad5CMVp53). Ad5CMVp53 was created by inserting the cytomegalovirus (CMV) promoter, human wild-type p53 cDNA, and bovine growth hormone (BGH) polyadenylation signal in a minigene cassette into the E1 deleted region of the modified adenovirus type 5. A method for generating p53 recombinant adenovirus was carried out by using lipofectin-mediated cotransfection and by directly observing for the cytopathic effect (CPE) caused by recombinant adenovirus in transfected 293 cells. A direct analysis by polymeraschain reaction (PCR) on samples from the supernatant of cell cultures with CPE was also carried out, which made identification of newly generated recombinant virus rapid and specific. Finally, we had succeeded for generating recombinant adenovirus by using lipofectin transfection and then monitoring for CPE and confirmed recombianant p53 adenovirus by PCR.