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        인 유두종 바이러스 재조합 단백질을 이용한 자궁경부암 환자의 면역진단법

        김승조,남궁성은,지용헌,박종섭,김현수,박순희,정노팔 대한산부인과학회 1994 Obstetrics & Gynecology Science Vol.37 No.7

        자궁경부암 전구병소 및 자궁경부암 환자의 혈청에서 human papillomavirus(HPV)의 항체를 검출하는 것이 이들 병소들의 진단에 도움이 되는지 여부를 연구하기 위해 HPV-6b, HPV-16의 ORF 재조합 단백질을 합성할 수 있는 vector를 가진 대장균들을 M9배지에서 단백질 합성 유도제로 처리하여 새로운 단백질 합성을 유도하였고, 환자 혈청을 이용한 HPV ORF 단백질 항체 검사를 위하여는 각각의 재조합 단백질 clone으로 대장균 배지를 이용하여 각각 다량의 재조합 단백질 합성을 하였다. 실험대상은 자궁경부 상피에 아현성 HPV 감염병변이 있거나 자궁경부 상피이형증 또는 상피내암의 자궁경부암 전구병변 환자 25명과 자궁경부암 환자 81명의 혈청을 사용하였고, 정상대조군으로는 자궁경부의 HPV 감염이나 전암 병변이 없고 연령이 실험군과 비슷한 양성부인과 환자 40명의 혈청을 사용하였으며 그 결과는 다음과 같다. 40명의 정상대조군에서 HPV-6b ORF 재조합 단백질에 대한 항체는 E6는 4명(10%), E7는 3명(8%), L1은 7명(18%), 그리고 L2는 2명(5%)에서 양성이었다. 자궁경부 상피내 병변화자 25예에서는 E6와 E7에서 각각 7명씩(28%) 양성으로 나타났으며, L1은 2예(8%)에서, L2는 3예(12%)에서 양성이었다. 또한 81명의 자궁경부암 환자들의 혈청에서 HPV-6b ORF 재조합 단백질에 대한 항체 형성여부는 E6에서 12%, E7에서 14%, L1에서 7%, L2 단백질에서 6%로서 정상대조군에 비하여 차이를 보이지 않았다. 그러나 자궁경부 상피내 병변 환자들의 양성율(40%)는 자궁경부암 환자들의 양성율(19%)에 비하여 유의하게 높았다(p=0.027). HPV-16 ORF 재조합 단백질에 대한 항첸ㄴ 정상대조군에서 E6는 1명(3%), E7는 3명(8%)에서 양성이었으며, 그중에서 한 종류의 항체에도 양성을 보인 경우는 4예(10%)였다. 자궁경부 상피내 병변환자 25예에서는 E6에서 12명(48%), E7에서 8명(32%), L1에서는 7명(28%)이 양성으로 나타나 다른 종류의 단백질에 비하여 각각 유의하게 높은 양성율을 보였다(P$lt;0.05). 81명의 자궁경부암 환자들의 혈청에서 PHV-16 ORF 재조합 단백질에 대한 항체 형성은 E6단백질에서 27명(33%), E7에서 29명(36%), L1에서 30명(37%), L2단백질에서 9명(11%)에서 양성으로 나타났고, E7, L1단백질은 각각 유의한 증가를 보였다(P$lt;0.05). 자궁경부암 환자에 SIL환자들의 혈청내에서 한 종류의 항체라도 양성으로 나타났던 경우는 13예(52%), 54예(67%)로 정상대조군의 경우보다 각각 유의하게 높은 양성율을 보였다(P$lt;0.01). 자궁경부암 환자들의 각 임상기에서 각 HPV-15 ORF 항체들의 양성율을 비교한 바 E6 단백질은 임상기가 증가할수록 양성율이 감소함을 관찰할 수 있었으나(P=0.011), 다른 단백질은 임상기에 따라 유의하게 차이가 나는 특이한 변화를 관찰할 수 없었다. 이상의 결과로 HPV-6b, HPV-16의 재조합 단백질은 자궁경부암 환자의 혈청에서 HPV 감염에 대한 면역학적 진단에 도움을 줄 수 있고, HPV-1 E7과 L1단백질에 대한 항체는 자궁경부암 환자의 혈청에서 바이러스와 질환에 대한 특이표지물질로서 사용이 가능하리라 사료된다. Host factors are important in determining the outcome of genital human papillomavirus(HPV) infection as demonstrated by an increase in cervical cancers in immunosuppressed patients. HPV proteins may represent immunological taret such as serum antibodies against HPV infection. However, evaluation of the antibody response in patients exposed to high-risk HPV types has been hampered by the lack of a readily available source of viral proteins for use as taret antigens in serologic assays. The goals of the study presented here are 1) to determine whether serum antibodies recognized HPV fusion proteins, 2) to identify which antigens are targets of the humoral immune response, and 3) to assess the prevalence of HPV antibodies in defined populations. In this study, the assay was tested on selected group of sera from the patients with carcinomas(n=81), squamous intraepithelial lesions(SILs)(n=25) of uterine cervix and normal controls(n=40) using the purified TrpE fusion open reading frame(ORF) proteins of HPV-6b and HPV-16 by Western blot immunoassay. Restriction enzyme fragments from ORFs of HPV-6b and HPV-16 were expressed in E.Coli as tryptophan E synthetase-HPV fusion proteins through the expression vector PATH. Each fusion protein was induced by 3-indoleacrylic acid and was purified from the bacterial lysates for polyacrylamide gel electrophoresis and Western blot immunoassay. Among women with cervical cancer, 15/81 (19%) and 54/81(67%) were positive for antibodies by Western blot immunoassay to any gene products of HPV-6b and HPV-16, respectively. And in 25 patients with HPV-related SIL, 10 (40%) were positive for any of bodies(44%). The positive prevalence rate for HPV-6b in the sera of SIL patients was significantly higher than that of in the sera of cervical cancer patients(P$lt;0.05). The prevalence rates of antibodies to ORF proteins of HPV-16 in the sera of cervical cancer patients were 12%(10/81; E1), 10%(8/81; I2), 21%(17/81; E4), 33%(27/81; E6), 36%(29/81;E7), 37%(30/81; L1), and 11%(9/81; L2) respectively, while 8%(8/25) for E7, 28%(7/25) for L1, and 8%(2/25) for L2 among the patients with HPV-related cervical patients was significantly higher than that of in the sera of normal controls(P$lt;0.01). There was decreasing pattern of positivity against E6 protein of HPV-16 with the severity of cervical cancer, but there were no significant differences in positivities of other antibodies in the patients of cervical cancers according to the different stages of disease. These results suggest that the recombinant proteins from HPV-6b and HPV-16 may be useful in the immunologic diagnosis of HPV-related cervical SILs and cervical cancers respectively and antibodies to HPV-16 E7 and L1 proteins appear to be virus-specific and disease-specific markers for HPV-associated cervical neoplastic lesions.

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        Gonadotropin Releasing Hormone (GnRH) 유사체 투여에 의한 상피성 난소종양의 GnRH 막 수용체의 변화

        김승조,정재근,김진우,남궁성은,한구택,나덕진,김태응,김사진,노덕용 대한산부인과학회 1994 Obstetrics & Gynecology Science Vol.37 No.4

        정상 난소조직과 상피성 난소암 조직에서 막 단백질을 분리하여 gonadotropin releasing hormone유사체가 작용하는 조직내 막 수용체의 결합특성을 규명하고자 막 수용체의 결합 특성을 규명하고자 막수용체에 대한 연구를 실시하였고 난소암조직을 누드마우스에 이종이식시켜 종양을 형성시킨 후 gonadtropin releasing hormone 유사체를 장기가 투여할 경우 이를 펩타이드에 대한 막 수용체들의 결합 능력의 변화에 따른 종양 성장 억제효과를 비교분석하였다. 또한 gonadotropin releasing hormone유사체를 말기 상피성 난소암 환자에 투여하여 조직내 막 수용체의 수에 따른 환자의 임상경과를 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 누드마우스에 이종이식시킨 난소암 조직에 대한 gonadtropin releasing hormone 유사체의 종양성장 억제효과는 gonadtropin releasing hormone유사체 투여군에서 대조군에 비하여 유의한 종양성장 억제효과를 나타내었다(p$lt;0.001). 2. 누드마우스에 이종이식시킨 난소암 조직의 막수용체 결합특성을 분석한 결과 방사능이 표지된 gonadtropin releasing hormone유사체는 막 단백질에 있는 한 종류의 수용체 결합부위에 결합하였고, 이 결합부위는 친화도가 낮고 결합능력은 높았다. 또한 gonadtrompin releasing hormone유사체를 투여후 적출한 난소암조직의 경우에서는 결합능력이 유의하게 감소되었다(p$lt;0.001). 3. 일곱명의 난소암 환자들로부터 종양조직을 채취하여 막 수용체 결합특성을 분석한 결과 모두 gonadotropin releasing hormone유사체에 대한 수용체가 검출되었으며, 이들 수용체 결합부위는 한종류로써 낮은 친화도와 높은 결합능력을 가진 것으로 나타났다. 4. 일곱명의 난소암환자에 대하여 gonadtropin releasing hormone유사체를 장기간 투여한 후에 막 수용체 존재유무에 따른 gonadtropin releasing hormone의 종양성장 억제효과를 환자의 임상경과와 비교분석한 결과 gonadotropin releasing hormone유사체에 반응을 나타낸 다섯명의 환자에서 모두 높은 막 수용체 존재를 확인할 수 있었다(p$lt;0.001) 이상의 결과로 보아 전이성 말기 난소암 환자들에서 막 수용체의 유무를 확인하여 gonadotropin releasing hormone을 투여할 경우 암의 진행을 정지시키거나 부분적인 반응을 기대할 수 있게 됨으로써 기존의 치료방법 등에 반응이 없는 난소암 환자의 치료에 gonadotropin releasing hormone유사체는 효과적인 보조치료 수단이 될 수 있을 것으로 사료된다. Gonadropin releasing hormone (GnRH) analog, ([D-Trp^6]-luteinizing hormone-releasing hormone, [D-Trp^6]-LH-RH), can cause regression of hormone-dependent human tumors. These effects are thought to be mediated through inhibition of the gonadotropic and steroid hormone. But, it has been reported recently that this analog has a direct inhibitory effect on the tumor. To evaluate the direct inhibitory effect of GnRH analog on ovarian tumors, the characteristics of membrane receptors for GnRH analog were investigated in tissues of normal human ovaries, human ovarian cancers obtained from surgery, and heteroctransplanted nude mice tumors. The results were as follows; 1. In the heterotransplanted nude mice tumors, the inhibitory effect of GnRH analog on tumor growth was compared with untreated animals and in vivo treated animals with [D-Trp^6]-LH-RH. In the treated group showed significant growth inhibition(P$lt;0.001). 2. Specific binding of [^125I, D-Trp^6]-LH-RH were demonstrated in plasma membranes extracted from 7 human epithelial ovarian carcinomas and heterotransplanted nude mice tumors, but not in normal human ovaries. 3. In the plasma membrane preparations from ovarian cancer, statistical analysis of the binding data showed that the interaction of [D-Trp^6]-LH-RH with the binding sites was consistent with a single class of low affinity (Kd=2.1*10^9M)and high capacity binding sites (Bmax=15.8 M/mg membrane protein). 4. Therapy with [D-Trp^6]-LH-RH significantly decreased the binding capacity of receptors for [D-Trp^6]-LH-RH in heterotransplanted nude mice tumors (P$lt;0.001). 5. We observed possible correlation between GnRH binding site density and the clinical corse of the patients, and found out that GnRH responded group showed a higher GnRH binding sites than that of non responded group(P$lt;0.05). These findings are compatible with the view that [D-Trp^6]-LH-RH might exert some direct inhibitory effects on the growth of human ovarian and heterotransplanted nude mice ovarian tumors. Although the functional role of this specific binding site for [D-Trp^6]-LH-RH in ovarian carcinoma is still obscure, it might be part of an autocrine regulatory system and provide that this malignancy might be responsive to hormonal manipulations.

      • KCI등재

        고위험 포상기태 환자에서 조기 항암화학요법 투여에 대한 임상적 연구

        김승조,배석년,남궁성은,김대훈,유영옥,김재훈,박동춘,송희영 대한산부인과학회 1998 Obstetrics & Gynecology Science Vol.41 No.7

        본 저자들은 1973년부터 1996년까지 가톨릭의과대학에서 고위험군 포상기태 환자 중 포상기태 제거 후 추적검사가 용이하지 않을 것으로 판단된 환자 37명을 대상으로 조기 항암화학요법을 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 조기 항암화학요법군에서 35예에서 단일 MTX 요 법만으로 2예에서 β-hCG 값의 상승으로 EMA 제제로 대체하였고 대조군 133명 중 항암치료가 필요했던 84명 에서는 66예에서 단일 MTX 제제를 18명에서 EMA 제제 로 치료하였다. 2. 조기 항암화학요법군에서 악성화의 진행을 뜻하는 약제에 대한 저항은 나타나지 않았다. 대조군에서는 5(3.8%)명에서 약제에 대한 저항성으로 치료 실패하였다. 3. 조기 항암화학요법으로 치료한 군과 대조군의 이 환 기간은 각각 23.3±21.2주와 35.8±37.6주로 두 군 사 이에 유의한 차이가 있었다. 4. 약물치료 기간은 16.46±23.93주와 21.00±18.14주 로 차이는 있었으나 유의성은 없었다. 5. 약물치료 횟수는 각각 5.4±5.6주와 8.3±6.4주로 유 의한 차이가 있었다. 6. 조기 항암화학요법 및 대조군에서 구토가 121명 중 70(57.9%)예, 탈모증이 55(45.5%)예 및 백혈구 감소증 36 (29.8%)예 등이 있었고 치료 기간 중 사망 환자는 없었다. 7. 완치 후의 차기 임신은 항암화학요법으로 치료 받 아 경쾌되어 1년간 추적 검사하여 완치 판정을 받은 뒤 임신한 환자 38명에서 임신의 결과는 정상 범위에서 벗어나지 않았다. 이상의 결과에서 조기 항암화학요법의 사용 후 대조 군에 비해 약제에 대한 내성을 가진 환자의 감소 및 항 암제의 사용 종류 및 횟수의 감소뿐만 아니라 항암제 치 료 기간과 전체 유병 기간의 감소도 확인되었으므로 그 효용성이 입증되었다고 할 수 있다. 결과적으로 고위험 군에 대한 적절한 예측 체계와 이의 활용으로 조기 항암 화학요법을 실시할 경우 융모상피종양으로의 이행을 줄 이고 치료 기간을 단축시킬 수 있을 것으로 사료된다. 1616 hydatidiform mole (HM) patients have been treated in Korean Research Institude of Trophoblastic disease for the past twenty four years. These patients were divided into two groups, high risk and low risk group in accordance with the scoring system of Catholic University Medical colleage consisted of several factors such as age, gravity, hCG, mole type and uterine size. After evacuating mole, the overall remission rate was 76% and meanwhile, remission rate of high risk group was 69.2%. 31 out of 121 patients of high risk group were treated with early chemotherapy. In comparison with untreated group, data explained that the treated group with early chemotherapy needed less number of chemotherapy until complete remission (5.4±5.6 weeks versus 8.3±6.4 weeks p=0.0155). Further explained that the duration of chemotherapy for the treated group was shorter than that of the untreated group (16±23.93 weeks, versus 21.00±18.14 weeks p=0.335). Also, the statistics showed remarkable difference in the morbidity of disease (treated patient group with early chemotherapy 23.3±21.2 weeks versus untreated patient group 35.8±37.6, p=0.0346). In conclusion, early chemotherapy can reduce the duration of morbidity and numbers of chemotherapy.

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        자궁경부암 환자에서 혈청내 진단 물질로서 in vitro translated HPV-16 E7 단백질과 GST-fusion HPV-16 E7 단백질의 임상적 효용성 비교

        김승조,남궁성은,박종섭,김은주,김찬주,박순희,박동춘,김태연,엄수종 대한산부인과학회 1998 Obstetrics & Gynecology Science Vol.41 No.7

        이상의 결과로서 자궁경부암 환자에서 in vitro translated HPV-16 E7 단백질과 GST-fusion HPV-16 E7 단백질의 임상적 효용성을 비교하여 볼 때 자궁경부암 환자에서 HPV-16 E7 항원에 대한 항체 측정이 질환의 진단을 예측할 수 있는 보조적인 인자로서 도움을 줄 것이며, 특히 in vitro translated HPV-16 E7 단백 항원은 재발의 예측 및 치료 평가에 효과적인 종양표지물질로 이용될 수 있으리라 생각된다. 이와 같이 직접적으로 임상적인 상태를 반영할 수 있는 자궁경부암을 유발시키는 HPV 단백질의 개발 연구와 그들의 임상적인 도입은 자궁경부암의 임상적 진단과 추적 관리에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 보이며, 향후 자궁경부암과 연관된 연구에 기본적인 자료로서 가치가 있을 것으로 사료된다. Objective: Recently, a variety of HPV-related proteins have been synthesized and their utility as diagnostic and prognostic markers in cervical cancers is needed. The ability to generate preparative amounts of HPV-16 E7 proteins may have implications for the development of a serologic assay to detect anti-HPV-16 virion immune responses. The purpose of the study is to improve the way of proper management of the cervical cancer by investigating the clinical utility of in vitro translated HPV-16 E7 protein and GST-fusion HPV-16 E7 protein as the serologic marker through comparing the antibody reactions in the sera of the patients. Methods: The serologic responses were investigated in Korean women with cervical neoplasia by radioimmunoprecipitation assay (RIPA) using in vitro translated HPV-16 E7 protein and ELISA using GST-fusion HPV-16 E7 protein. PCR using E6 type-specific primers for HPV-16/18 were used to determine the presence and type of HPV infection (normal controls; 15 cases, preinvasive lesions; 15 cases, and invasive cervical cancers; HPV-16 DNA positive 78 cases and HPV-16 DNA negative 22 cases). Results: The sera of 39% (39/100) of patients with cervical cancer were RIPA positive for in vitro translated HPV-16 E7 protein [HPV-16 DNA positive cases; 41% (32/78), HPV-16 DNA negative cases; 32% (7/22)]. The sera of 29% (29/100) of cervical cancers were ELISA positive for HPV-16 GST-fusion E7 protein [HPV-16 DNA positive cases; 33% (26/78), HPV-16 DNA negative cases; 14% (3/22)]. By the two different methods, 12 cases were positively matched and 32 cases were negatively matched. The positivities for in vitrotranslated HPV-16 E7 protein in the patients with cervical cancer were 14% (7/49) in stage I, 59% (26/44) in stage II, and 86% (6/7) in stage III/IV, by significantly correlating with the advancing stage of the disease (P<0.01). Conclusions: These data suggests that the considerable number of patients with cervical neoplasia generated positive antibody response to in vitro translated protein and GST-fusion protein of HPV-16 E7. In contrast to RIPA method using in vitro translated protein, ELISA method using GST-fusion protein has several advantages for clinical application; use of non-isotope, easy preparation to produce a sufficient of protein, available large scale study. But the positive rates to in vitro translated HPV-16 E7 protein in the patients of cervical cancer were higher in general than those to GST-fusion HPV-16 proteins. Furthermore, the antibody positivities to in vitro translated HPV-16 E7 protein were increased by advancing clinical stage of disease. These HPV-16 E7 proteins might be the disease-specific markers which could be useful in adjunctive diagnostic assay and seroepidemiologic study of HPV-related cervical neoplasia.

      • KCI등재

        전이성 저위험군 융모성질환에서 MTX와 EMA 화학요법제의 치료효과에 대한 비교연구

        김승조,정재근,배석년,남궁성은,김종호,곽은정,주수만,김옥화,백남규,변철,손우석 대한산부인과학회 1995 Obstetrics & Gynecology Science Vol.38 No.5

        1984년 3월부터 1994년 6월까지 가톨릭대학교 의과대학 부속 강남성모병원을 내원하여 임신 성융모성 질환으로 진단받은 환자들중 ,FIGO의 해부학적 분류에 따른 임상기 결정과 WHO 의 항암제 내성 예측을 위한 인자에 근거한 예후점수제에 의해 병기 III의 저위험군으로 분류된 35명에서 일차약제로 MTX 와 FA를 단독으로 사용한 단일 화학요법군 22명과 EMA(VP-16, MTX 그리고 Act-D)를 사용한 복합 화학요법군 13명으로 나누어 각각의 치료효 과를 약제독성, 경쾌율, 약제 내성발현, 치료횟수, 치료기간 및 치료경비 등을 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 두 군간에 예후인자에 따른 임상적 특징에 차이는 없었다. (p$gt;0.05). MTX 예민군과 저항 군들 사이에도 예후인자에 따른 임상적 특징에 차이가 없었다. (p$gt;0.05). 2. MTX 군은 22명중 MTX만으로 경쾌에 이른 경우는 10명(45.5%)였고 12명(54.5%)은 MTX에 대한 약제내성을 나타내어 이차약제를 사용하였다. MTX군의 전체적인 경쾌율은 95.5%였고, 반면에 EMA군에서는 약제내성을 나타낸 경우 없이 100%의 경쾌율을 보였다. 3. 완전경쾌까지의 평균 치료 횟수는 MTX군에서 5.8회(range 3-10)로 EMA군의 3.9회(3-6)에 비하여 현저히 많은 횟수의 화학요법제 사용이 필요하였다. (p$lt;0.05). 화학요법 시작부터 완 전경쾌까지의 평균 치료기간은 MTX군에서 평균 14.3주 (8.4-23.9)였고 EMA군에서는 평균 7.6주(4.9-10.6)로 EMA군의 치료기간이 MTX군에 비해 현저히 짧았다(p$lt;0.05). 4. 약제독성은 두군간에 차이가 없었다. (p$gt;0.05). 5. 완전경쾌까지의 평균 총치료경비는 EMA군이 MTX군에 비하여 현저히 낮았다. (p$lt;0.05). 이상의 결과를 종합해보면 병기 III의 저위험군 환자에서 지금까지 일차약제로 사용하고 있 는 MTX와 FA 단독요법으로 많은 환자에서 만족스러운 결과를 보이고는 있지만 EMA 의 사 용으로 비교적 적은 독성과 약제내성의 발현없이 높은 관해율을 구할 수 있을 뿐만아니라 단일화학요법군에 비하여 치료횟수와 기간이 짧고 경비를 절감할 수 있었다. 따라서 저위험 군 전이성 임신성 융모성 질환환자에서 EMA는 MTX단독사용에 비하여 더 효과적인 치료 법으로 사용될 수 있을것으로 사료되며 향후 더 많은 임상 자료의 축적이 요구된다. From March 1984 through June 1994 thirty-five patients with stage III GTT at low risk were involved in this study. patients were randomly subdivided into two groups according to the first line chemotherapy regimen. Twenty-two patients had Methotrexate(MTX) with folinic and (FA). Thirteen patients had normal hCG value for 3 consecutive weeks, we comsidered is as remission. If the patients show plateau for more than 2 consecutive weeks we considered of hCG and if there is new evidence of metastasis we used second line chemotherapy . In the MTX group , 12 patients (54.5%) showed MTX-resistance and required second line chemotherapy , In contrast, of those 13 patients initially treated with EMA, no one showed chemoresistant disease. In the sensitive cases of MTX group , complete remission (CR) was achieved by 4.3 courses of chemotherapy (range, 3-6). In the EMA group 3.9 couses(range, 3-6) were required for CR. The mean interval between the initiaion of chemotherapy and induction of CR was significantly reduced in the EMA group than sensitive cases of MTX group (7.6 vs 11.1 weeks). The costs of therapy to induce CR in two groups were compared. The overall cost of EMA group was less expensive than that of MTX groups. In both treatment group , there was no significant difference with toxicity of drugs. Accordiong to the results of this study, we expected that EMA regimen seems to be more effective than MTX with FA in the management of stage III GTT patients at low risk. EMA regimen also seems to prevent the development of chemoresistant cases.

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