면역크로마토그래피를 이용한 E. coli O157: H7 신속검출 키트의 유효성 평가

곽효선,이동하,문희숙,박종석,우건조,김창민 한국식품위생안전성학회 2003 한국식품위생안전성학회지 Vol.18 No.3

식품으로부터 다양한 병원 미생물을 신속 검출하기 위하여 다양한 검출 원리를 이용한 키트들이 개발·시판되고 있다. 검사키트는 신속, 정확하고 간단하게 사용할 수 있으므로 검사기관이나 실험실 뿐 아니라 식품회사에서 QC 또는 QA를 수행하기 위하여 사용이 증가되고 있는 추세이다. 이에 본 연구에서 E. coli O157:H7의 단클론항체를 이용하여 면역크로마토그래피법에 의해 개발한 E. coli O157:H7 검출 키트(Donga Co, Korea, D-kit)에 대한 검출감도 및 특이성을 확인하고 식품 시료에 적용 가능성을 평가하였다. 면역크로마토그래피법에 의해 개발?시판되고 있는 Reveal E. coli O157:H7 (Neogen Co., USAm R-kit)와 VIP EHEC kit (Biocontrol INC., USA, V-kit)를 비교 키트로 사용하였다. E. coli O157:H7 표준균주를 사용하여 실시한 검출감도 확인시험 결과 R-kit 및 D-kit는 104/㎖의 농도에서 양성으로 확인되었고 10³/㎖에서도 약한 양성 반응을 보였으나, V-kit는 10?/㎖ 농도로 검출감도가 낮았다. 또한 배양액을 가열하여 kit에 적용하는 것이 가열하지 않은 경우보다 검출감도를 높일 수 있었다. E. coli O157:H7 분리 22주, verotoxin 생성 E. coli 7주 E. coli 분리주 40주 및 38종의 장내세균에 대한 특이성 시험 결과 세 가지 키트 모두에서 동일한 결과를 보였는데, 시험균주 107주 중 3주를 제외한 모든 균에서 음성의 결과를 보여 특이성을 확인하였다. 세 키트에 위양성 반응을 보인 것은 E. coli O157:H19, E. coli O157:H18 및 Salmonella galinarium으로 이들 혈청형과 O157:H7 사이에는 유사한 혈청학적 특성이 존재하는 것으로 추정되었다. 이상의 실험결과로 D-kit는 E. coli O157:H7을 검출하는데 감도 및 특이성 면에서 기존 키트인 R-kit 및 V-kit와 같이 유용한 것으로 확인되었다. For the rapid detection of various pathogenic microorganisms from food samples, various kinds of kits have been developed and commercially available in the markets. With the advantages of speed, accuracy and easiness, the markets of these kits has gradually increased for the QC and QA field of food company as well as testing facilities or laboratories. In this study, the characteristics such as the detection limit and the sensitivity of immunochromatographic type of rapid detection kit(Donga Co, Korea, D-kit) for E. coli O157:H7 developed by monoclonal antibody were examined and also the possibility of application of the kit to food samples was evaluated. The reference kits used for comparison study were Reveal E. coli O157:H7 (Neogen Co., USAm R-kit) and VIP EHEC kit (Biocontrol INC., USA, V-kit) occupying major market share. In the detection limit test with E. coli O157:H7 reference, both R-kit and D-kit showed a distinct positive reaction in 10⁴/㎖ and weak positive reaction in 10³/㎖, whereas V-kit showed a same reaction in 105/㎖. Also, it was identified that the culture treated with heat showed more sensitivity than no heat treated culture. The sensitivity test was conducted against 22 isolates of E. coli O157:H7, 7 strains of non-O157:H7 verotoxin- producing E. coli, 40 straine of E. coli with different O and H antigen type, and 38 strains of non-E. coli Enterobacteriaceae, and all of the test strains except three were showed exactly the same reaction against three kinds of tested kits. All the three kinds of kits showed a positive reaction against E. coli O157:H19, E. coli O157:H18 and Salmonella galinarium. We suppose that there might be a similarity in serological property between these three strains and O157:H7. From the test results, it can be concluded that there is (was) no difference between the D-kit developed in this study and R-kit or V-kit based on the detection limit and sensitivity.

Characteristics of verotoxin non-producing Escherichia coli O157 and verotoxin-producing E coli isolated from healthy cattle

정병열,정석찬,박홍제,조길재,김봉환,Jung, Byeong-yeal,Jung, Suk-chan,Park, Hong-je,Cho, Gil-jae,Kim, Bong-hwan The Korean Society of Veterinary Science 2000 大韓獸醫學會誌 Vol.40 No.3

Verotoxin을 산생하지 않은 Escherichia coli O157과 verotoxin을 산생하는 E coli(VTEC)를 건강한 소의 분변에서 분리하여 생화학적 및 유전적인 특성에 대해서 비교하였다. E coli O157 : nonH7(운동성은 있으나 H혈청형이 7이 아님)의 sorbitol 분해능과 ${\beta}-glucurondase$ 활성은 E coli O157 : H7이 나타내는 것과는 차이가 있었다. 그리고 uidA 유전자는 verotoxin 산생능과 상관없이 sorbitol과 ${\beta}-glucuronidase$ 음성인 E coli O157 : H7에서 특이적으로 검출되었다. 한편 6개 목장에서 수거한 소 분변 45예에서 VTEC를 분리한 결과, 7주(15.6%)가 분리되었으며 이들은 모두 sorbitol을 분해하였으며 ${\beta}-glucurondase$ 활성이 있었으나 장벽 부착인자를 지배하는 eaeA 유전자가 없었다. 비록 소가 VTEC의 보균원으로 추정되나, 정상 소에서 분리한 VTEC는 eaeA 유전자가 결여된 균주가 많으므로 공중위생학상 eaeA 유전자를 보유한 E coli 보다 위해성이 낮으며, 이러한 결과는 왜 사람에서 유행하는 VTEC 혈청형과 소에서 유행하는 것과 차이가 있는지를 일부 설명해준다. Verotoxin non-producing E coli O157 strains have been isolated from cattle feces and compared in particular regard to biochemical properties and genotypes with verotoxin-producing E coli (VTEC). E coli O157 : nonH7 strains had different phenotypes in sorbitol fermentation and ${\beta}-glucuronidase$ activity from E coli O157 : H7. Regardless of verotoxin production ability of E coli O157 : H7, uidA gene was uniquely detected from sorbitol and ${\beta}-glucuronidase$ negative E coli O157 : H7. Forty five fecal samples from 6 dairy farms were obtained and VTEC was detected as 15.6% (7 strains) of the samples. Most VTEC isolates were positive for sorbitol fermentation and ${\beta}-glucuronidase$ activity but negative for eaeA gene. This study suggested that cattle could be a reservior for VTEC. However, absence of eaeA gene in VTEC isolates from most of healthy cattle suggested that they might be less virulent than eaeA-positive E coli against human health.

Escherichia coli O157:H7의 단크론성 항체 생산과 효소면역분석법의 개발

류희정(Hee-Jeong Ryu),김정숙(Jeong-Sook Kim),김경열(Kyeongyeol Kim),남보람(Bo-Ram Nam),남민지(Minji Nam),심원보(Won-Bo Shim),김남수(Namsoo Kim),조용진(Yong-Jin Cho),정덕화(Duck-Hwa Chung) 한국식품과학회 2010 한국식품과학회지 Vol.42 No.3

본 연구에서는 최근 식품이나 농축산물 등에서 빈번하게 검출되고 있는 장관출혈성 대장균인 E. coli O157:H7에 대한 단크론성 항체를 생산하고, 신속ㆍ정확하게 검색할 수 있는 간접효소면역분석법을 개발한 후 시료적용가능성을 확인하였다. 먼저 LPS, HKEC 및 FKEC를 E. coli O157:H7의 면역원으로 준비하여 mouse 면역에 사용하였고, 세포융합과 cloning을 실시하여 단클론성 항체를 생산하였으며, 생산된 항체 중 높은 역가를 나타낸 HKEC 4G8-5 항체로 ID-ELISA법을 개발하였다. 개발된 IDELISA법의 최저검출한계는 10? cell/㎖이었고, S. aureus와 Sal. Typhimurium에 대해서 약간의 반응성을 나타내었지만 E. coli O157:H7에 대해 보다 강한 반응성을 나타내었기 때문에 E. coli O157:H7에 매우 특이적인 분석법인 것으로 확인되었다. 개발된 ID-ELISA법을 이용하여 돼지고기, 소고기, 닭고기 및 새싹채소에 대한 검출률 향상을 위해 각 시료를 증균한 결과, 3종의 육류와 새싹채소는 각각 증균 6시간과 2시간부터 검출이 가능한 것으로 나타나 기존의 증균법보다 신속하게 시료 속 E. coli O157:H7을 분석할 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 본 연구에서 개발된 IDELISA법을 적용하여 농축산물 중에 존재하는 E. coli O157:H7을 분석한다면 보다 신속하고 간편하게 분석할 수 있을 것으로 판단된다. Escherichia coli O157:H7 causes hemolytic uremic syndrome and hemorrhagic colitis in humans. The objectives of this study were to produce monoclonal antibody(MAb) against E. coli O157:H7 and to develop an enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) for the rapid detection of E. coli O157:H7 in agri-stockbreeding. The characterization of MAb produced from hybridoma cell (HKEC 4G8-5) was validated by ELISA and Western blot. The produced MAb was specific to E. coli O157:H7 and showed weak cross-reaction to Staphylococcus aureus. The detection limit of ELISA based on 4G8-5 MAb was 10? cell/㎖. Although the ELISA could not detect E. coli O157:H7 in the meat and sprout samples inoculated with 1×10¹ cell/10 g without enrichment, the same samples after enrichment for 6 hr were confirmed to be positive by ELISA. These results indicated that the ELISA combined with short enrichment (6 hr) is useful tool for rapid screening of E. coli O157:H7 in various samples.

E. coli O157:H7과 Staphylococcus aureus의 증식억제에 대한 키토산과 소르빈산의 상승효과에 관한 연구

조성범,이용욱,김정현 한국식품위생안전성학회 1998 한국식품위생안전성학회지 Vol.13 No.2

최근 산업의 발달로 인한 식품의 안전성에 대한 국민의 우려가 증가되고 있으며 특히 식품을 미생물의 증식으로부터 안전하게 보존하기 위한 천연식품보존제의 개발이 요구되고 있다. 지구상에 풍부한 천연자원인 키토산과 합성화학보존제인 소르빈산을 사용하여 그람음성 병원성 식중독 원인균인 E. coli O157:H7과 대표적 그람양성 식중독 원인균인 Staph. aureus에 대해 실험한 결과는 다음과 같았다. 5. coli O157:H7에 대한 키토산의 최소발육억제농도는 pH 5.0에서 500 ppm, pH 5.5에서 250 ppm, pH 6.0에서 500 ppm, 그리고 pH 6.5에서 2000 ppm이었으며, Staph. aureus에 대한 키토산의 최소발육억제농도는 pH 5.0에서 31.3 ppm이었으며 , pH 5.5 이상에서는 62.5 ppm이었다. 소르빈산의 최소발육억제농도는 pH 5.0에서 500 ppm, pH 5.5에서 1500 ppm, 그리고 PH 6.0 이상에서는 2000ppm이상이었다. Staph. aureus에 대한 소르빈산의 최소발육억제농도는 pH 5.0에서 1500ppm이었으며, pH 5.5 이상에서는 2000 ppm 이상이었다. E. coli O157:H7에 대한 키토산과 소르빈산의 병 용처리효과는 pH에 크게 영향을 받아 pH 6.5에서는 키토산농도 500 ppm과 소르빈산 500 ppm농도에 발육이 억제되었으나 pH 5.0에서는 키토산농도 250 ppm과 소르빈산 31.3 ppm에 억제되었다. 한편, Staph. aureus에서는 pH에 대한 영향이 별로 없었으며, 키토산의 영향을 크게 받으나 소르빈산의 영향은 거의 없었다. pH 6.5, 37℃의 조건하에서 E. coli O137:H7은 키토산 500 ppm 및 소르빈산 500 ppm 처리와 키토산 250 ppm 및 소르빈산 250 ppm 병용처리군에서 모두 증식이 억제되었으나 키토산과 소르빈산 단독처리군에서는 배양시간이 증가함에 따라 균의 증식이 계속되었다. Staph. aureus는 소르빈산에 영향을 받지않았으며 병용효과보다는 키토산에 대한 영향이 컸다. pH 5.5, 37℃의 조건하에서 E. coli O157:H7은 키토산 500 ppm, 250 ppm 단독첨가시와 병용처리시 모두 3시간 이내에 균증식이 억제되었다. Staph. aureus의 경우는 키토산 50 ppm 단독처리군과 키토산 25 ppm과 소르빈산 2000 ppm 병용처리군에서 균증식이 사면되었다. E. coli O157:H7에 대한 키토산과 소르빈산병용처리시 MIC와의 상관관계는 pH 6.5에서 R=0.95(p<0.01), pH 6.0에서 R=0.99(p<0.01), pH 5.5에서 R=0.97(p<0.01), 그리고 pH 5.0에서 R=0.99(p.0.01)로 높은 상관관계를 나타내었다. Staph. aureus에 대해서는 소르빈산의 병용처리에 의한 효과는 거의 없었다. 이상의 결과로 종합하면 pH변화에 따른 키토산과 소르빈산 단독 및 병용처리로 인한 상승효과를 확인할 수 있었으며 이 결과 천연식품인 키토산을 병용함으로써 인체에 영향이 있는 합성화학보존제인 소르빈산의 양을 감소시킬 수 있었으며, 또한 식품의 보존성을 더 증가 또는 유지시킬수 있을 것으로 기대되었다. This study was performed to investigate the synergistic effect of chitosan and sorbic acid as a new food preservative. So it was performed to investigate inhibitory effect on growh of E. coli 0157:H7, gram negative pathogenic food borne disease bacteria and of S. aureus, gram positive food borne disease bacteria in chitosan, sorbic acid and combination of chitosan and sorbic acid. Minimun Inhibitory Concentration (MIC) of chitosan in E. coli 0157:H7 was 500 ppm at pH 5.0, 250 ppm at pH 5.5, 500 ppm at pH 6.0, and 2000 ppm at pH 6.5, while in Staph. aureus 31.25 ppm at pH 5.0 and 62. 5 ppm at more than pH 5.5. also, MIC of sorbic acid in E. coli 0157:H7 was 500 ppm at pH 5.0, 1500 ppm at pH 5.5, and 2000 ppm at more than pH 6.0, while in Staph. aureus 1500 ppm at pH 5.0 and more than 2000 ppm at more than pH 5.5. Due to the effect of pH in E. coli 0157:H7, MIC of combined chitosan and sorbic acid was 500 ppm of chitosan with 500 ppm of sorbic acid at pH 6.5, but 250 ppm of chitosan with 31.3 ppm of sorbic acid at pH 5.0. In Staph. aureus, there was great effect of chitosan, but neither effect of pH nor sorbic acid. When E. coli 0157:H7 were treated with 500 ppm of chitosan with 500 ppm of sorbic acid and 250 ppm of chitosan with 250 ppm of sorbic acid at pH 6.5, they were inhibited. But, they were increased at the initial concentration of bacteria at 1000 ppm of chitosan in 18 hours, at 500 ppm of chitosan in 36 hours. There was no effect of growth inhibition with sorbic acid but great effect with chitosan on Staph. aureus. The correlations between MICs of chitosan and sorbic acid in E. coli 0157:H7 accoding to pH were higher than those in Staph. aureus. R values in E. coli 0157:H7 were 0.95 (p<O.Ol), 0.99 (p<O.O1), 0.97 (p<O.Ol), and 0.99 (p<O.Ol) at pH 6.5, 6.0, 5.5, and 5.0 respectively. The synergistic effect of chitosan and sorbic acid in E. coli 0157:H7 could be confirmed from the result of this experiment. Therefore, it was expected that the food preservation would increase or maintain by using sorbic acid together with chitosan, natural food additive that did no harm to human body.

Morphological features and lipopolysaccharide attachment of coliphages specific to Escherichia coli O157:H7 and to a broad range of E. coli hosts

김은진,이혜인,이주훈,류상렬,박종현 한국응용생명화학회 2016 Applied Biological Chemistry (Appl Biol Chem) Vol.59 No.1

The objective of the present study was to analyze host-phage adsorption of bacteriophages infecting Escherichia coli O157:H7 and the other E. coli strains. Out of 55 coliphage strains, we selected seven coliphages infectious only to 23 E. coli O157 and seven other coliphages of broad specificity to E. coli O157:H7 and other 61 E. coli. Escherichia coli O157-specific phages and the broadly specific phages all belonged to the Siphoviridae and Myoviridae family, respectively. Escherichia coli O157-specific phages infected E. coli O157:H7, but not E. coli O157:H7△rfaL, deletion mutant of O-antigen ligase gene for lipopolysaccharide. Five coliphages among the broadly specific phages infected E. coli O103, but not E. coli O103△rfaG, deletion mutant of the glycosyltransferase gene. E. coli O157:H7-specific phages among Siphoviridae recognized O-antigen of E. coli O157, but the broadly specific coliphages of Myoviridae may recognize O-antigen and/or a part of the lipopolysaccharide core as an adsorption site in various E. coli. The receptor of the two coliphage groups interacts with some part of lipopolysaccharide, and the tail morphology of the coliphages may be related to their adsorption to and recognition of a different part of lipopolysaccharide. In particular, specificity of E. coli O157:H7-specific phages carrying the long tail of Siphoviridae for O-antigen as a receptor seems to be high.

Detection of Escherichia coli O157 and Escherichia coli O157:H7 by the immunomagnetic separation technique and stx1 and stx2 genes by multiplex PCR in slaughtered cattle in Samsun Province, Turkey

Gökhan Inat,Belgin Siriken 대한수의학회 2010 Journal of Veterinary Science Vol.11 No.4

This study was conducted to investigate the presence of Escherichia (E.) coli O157 and E. coli O157:H7 and stx1 and stx2 genes on cattle carcasses and in rectal samples collected from Samsun Province of Turkey. A total of 200 samples collected from cattle carcasses and the rectal contents of 100 slaughtered cattle from two commercial abattoirs were tested using the immunomagnetic separation technique and multiplex PCR methods. E. coli O157 and E. coli O157:H7 were detected in 52 of the 200 samples (26%) tested. Of the positive samples, 49 were E. coli O157 and three were E. coli O157:H7. The E. coli O157 strain was isolated from 24 carcasses and 25 rectal samples, while E. coli O157:H7 was isolated from two carcasses and one rectal sample. Of the 49 samples positive for E. coli O157, 32 were from the rectal and carcass samples of the same animal, while two E. coli O157:H7 isolates were obtained from rectal swabs and carcasses of the same animal. The stx1 and stx2 genes were both detected in 35 E. coli O157 isolates and one E. coli O157:H7 isolate, but the stx2 gene was only detected alone in two E. coli O157 isolates. Overall, 16 carcasses tested positive for E. coli O157 and one carcass tested positive for E. coli O157:H7 based on both carcass and rectal samples. Overall, the results of this study indicate that cattle carcasses pose a potential risk to human health due to contamination by E. coli O157 and E. coli O157:H7 in the feces.

식중독 세균 검출에 있어서 리포좀의 이용 가능성

김명희,김왕준,신원선,손동화,차성관 한국축산식품학회 2003 한국축산식품학회지 Vol.23 No.3

식중독 세균 검출에 있어서 리포좀의 이용 가능성을 병원성 식중독 세균인 E. coli O157:H7을 대상으로 검토하였다. 리포좀의 표면에 E. coli O157:H7을 인식하는 항체를 공유결합시키고 리포좀의 내부 수용액상에는 형광 표지물질인 sulforhodamine B를 포집시켰다. 이렇게 합성된 면역리포좀이 진단시약으로써의 기능을 하는지 알아보기 위해 두 가지 분석 방법을 적용하였다. 첫번째 방법으로써, test-strip을 이용한 분석은 E. coli O157:H7의 존재 유무를 test-strip 상에 나타난 분석 신호을 육안으로 관찰하는 것으로써 E. coli O157:H7 존재시 분석 신호가 저하되는 것을 원리로하였다. 이 방법은 고가의 실험 장비가 필요하지 않아 현장적용성이 용이한 장점이 있다. 두번째 방법은, IMS 후 목표 세균에 결합되어 있는 리포좀을 파괴시켜 나오는 형광도의 세기를 측정하는 방법으로 이때는 형광도의 강도와 E. coli O157:H7 세균 수와 비례적 관계가 나타났다. 상기의 두 방법에서 얻은 결과는, 리포좀을 E. coli O157:H7 검출에 응용할 수 있는 가능성을 제시하며 추후에 식품 적용 실험이 요구된다. Feasibility tests on using liposomes for detecting food-borne pathogenic bacteria were studied with E. coli 0157:H7 as a model analyte. lmmunoliposomes, whose surface was conjugated with anti-E. coli 0157:H7 IgG and which encapsulated the marker dye, sulforhodamine B, were used for the detection label. Among the feasibility tests, the first test was to use a test-strip on which antibodies to anti-E. coli O157:H7 IgG were immobilized. In this format, immunoliposomes that did not bind to E. coli O157:H7 in sample were captured and then exhibited a visible signal which was inversely related with the number of E. coli O157:H7 in sample. The second test was a direct liposome assay followed by immunomagnetic separation. In this format, immunoliposomes which were bound to E. coli O157:H7 were lysed with detergent and produced a signal which was proportionally related with the number of E. coli O157:H7 in sample. The results from both formats indicate that liposomes can be utilized as a detection label.

Modified sorbitol MacConkey agar for the rapid isolation of Escherichia coli O157:H7

Jung, Byeong-yeal,Jung, Suk-chan,Lee, Na-kyung,Cho, Seong-kun,Cho, Dong-hee,Her, Moon,Yoon, Yong-dhuk,Kim, Bong-hwan The Korean Society of Veterinary Science 1999 大韓獸醫學會誌 Vol.39 No.4

Unlike most Escherichia coli strains, E coli O157 : H7 didn't ferment sorbitol within 24h of incubation and showed a negative reaction for $\beta$-glucuronidase. We developed a new medium for the rapid isolation of E coli O157 : H7 using sorbitol MacConkey agar with cefixime, potassium tellurite and 4-methylumbelliferyl-${\beta}$-D-glucuronide (MUG) as a primary plating medium. The addition of $20{\mu}g/ml$ of vancomycin in enrichment broth for E coli O157 : H7 inhibited lots of Gram positive bacteria. Three strains (10.3%) of 29 non-O157 E coli strains and 3 strains (8.3%) of 36 Salmonella spp were inhibited at the $0.05{\mu}g/ml$ of cefixime and 23 strains (79.3%) of 29 non-O157 E coli strains and 12 strains (33.3%) of 36 Salmonella spp were inhibited at the $2.0{\mu}g/ml$ of potassium tellurite. But none of the E coli O157 : H7 was affected at these concentration. The addition of MUG at $100{\mu}g/ml$ level to sorbitol MacConkey agar with cefixime and potassium tellurite (CTM-SMAC) aided in the rapid isolation of E coli O157 : H7 from samples by checking sorbitol-negative and $\beta$-glucuronidase negative phenotypes simultaneously. In conclusion, inoculation of a positive in the O157 screening test from enrichment broth on CTM-SMAC appeared to be a rapid, cost-effective and sensitive method for the isolation of E coli O157 : H7.

Development of a multiplex-PCR for the rapid detection of Escherichia coli O157:H7 from raw beef

정석찬,정병열,윤장원,조윤상,김종염,박용호,Jung, Suk-chan,Jung, Byeong-yeal,Yoon, Jang-won,Cho, Yun-sang,Kim, Jong-yeom,Park, Yong-ho The Korean Society of Veterinary Science 1998 大韓獸醫學會誌 Vol.38 No.1

Esherichia coli O157 : H7의 slt I, slt II, uid A 및 eaeA 4종 유전자를 동시에 검출하기 위한 multiplex PCR 기법을 확립하고 쇠고기중 직접 E coli O157 : H7 검출시험을 실시하였다. 4 set의 primers를 이용한 multiplex PCR 기법으로 31종의 장내세균에 대한 특이성을 조사한 결과 E coli O157 : H7 에서 1,087bp (eae A), 584bp (slt II), 348bp (slt I) 또는 252bp (uid A)크기의 DNA를 동시에 특이적으로 검출할 수 있었다. E coli O157 : H7 15주는 모두 uid A 및 eae A 유전자가 동시에 검출되었고, 다른 장내세균에서는 검출되지 않았다. slt I 또는 slt II 유전자를 가지고 있는 E coli 표준균주 24종을 이용하여 multiplex PCR 기법과 Vero cell cytotoxicity assay을 비교검사한 결과 베로톡신 산생능과 PCR법의 결과는 일치하였다. mutiplex PCR 기법의 쇠고기중 검출한계는 modified EC(mEC)에서 증균없이는 E coli O157 : H7균 $10^4cells/g$ 이상에서 검출이 가능하였으나 mEC에 1차 증균후 modified TSB 증균하였을 경우에는 10cells/g이하까지도 검출이 가능하였다. 개발된 multiplex PCR 기법을 쇠고기 40종에 직접 적용한 결과 E coli O157 : H7은 검출되지 않았으나 slt I 및 slt II유전자를 가지고 있는 E coli 4종이 검출되었으며, 이들의 혈청형은 O6, O112, O115 및 O139 였다. 이 연구에서 개발된 multiplex PCR은 쇠고기중 E coli O157 : H7을 신속하고 특이적으로 검출하는데 사용할 수 있을 것으로 사료된다.

Multiplex PCR을 이용한 장출혈성 대장균 O157:H7의 검출

엄용빈(Yong-Bin Eom),김종배(Jong-Bae Kim) 대한의생명과학회 1998 Biomedical Science Letters Vol.4 No.1

최근 전세계적으로 문제가 되고 있는 장출혈성 대장균 O157:H7을 분리배양 및 동정없이 바로 시료를 분석하여 신속하게 검출하기 위한 다중 중합효소 연쇄반응 (multiplex PCR) 기법을 확립하고, 이 기법을 이용하여 국내 분리 균주 중에서 SLT-ⅠㆍⅡ, eaeA, 60-MDa plasmid gene을 가지고 있는 대장균을 유전자 수준에서 검출하고자 하였다. 장출혈성 대장균 O157:H7이 가진 SLT-ⅠㆍⅡ, eaeA, 60-MDa plasmid 유전자들에 대한 특이 oligonucleotide primers (MKI'-MK2', NAEI9-NAE20, MFSIF-MFSIR)를 함께 동시에 반응 완충액에 넣어 다중 중합효소 연쇄반응을 시행한 결과 317bp (eaeA), 228bp (SLT-ⅠㆍⅡ), 167bp (60-MDa plasmid)의 PCR 증폭 DNA생성물을 표준균주 (E. coli ATCC 35150)에서는 확인할 수 있었지만, 기타 다른 병원성 장내세균 13균주에서는 band를 확인할 수 없었다. 한편 다중 중합효소 연쇄반응의 template DNA 추출 방법에 따른 PCR 결과를 비교하였다. 각각의 DNA 추출 방법 중 boiling lysis 방법이 신속하고 간편하여 장출혈성 대장균 O157:H7에 의한 식중독의 임상진단에 다중 중합효소 연쇄반응 (multiplex PCR) 적용하는 데에는 boiling lysis법을 이용하는 것이 가장 적합한 방법으로 확인되었다. A multiplex PCR method was designed by employing primers specific for the eaeA gene, conserved sequences of Shiga-like toxins (SLT-ⅠㆍⅡ), and the 60-MDa plasmid of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) 0157:H7 strain. A set of six synthetic oligonucleotide primers derived from sequences of the SLT-ⅠㆍⅡ, eaeA, and 60-MDa plasmid genes of E. coli O157:H7 were used in a multiplex PCR amplification procedure to detect these genes in the same enteric pathogens. In two enterohemorrhagic E. coli O157:H7 (ATCC 35150, ATCC 43894) reference strains, PCR products of 317bps (eaeA), 228bps (SLT-ⅠㆍⅡ), and 167bps (60-MDa plasmid) were successfully amplified simultaneously in a single reaction. However, the specific PCR products were not amplified in control strains of other enteric bacteria. The sensitivity of the multiplex PCR assay for detection of the SLT-ⅠㆍⅡ, eaeA, and 60-MDa plasmid genes of E. coli O157:H7 was found to be 2.5×10? of bacteria in diarrheal stool to amplify all three bands. The multiplex PCR technology will allow large-scale screening of many clinical specimens or contaminated foods, and will be a very useful method for the detection of a wide range of microorganisms present in the environment, including EHEC O157:H7 in various types of specimens. The multiplex PCR assay has the potential to be used as a specific and rapid method for clinical diagnosis of disease caused by EHEC O157:H7.