Microsatellite 개발 및 분석법에 대한 소개

윤영은,곽명해,유정남,이병윤 한국식물분류학회 2011 식물 분류학회지 Vol.41 No.4

The choice of molecular markers is the first step when selecting experimental plans in the field of population genetics. The popular molecular markers in population genetic studies are mainly allozyme, RAPD, RFLP, AFLP, microsatellite, SNP and ISSR. Among these, microsatellites are frequently found in nuclear, chloroplast and mitochondrial genome, showing a high level of polymorphism and nuclear microsatellites are codominant. Thus, it is a favorable molecular marker for population structure analyses and genetic diversity studies. Microsatellites are composed of tandem repeated 1~6 base pair nucleotide motifs and can be easily amplified by PCR reactions using locus specific primers. Because microsatellites have low cross-species transferability, however, they are only applicable between phylogenetically close species. In wild plants, the lack of genomic information and the high development cost of the microsatellite obstruct the wider use of microsatellites in plant population genetics research. In this review, we introduce the basis for microsatellite markers, the development process, and analytical methods as well as evolutionary models and their applications. In addition, possible genotyping errors which lead to erroneous conclusions are discussed. 분자 마커의 선택은 집단유전학의 연구방법을 결정하는 중요한 고려사항으로, 현재까지 동식물의 집단유전학 연구에는 알로자임, RAPD, RFLP, AFLP, microsatellite, SNP, ISSR 등이 개발되어 주로 사용되고 있다. 이 중 microsatellite는 핵뿐만 아니라 엽록체, 미토콘드리아와 같은 세포소기관의 게놈상에 매우 풍부하게 존재하며, 핵에서 유래된 microsatellite는 높은 다형성을 보이는 공우성 마커로 집단 구조 및 유전적 다양성 연구에서 최근 선호된다. Microsatellite는 보통 1~6 bp의 짧은 서열이 반복된 것으로 각각의 유전자좌에 특화된 프라이머를 사용하여 증폭한다. Microsatellite는 PCR 반응으로 쉽게 유전자형을 분석할 수 있는 장점이 있으나, 종 특이적으로 개발되고 계통적으로 매우 가까운 근연종에게만 적용될 수 있는 단점이 있다. 따라서, 야생식물의 경우 microsatellite 개발에 필요한 게놈 정보가 부족하고 신규 개발비용이 많이 소요되어 적용이 쉽지 않았으나,점차 개발비용이 낮아지고 있어, 야생식물을 대상으로 한 microsatellite 연구들이 증가하고 있는 추세이다. 따라서, 본 논문에서는 야생식물의 microsatellite를 이용한 분석 기초를 마련하고자 microsatellite 마커의 다양한 개발 및 분석 방법, 진화 모델 및 적용 분야에 대해 소개하고, 유전자형 결정시 잘못된 결론을 도출할 가능성이 높은 부분에 대한 사항들을 지적하여 야생식물의 microsatellite를 이용한 집단유전학적 분석에 도움을 주고자 하였다.

Carcinoma Microsatellite Instability Status as a Predictor of Benefit from Fluorouracil-Based Adjuvant Chemotherapy for Stage II Rectal Cancer

Yang, Liu,Sun, Yan,Huang, Xin-En,Yu, Dong-Sheng,Zhou, Jian-Nong,Zhou, Xin,Li, Dong-Zheng,Guan, Xin Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 2015 Asian Pacific journal of cancer prevention Vol.16 No.4

Purpose: Rectal cancers with high microsatellite-instable have clinical and pathological features that differentiate them from microsatellite-stable or low-frequency carcinomas, which was studied rarely in stage II rectal cancer, promoting the present investigation of the usefulness of microsatellite-instability status as a predictor of the benefit of adjuvant chemotherapy with fluorouracil in stage II rectal cancer. Patients and Methods: Data of 460 patients who underwent primary anterior resection with a double stapling technique for rectal carcinoma at a single institution from 2008 to 2012 were retrospectively collected. All patients experienced a total mesorectal excision (TME) operation. Survival analysis were analyzed using the Cox regression method. Results: Five-year rate of disease-free survival (DFS) was noted in 390 (84.8%) of 460 patients with stage II rectal cancer. Of 460 tissue specimens, 97 (21.1%) exhibited high-frequency microsatellite instability. Median age of the patients was 65 (50-71) and 185 (40.2%) were male. After univariate and multivariate analysis, microsatellite instability (p= 0.001), female sex (p<0.05) and fluorouracil-based adjuvant chemotherapy (p<0.001), the 3 factors were attributed to a favorable survival status independently. Among 201 patients who did not receive adjuvant chemotherapy, those cancers displaying high-frequency microsatellite instability had a better 5-year rate of DFS than tumors exhibiting microsatellite stability or low-frequency instability (HR, 13.61 [95% CI, 1.88 to 99.28]; p= 0.010), while in 259 patients who received adjuvant chemotherapy, there was no DFS difference between the two groups (p= 0.145). Furthermore, patients exhibiting microsatellite stability or low-frequency instability who received adjuvant chemotherapy had a better 5-year rate of DFS than patients did not (HR, 5.16 [95% CI, 2.90 to 9.18]; p<0.001), while patients exhibiting high-frequency microsatellite instability were not connected with increased DFS (p= 0.696). It was implied that female patients had better survival than male. Conclusion: Survival status after anterior resection of rectal carcinoma is related to the microsatellite instability status, adjuvant chemotherapy and gender. Fluorouracil-based adjuvant chemotherapy benefits patients of stage II rectal cancer with microsatellite-stable or low microsatellite-instable, but not those with high microsatellite-instable. Additionally, free of adjuvant chemotherapy, carcinomas with high microsatellite-instable have a better 5-year rate of DFS than those with microsatellite-stable or low microsatellite-instable, and female patients have a better survival as well.

차세대 염기서열 분석을 이용한 굴참나무(Quercus variabilis)의 microsatellite 마커 개발 및 특성 분석

백승훈 ( Seung Hoon Baek ),이제완 ( Jei Wan Lee ),홍경낙 ( Kyung Nak Hong ),이석우 ( Seok Woo Lee ),안지영 ( Ji Young Ahn ),이민우 ( Min Woo Lee ) 한국임학회 2016 한국산림과학회지 Vol.105 No.2

본 연구는 차세대 염기서열 분석방법을 이용하여 굴참나무의 microsatellite 마커를 개발하고 특성을 분석하기 위해 수행되었다. GS-FLX Titanium 차세대 염기서열 분석 장비를 이용하여 305,771개의 read를 얻었고, 117 Mbp의 데이터를 생산하였다. De novo assembly를 통하여 7,326개의 contig를 확보하였다. 크기가 500 bp 이상이 되는 contig는 2,921개로 나타났다. 그 중 microsatellite 영역을 포함하는 contig는 606개(20.75%)로 나타났으며, 총 microsatellite의 수는 911개로 확인되었다. 그 중 13개의 microsatellite 유전자좌에서 굴참나무 개체 간 다형성이 관찰 되었다. 이들 microsatellite 유전자좌에 대하여 주왕산 집단에서 관찰된 유효 대립유전자수(Ae)는 평균 4.966(2.439~7.515) 로 나타났다. 평균 이형접합도 관측치(Ho)와 평균 이형접합도 기대치(He)는 각각 0.873(0.731~1.000)과 0.766(0.590~0.867) 으로 나타났다. 다형성이 관찰된 모든 microsatellite 유전자좌에서 null 대립유전자는 관찰되지 않았으며, 마커 간 연 관불평형은 나타나지 않았다. 따라서 본 연구에서 개발된 13개의 microsatellite 마커는 굴참나무 집단의 유전변이 분 석에 유용할 것으로 사료된다. This study was conducted to develop microsatellite markers in Quercus variabilis using next generation sequencing. A total of 305,771 reads (384 bp on average) were generated on a Roche GS-FLX system, yielding 117 Mbp of sequences. The de novo assembly resulted in 7,346 contigs. A total of 606 contigs (20.75%) including 911 microsatellite loci were derived from the 2,921 contigs longer than 500 bp. A total of 180 primer sets were designed from the 911 microsatellite loci and screened in eight Q. variabilis individual trees sampled from a natural stand to obtain polymorphic loci. As a result, a total of thirteen polymorphic microsatellite loci were selected and used for estimating population genetic parameters in the 54 individual trees. The mean number of effective alleles was 4.996 ranging from 2.439 to 7.515. The observed heterozygosity and the expected heterozygosity ranged between 0.731 and 1.000 with an average of 0.873 and from 0.590 to 0.867 with an average of 0.766, respectively. Null alleles were not detected in all loci. No significant linkage disequilibrium was detected after Bonferroni correction in all loci. In the near future, these novel polymorphic microsatellite markers will be used to study population and conservation genetics of Q. variabilis of Korea in more detail.

재래돼지(Korea Native Pigs) 특이 genetic marker와 육질 연관성 분석

김철욱,여정수,조광근,진상근,오명곤,박준규,권은정,홍연희,김지현,이보경,박다혜,김재우,이지홍 한국동물자원과학회 2001 한국축산학회지 Vol.43 No.6

본 연구는 재래돼지 특이적인 marker를 개발하고 이들 marker와 육질과의 연관성을 규명하기 위하여 실시하였다. 실험동물로 재래돼지와 랜드레이스 각각 30두씩 총 60두를 사용하였으며, 품종 특이 marker를 찾기 위하여 4번과 7번 염색체에 존재하는 총 60개의 microsatellite를 이용하여 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하였다. PCR 증폭은 형광물질 Fam과 Hex, Ned로 표지된 한쌍의 microsatellite primer를 이용하였으며, 형광물질로 표식된 PCR 산물은 Genetic Analyzer ABI 310으로 전기영동하여 대립 유전자를 규명하고 통계 분석하였다. 대립 유전자에 대한 통계 분석 결과 총 60개의 microsatellite중 27개가 다양한 유전적 다형현상을 보이는 대립 유전자가 증폭되었으며 (p<0.05), 특히 SW1364와 SW445, SW1369, SWR773 microsatellite의 증폭 산물에서 재래돼지와 랜드레이스 두 품종간을 구분할 수 있는 품종 특이적인 대립 유전자를 확인하였다 (p<0.01). 또한 육질에 영향을 미치는 유전적 marker를 얻기 위해 60두 전체에 대한 육색, 지방색, 지방산 조성, 콜레스테롤 함량, 연도와 경도에 대한 육질 분석을 실시하여 육질 형질과 marker와의 연관성을 분석한 결과 육질 형질에 영향을 미치는 28개 marker를 확인하였으며, 육색과 지방색에 연관된 4개, 조직감과 연관된 10개의 marker를 확인하였다. 이렇게 선발된 marker들은 고급육 생산을 위한 돼지의 유전적 개량을 위하여 유용하게 이용될 수 있다. This study was conducted to develop Korean native pig-specific DNA markers and analyze its relativity with meat quality using 30 of Korean native pigs and Landraces, respectively. To find species-specific DNA markers, we selected and tested a total of 60 microsatellite markers on the 4 and 7 chromosome using polymerase chain reaction (PCR). PCR amplification was carried out by microsatellite primer pairs labeled with fluorescent Fam, Hex and Ned. The fluorescent labeled PCR products were electrophoresed with Genetic Analyzer ABI 310 followed by the allelic and statistical analysis. According to the allelic frequency annalysis, of the 60 microsatellite markers 27 were preduced with a variety of genetic polymorphic alleles (p<0.05). Especially, alleles of SW1364, SW445, SW1369 and SWR773 microsatellite markers were identified to be species-specific markers between two breeds (p<0.01). To analyze the meat quality we determined the meat color, fat color, fat composition, cholesterol contents and hardness, and compared these characteristics with the alleles of 36 species-specific markers in all pigs. Of the 60 microsatellite markers 28 were found to be related with meat quality; 18 for meat and fat color, 7 for fatty acid, 4 for cholesterol contents and 10 for shear force and hardness. These selected markers will be useful in the genetic improvement of pigs for an excellent meat quality.

각질가시세포종에서의 이형접합성소실과 Microsatellite의 불안정성에 대한 분석

하태원(Tae-Won Ha),한기환(Ki-Hwan Han),김대광(Dae-Kwang Kim) 대한해부학회 2005 Anatomy & Cell Biology Vol.38 No.1

유전성비살버섯증잘록창자곧창자암(hereditary non-polyposis colorectal cancer)과 일부 Muir-Torre 증후군에서는 DNA부조화복구유전자 (DNA mismatch repair gene)의 돌연변이로 microsatellite 불안정성(microsatellite instability, MIS)이라는 유전자의 불안정성이 나타난다. 각질가시세포종은 형태학적으로 피부의 편평세포암종과 유사하지만 수개월간의 빠른 성장이후 완전히 소실되는 양성 종양이다. Muir-Torre 증후군 환자에서 발생한 각질가시세포종에서 MIS가 발견되어 각질가시세포종의 발생에 DNA부조화복구유전자의 이상이 중요한 역할을 할 것으로 추정되었다. 산발성각질가시세포종의 발병기전으로서 MIS와 이형접합성소실(loss of heterozygosity, LOH)의 관여 여부를 알아보기 위하여 10명의 산발성각질가시세포종 환자를 대상으로 11개의 microsatellite 표지 (D2S286, D2S367, D3S1317, D5S346, D9S160, D9S171, D10S89, D10S185, D11S904, D17S261 및 D17S520)에서 MIS과 LOH를 조사해 보았다. MIS과 LOH는 D17S261과 D10S185 표지에서 각각 1례씩 발견되었다. 결론적으로 산발성각질가시세포종에서 MIS과 LOH는 각각 10% (1/10)의 낮은 빈도로 나타나서 MIS와 LOH는 산발성각질가시세포종의 발병기전으로 큰 역할을 하지 않는 것으로 생각된다. Tumors from patients with hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) and from a subset of patients with the related Muir-Torre syndrome exhibit a type of a genetic instability, known as microsatellite instability (MIS), which results from mutations that inactivate DNA mismatch repair genes. Keratoacanthomas resemble squamous cell carcinoma but after a period of rapid growth over a few months they involute completely. The detection of MIS in a keratoacanthoma from a patient with Muir-Torre syndrome suggested that defective mismatch repair genes may play a role in the pathogenesis of these neoplasmas. In order to elucidate the significance of both MIS and loss of heterozygosity (LOH) in the pathogenesis of sporadic keratoacanthomas, the presents of MIS and LOH at 11 microsatellite markers (D2S286, D2S367, D3S1317, D5S346, D9S16, D9S171, D10S89, D10S185, D11S904, D17S261, and D17S520) were evaluated in randomly selected sporadic keratoacanthomas. MIS and LOH were found only in 1 of 10 cases at D17S261 and D10S185, respectively. In conclusion, the low frequency of MIS and LOH detected in this study suggests that neither MIS nor LOH appear to be significant in the induction of sporadic keratoacanthomas.

인삼 (Panax ginseng C.A. Meyer)의 Microsatellite 마커에 대한 유전적 다형성과 특성 규명

박선화(Sun Wha Park),현영세(Young Se Hyun),정기화(Ki Wha Chung) 고려인삼학회 2009 Journal of Ginseng Research Vol.33 No.3

인삼에 대한 microsatellite 개발은 다른 분자적 마커들에 비해 늦게 이루어져, 최근에 와서야 인삼의 microsatellite 들이 보고되고 있는 실정이다. 본 연구에서는, 분리된 microsatellite들 중에서 5 개의 다형성 마커를 선별하여 국내 경작지나 시장에서 유통되는 인삼을 대상으로 유전적 다형성을 조사하고, 각 마커의 특성을 규명하였다. 유전자형 분석은 변성 PAGE와 silver staining법으로 하거나 형광표지 primer로 표지한 PCR 산물을 자동 염기서열 분석기로 분석하였다. 본 연구에서 개발한 5개의 microsatellite 마커들의 평균 대립유전자 수는 3.2 개였으며, 평균 GD는 0.367 였다. 전체적으로 볼 때, PG1419가 가장 높은 다형성을 보였으며 (PIC: 0.460, GD: 0.543), PG770은 가장 낮은 다형성을 나타내었다 (PIC: 0.070, GD: 0.078). 각 좌위들의 예상 이형 접합도 (Hexp)는 0.077에서 0.541 (mean = 0.313)로 계산되었으나, 관측 이형접합도 (Hobs)는 0.040에서 0.130 (mean = 0.083)으로 훨씬 낮게 관찰되었으며, 유전자형의 분포는 Hardy-Weinberg 평형상태에서 벗어남을 보였다. 본 연구에서 개발한 인삼의 microsatellite 마커들은 인삼의 분자적 마커의 데이터베이스 확립의 기초 자료로 활용될 뿐 아니라, 인삼의 분자적 구별법 및 QTL 좌위의 염색체지도 작성에 유용하게 활용될 것이다. Ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer) is one of the most important medicinal plants in East Asia. Microsatellite or simple sequence repeat (SSR) markers are used in obtaining genetic analysis and authentication in many plants. The present study examined five microsatellites in conjunction with P. ginseng in Korea. The total observed allelic number was 17 (mean = 3.4), and gene diversities varied from 0.078 to 0.543 with an average of 0.314. Through a combined analysis of five loci in 100 ginseng samples, 44 different combined genotypes were observed. Expected and observed heterozygosites ranged from 0.077 to 0.541 (mean = 0.313) and 0.040 to 0.130 (0.083), respectively. All examined loci exhibited deficiency of heterozygosity and deviation from the Hardy-Weinberg equilibrium. Such results may be explained by the non-random mating and inbreeding that has occurred for several hundred years. These microsatellite markers could be used for the study of molecular genetics and the establishment of DNA marker database, as well as authentication of ginseng species and chromosomal mapping of QTL loci in P. ginseng.

Identification of New Microsatellite DNAs in the Chromosomal DNA of the Korean Cattle (Hanwoo)

Kim, J.W.,Hong, J.M.,Lee, Y.S.,Chae, S.H.,Choi, C.B.,Choi, I.H.,Yeo, J.S. Asian Australasian Association of Animal Productio 2004 Animal Bioscience Vol.17 No.10

To isolate the microsatellites from the chromosomal DNA of the Korean cattle (Hanwoo) and to use those for the genetic selection, four bacteriophage genomic libraries containing the chromosomal DNA of six Hanwoo steers showing the differences in meat quality and quantity were used. Screening of the genomic libraries using $^{32}P-radiolabeled 5'-({CA})_{12}-3$nucleotide as a probe, resulted in isolation of about 3,000 positive candidate bacteriophage clones that contain $(CA)_n$-type dinucleotide microsatellites. After confirming the presence of microsatellite in each positive candidate clone by Southern blot analysis, the DNA fragments that include microsatellite and flanking sequences possessing less than 2 kb in size, were subcloned into plasmid vector. Results from the analysis of microsatellite length polymorphism, using twenty-two PCR primers designed from flanking region of each microsatellite DNA, demonstrated that 208 and 210 alleles of HW-YU-MS#3 were closely related to the economic traits such as marbling score, daily gain, backfat thickness and M. longissimus dorsi area in Hanwoo. Interestingly, HW-YU-MS#3 microsatellite was localized in bovine chromosome 17 on which QTLs related to regulation of the body fat content and muscle ypertrophy locus are previously known to exist. Taken together, the results from the present study suggest the possible use of the two alleles as a DNA marker related to economic trait to select the Hanwoo in the future.

한국인집단의 3p (D3S1228, D3S1029, D3S1038 및 THRB)와 9p (IFNA, D9S171, D9S126 및 D9S169)의 Microsatellite 다형현상

안광숙 대전대학교 기초과학연구소 1999 自然科學 Vol.10 No.2

한국인을 대상으로 3번과 9번 염색체의 단완에 있는 8가지 유전자좌(D3S1228, D3S1029, D3S1038, THRB, IFNA, D9S171, D9S126, 및 D9S169)에서 polymerase chain reaction 과 polyacrylamide gel electrophoresis 방법을 이용하여 microsatellite의 다형현상을 분석하였다. 각 유전자좌에서 발견된 대립인자의 수는 3개 (D9S126) 내지 9개 (D3S1029)가 관찰되었으며, 각 유전자좌에 따라 산출된 heterozygosity 빈도는 0.17 (D9S126) 에서 0.73 (D9A169)의 범위에 속하여 매우 polymorphic 한 것을 알 수 있었다. 본 연구에서 사용한 microsatellite marker는 유전적으로 매우 다양함에 따라 유전적 지표로서 친자확인, 개인동정, 유전자 지도작성에 널리 이용될 수 있음을 확인하였다. In Korean population, we analyzed the polymorphism of microsatellite at 3p(D3S1228, D3S1029, D3S1038, THRB) and 9p (IFNA, D9S171, D9S126, D9S169) by the use of polymerase chain reaction and polyacrylamide gel electrophoresis. The number of alleles at locus were range from 3 (D9S126) to 9 (D3S1029) and the frequencies of heterozygosity were from 0.17 (D9S126) to 0.73 (D9A169) with a mean value of 0.50. In the present study, 8 loci were high polymorphic and had genetic variation. This result suggests that microsatellite markets used in this study are very useful as genetic markers for parentage testing, forensic identification, and medical diagnostics.

A core set of microsatellite loci for yellow‑throated marten, Martes flavigula: a case of inferences of family relationships

이선미,문희창,전혜숙,송의근,우동걸,안정화,이무영 한국유전학회 2019 Genes & Genomics Vol.41 No.12

Background Microsatellite markers are an ideal molecular marker for population genetic studies such as population structure, pedigree, and kinship. The yellow-throated marten (Martes flavigula) is widely distributed in coniferous and deciduous forests of eastern Asia and plays the role of an indicator and umbrella species in South Korea, given the absence of top predators such as tiger and leopard. Objective The aim of our study was to establish a core set of microsatellite markers that could be used for a population genetics study on M. flavigula. Methods We characterized 21 di-motif microsatellites for M. flavigula by Illumina next-generation sequencing. We evaluated them for a population genetics study against five established criteria together with 33 previously developed microsatellites. We calculated relatedness values between individual yellow-throated martens in two groups that were suspected to be siblings using the selected core set of markers to confirm applicability. Results Twenty-three loci were determined as the core set of microsatellite markers. The probability of identity P(ID) and probability of identity between siblings P(ID)sib of the core set was estimated as 2− 15 and 2.2−7, respectively. Relatedness values between individuals in the two groups of M. flavigula revealed that one of the pairs was sisters, confirming that the core set can be applied to kinship studies. Conclusion The developed microsatellite core set in this study is expected to contribute to studies on molecular ecology and population structure of M. flavigula.

홍해삼 유전체 분석에 의한 microsatellite의 분포도 연구

이태욱,김삼웅,김정선,지원재,방우영,김장현,양철웅,방규호,갈상완 한국생명과학회 2022 생명과학회지 Vol.32 No.9

본 연구는 홍해삼의 유전체를 분석하여 홍해삼의 유전자 마커 개발을 위한 기초 자료로 활용하기 위해 수행되었다. 울릉도_일반과 울릉도_토착으로 microsatellite marker 분석을 실시하였다. 그 결과 dinucleotide repeat 서열이 81.3~81.4%로 가장 많이 차지 되었으며, 반복서열 개수가 증가될수록 감소되는 경향을 보였다. 일반적으로 microsatellite는 5~10 반복수 사이에 집중적으로 존재하였으며, 반복 서열의 크기가 클수록 반복수가 적어지는 양상을 보였다. Di, tri, tetra-nucleotides 반복에서 각각 (AT)5, (AAT)5, (AAAT)5 등이 가장 높은 것들로 나타났다. (CG), (CCG) 등은 동일 반복 단위의 다른 반복 단위에 비교하여 매우 낮게 관찰되었다. Di-와 tri-nucleotide는 반복수가 각각 35와 32까지 지속적으로 나타난 다음에 비연속적으로 44와 43 반복까지 계수 되었다. Tetra-, penta- 및 hexa-nucleotide는 각각 25, 21 및 14까지 연속적으로 나타났다. 본 분석결과에 따르면 microsatellite는 특이서열반복에 대해 편중되는 경향성을 보이는 것으로 나타났다. 따라서 홍해삼의 microsatellite 분석에서 고유의 반복 서열과 반복수를 유지하는 것으로 추정되므로 향후 연구를 위한 기초 자료로 활용하는 것이 가능할 것으로 판단된다.