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돼지 체세포의 조건이 핵이식 수정란의 체외발달에 미치는 영향
박희성 진주산업대학교 농업기술연구소 2002 農業技術硏究所報 Vol.15 No.-
본 연구는 복제 돼지의 생산성 향상과 형질전환에 의한 대체장기용 복제 돼지 생산에 기여하기 위한 기초연구로 공여세포의 조건, 핵이식 수정란의 융합 및 활성화, 복제수정란의 체외발달에 미치는 각종 요인들을 조사하였다. 공여세포는 생후 10개월 된 Landrace 종으로부터 귀 세포조직(5×5mm)을 채취하여 0.05%의 trypsin과 EDTA가 첨가된 D-PBS 로 세포를 분리하여 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액으로 계대배양을 실시하여 사용하였다. 핵이식은 laser system으로 투명대를 drilling 하여 수핵난자의 극체와 핵을 제거한 후 공여세포를 주입하였으며, 핵이식란은 DC 1.9kv/cm, 30μsec 1회의 전기자극으로 융합과 1시간 후 AC 1.50kv/cm, 30μsec 1회의 조건으로 활성화를 실시하여 핵이식란을 분할을 유도하였다. 분할이 이루어진 핵이식 수정란은 10% FBS가 첨가된 NCSU-23 배양액으로 CO2 배양기에서 6∼8일 동안 체외배양을 실시하여 배반포기로 발달한 복제수정란을 Hoechst 33342로 핵염색을 하여 할구수를 조사하였다. 공여세포의 기아배양을 3∼4 및 5∼6 일간 실시하여 핵이식 후 전기자극으로 융합을 실시하였을 때 융합율은 45.6 및 36.8%로써 기아배양 기간에 따른 유의적인 차이는 없었다. 융합 및 활성화가 유도된 핵이식란의 분할율은 3∼4일간 기아배양을 실시한 공여세포가 67.1%로써 가장 높게 나타났으며(P<0.05), 5∼6일간 기아배양을 실시한 공여세포의 57.1%와는 유의적인 차이가 없었다. 공여세포를 1∼2, 5∼6 및 13∼14대 계대배양한 것을 사용하여 핵이식 후 전기자극으로 융합을 실시하였을 때 융합율은 52.7, 53.0 및 51.7%로써 계대배양에 따른 유의적인 차이가 없었다. 융합이 이루어진 핵이식란을 융합 후 1시간 뒤에 전기자극에 의한 활성화를 유도했을 때 1∼2, 5∼6 및 13∼14대 계대배양한 공여세포의 분할율도 42.7, 46.8 및 45.5% 로써 유의적인 차이가 없었다. 25μm≥ 크기의 공여세포를 사용하였을 때 핵이식란의 융합율은 65.3%로써 25∼30μm 및 30μm≤ 크기 공여세포의 융합율 42.5 및 45.5% 보다는 유의적(P<0.05)으로 높게 나타났다. 융합과 활성화가 유기된 핵이식란의 분할율은 25μm≥, 25∼30μm 및 30μm≤ 크기에서 각각 56.5, 68.8 및 58.5%로써 공여세포의 크기에 따른 분할율은 유의적인 차이가 없었다. 체외수정란과 체세포 핵이식 수정란의 발달에 있어서는 분할율이 각각 80.1% 와 64.0%로써 핵이식 수정란이 체외수정란 보다 낮았으나, 배반포기로의 발달율에 있어서는 12.4%와 10.5%로써 차이가 없었다. 배반포기 수정란의 할구수는 체외수정란이 28.5 ±2.8 개로써 핵이식 수정란과 단위발생란의 18.6 ±2.1 및 16.0 ±4.0 개보다 유의적(P<0.05)으로 많았다. 이상의 결과를 볼 때 공여세포의 기아배양기간은 3∼6일 정도 실시한 후에 핵이식에 사용하는 것이 융합율과 분할율을 높이는데 바람직하고, 공여세포의 크기는 20∼30μm가 적합하며, 복제 수정란의 발달율을 높이기 위해서는 적정 공여세포의 조건, 융합 및 활성화방법, 배양액 조건 등의 확립이 이루어져야 할 것으로 생각된다. This study was conducted to examine in vitro developmental ability of porcine embryos after somatic cell nuclear transfer. The porcine ear cell was cultured in vitro for confluency in serum-starvation condition(TCM-199 + 0.5% FBS) for 3∼6 days of cell confluency. The zonae pellucidae of IVM oocytes were partially drilled using laser system. Single somatic cell was individually transferred into enucleated oocytes. And the reconstructed embryos were electrically fused(single DC 1.9kv/cm, 30μsec) with 0.3M mannitol. After electrofusion, embryos were activated(single AC 5v/mm, 5sec) and cultured in NCSU-23 medium containing 10% FBS at 39℃, 5% CO2 in air for 6 to 8 days. The fusion rate of donor cells was 45.6%, 36.8% and 46.1% in 3∼4, 5∼6 days of serum starvation and non serum starvation(N-S), and were 52.7%, 53.0% and 51.7% in 1∼2, 5∼6 and 13∼14 passages of donor cell culture, respectively. No significant difference was found in the fusion rate of donor cells by the duration of serum starvation treatment or the number of donor cell passages. By the size of donor cells, however, the fusion rate was significantly higher(P<0.05) for reconstructed embryos derived from 25㎛≥ size of donor cells (65.3%) than that of 25∼30㎛(42.5%) or 30㎛(45.5%)≤ cells. The cleavage rate was significantly(P<0.05) higher in 3∼4 days of serum starvation treatment(67.1%) than that in N-S(50.7%) or 5∼6 days of starvation(57.1%). The activation rate by the size of donor cells in fused oocytes was 56.5%, 68.8% and 58.5%, respectively, and was not significant. The developmental rate to blastocyst in nuclear transplanted embryos(10.5%) using somatic cell was similar to IVF embryos(12.4%). The mean number of cells at blastocyst stage was fewer(P<0.05) in nuclear transferred embryos(18.6±2.1 nuclei) than those of in vitro fertilized embryos(28.5±2.8 nuclei). These results suggest that the developmental potential of nuclear transplanted embryos in vitro depends, in part, on suitable culture time and size of donor somatic cells.
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체외배양액의 삼투압 조절과 Alanine/Glycine이 돼지 단위발생 및 체세포 핵이식 난자의 배 발육에 미치는 영향
오나랑,신혜지,이주형,이은송 한국수정란이식학회 2017 한국수정란이식학회 학술대회 Vol.2017 No.05
돼지 난자의 체외배양 과정에서 배양액의 삼투압의 차이 및 glycine과 alanine 단독 또는 병행 첨 가가 단위발생 및 체세포 핵이식 난자의 배 발육에 미치는 영향을 검토하였다. 난자 의 체외성숙 에는 10% 돼지 난포액, cysteine, pyruvate, epidermal growth factor, kanamycin, insulin이 첨가된 TCM-199을 이용하였다. 체외성숙 42∼44시간 후 제1극체가 방출된 난자만을 선별하여 단위발생 및 체세포 핵이식 난자를 생산한 후 modified porcine zygote medium (mPZM)-3 배양액에서 7일간 배양하였다. 실험 설계에 따라 체외배양 7일 또는 체외배양 초기 48시간 동안 280 또는 320 mOsm의 삼투압에서 난자를 배양하였다. 실험1에서 체외배양 7일 동안 280 또는 320 mOsm의 배 양액 내 glycine 또는 alanine 첨가 효과를 검토한 결과 삼투압 차이에 따른 분할률 및 배반포 발달 률에는 차이를 보이지 않았으나 320 mOsm에서 배양된 난자 및 280 mOsm에 glycine을 첨가한 군 은 280 mOsm에서 배양된 난자에 비해 높은 배반포 세포수를 보였다 (36.5-38.0 vs. 31.1, P<0.05). 실험2에서는 체외배양 초기 48시간 동안 280 또는 320 mOsm의 삼투압에서 배양하였고, 그 후 280 mOsm 배양액으로 옮겨 5일간 추가로 배양하였다. 또한 체외배양액 내 4.1 mM glycine 첨가가 배 발육에 미치는 효과를 검토하였다. 단위발생 난자를 배양초기 48시간 동안 320 mOsm에서 glycine이 첨가된 배양액에서 배양한 군이 280 mOsm에서 배양한 군에 비해 유의적으로 높은 배반 포 발달율을 보였다(36.5-50.4% vs. 25.9-27.9%, P<0.05). 또한 배양 초기 48시간 동안 320 mOsm 배 양액에 glycine을 첨가하여 배양한 난자 (50.4%)가 다른 처리군의 난자(25.9-36.5%)에 비해 유의적 으로 높은 배반포 발달율을 보였다(P<0.05). 실험3에서는 실험2와 동일한 실험설계로 체세포 핵이 식으로 작성된 배반 포의 inner cell mass (ICM)와 trophectoderm (TE) 세포수를 조사하였다. 실험결과 초기 46시간 동안 glycine이 첨가된 320 mOsm 처리군에서 배양된 난자의 ICM 비율이(26.0%) 280 mOsm 삼투압에 glycine을 첨가한 군(17.8%)에 비해 유의적(P<0.05)으로 증가하였다. 본 연구결과 단위 생식 및 체세포 핵이식 난자의 체외배양에서 glycine의 첨가 및 체외 배양초기 48시간 동안 320 mOsm 삼투압 처리는 배 발육과 배반포 세포수를 증가시키는 것으로 확인되었다.
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복제 소 태반과 IVF 소 태반의 protein pattern 분석
김홍래,강재구,윤종택,성한우,조민래,박창식,진동일 한국발생생물학회 2003 한국발생생물학회 학술발표대회 Vol.2003 No.1
체세포 핵이식에 의한 복제기술은 매우 낮은 성공률 나타내고 있어 실용화에 지장을 초래하고 있다. 이것은 후생적인 유전현상인 reprogramming이 불완전하게 이루어지기 때문인 것으로 추측되어지고 있다(Reik et al., Theriogenology 2003, 59: 21-32; Han et al, Theriogenology 2003, 59: 33-44). 체세포 핵이식 후에 태아사망의 원인이 태반의 비정상적인 기능과 관계가 있는 것으로 추정되는데
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리프로그래밍 전사인자와 후생학적 변형에 관련된 억제제의 처리가 소 체세포 핵이식란의 발달에 미치는 영향
안진희,정희경,한덕우,김경운,정학재,박춘근,조수진,박진기,양병철 한국동물번식학회 2012 Reproductive & developmental biology Vol.36 No.2
체세포 핵이식은 형질전환 복제 동물 생산과 더불어 그에 따른 바이오 신약의 개발, 장기 생산 등 많은 장점이 있지만, 여전히 체세포 핵이식 동물의 생산성은 임신율이 낮고 비정상 적인 개체의 탄생 등의 문제점이 있다. 그 이유 중 하나로 핵이식에 사용되는 공여세포가 다시 수정란으로 돌아가는 과정에서 후생학적 역분화가 불완전하게 이루어지기 때문이다. 본 연구는 체세포가 유도만능 줄기세포로 역분화하는 과정에서 사용되는 리프로그래밍 전 사인자 (Oct4, Klf4, Sox2와 c-Myc, OKS-M)의 도입과 더불어, 후생학적 변형에 관련된 억 제제 trichostatin A(TSA), 5-aza-20-deoxycytidine(5-aza), GSK-3 inhibitor와 MEK inhibitor (2i)가 복제 수정란에 미치는 영향에 대해서 연구하였다. 젖소 귀 세포에 전사인자 Oct4, Klf4, Sox2와 c-Myc을 도입하였고, 배양 시간이 흐름에 따라 세포크기가 작아짐 (11.72± 3.39, 8.42±4.95, p<0.05)을 볼 수 있었으며, RT-PCR을 통하여 8개의 콜로니 중 4개의 콜 로니에서 외인성 유전자를 발견하였다. 리프로그래밍에 관련된 내인성 유전자의 활성을 증 가시키기 위하여 HDAC 억제제인 trichostatin A (20 nM), DNA methyltransferase 억제제인 5-aza-20-deoxycytidine (10 μM), 줄기세포 분화 경로 억제제인 GSK-3 (3 μM) and MEK (1 μM)를 처리하였다. 4개 중 1개의 콜로니에서 내인성 유전자의 활성이 증가됨을 발견하였 다. H3K9/K14의 acetylation 상태는 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나 체세포 핵이식의 분 할률에서는 somatic cells이 85.9±8.98%, OKS-M 처리군이 82.0±4.97%, OKS-M을 도입한 체세포에 TSA, 5-aza, 2i 처리군이 각각 88.4±7.89, 75.3±8.10, 74.2±2.90%로 OKS-M과 TSA를 함께 처리하였을 때 가장 높은 분할률을 보였고, 배반포와 상실배기 까지의 발달률 은 somatic cells이 9.6±3.79%, OKS-M 처리군이 12.6±6.54%, OKS-M을 도입한 체세포에 TSA, 5-aza, 2i를 처리하였을 때 각각 11.1±6.87, 20.1±5.89, 9.5±1.53%로 OKS-M과 5-aza 를 함께 처리하였을 때 유의적으로(p<0.05) 가장 높은 발달률을 보였다. 따라서 전사인자의 도입과 후생학적 변형과 관련된 억제제의 처리는 소 복제 수정란의 발달률 향상에 영향을 주는 것으로 나타남에 따라, 앞으로 다양한 억제제와 처리조건에 따 라 복제수정란의 향상을 위한 최적화된 방법을 유도할 필요가 있다.
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리프로그래밍 전사인자와 후생학적 변형에 관련된 억제제의 처리가 소 체세포 핵이식란의 발달에 미치는 영향
안진희,정희경,한덕우,김경운,정학재,박춘근,조수진,박진기,양병철 한국동물번식학회 2012 Reproductive & Developmental Biology(Supplement) Vol.36 No.2s
체세포 핵이식은 형질전환 복제 동물 생산과 더불어 그에 따른 바이오 신약의 개발, 장기 생산 등 많은 장점이 있지만, 여전히 체세포 핵이식 동물의 생산성은 임신율이 낮고 비정상 적인 개체의 탄생 등의 문제점이 있다. 그 이유 중 하나로 핵이식에 사용되는 공여세포가 다시 수정란으로 돌아가는 과정에서 후생학적 역분화가 불완전하게 이루어지기 때문이다. 본 연구는 체세포가 유도만능 줄기세포로 역분화하는 과정에서 사용되는 리프로그래밍 전 사인자 (Oct4, Klf4, Sox2와 c-Myc, OKS-M)의 도입과 더불어, 후생학적 변형에 관련된 억 제제 trichostatin A(TSA), 5-aza-20-deoxycytidine(5-aza), GSK-3 inhibitor와 MEK inhibitor (2i)가 복제 수정란에 미치는 영향에 대해서 연구하였다. 젖소 귀 세포에 전사인자 Oct4, Klf4, Sox2와 c-Myc을 도입하였고, 배양 시간이 흐름에 따라 세포크기가 작아짐 (11.72± 3.39, 8.42±4.95, p<0.05)을 볼 수 있었으며, RT-PCR을 통하여 8개의 콜로니 중 4개의 콜 로니에서 외인성 유전자를 발견하였다. 리프로그래밍에 관련된 내인성 유전자의 활성을 증 가시키기 위하여 HDAC 억제제인 trichostatin A (20 nM), DNA methyltransferase 억제제인 5-aza-20-deoxycytidine (10 μM), 줄기세포 분화 경로 억제제인 GSK-3 (3 μM) and MEK (1 μM)를 처리하였다. 4개 중 1개의 콜로니에서 내인성 유전자의 활성이 증가됨을 발견하였 다. H3K9/K14의 acetylation 상태는 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나 체세포 핵이식의 분 할률에서는 somatic cells이 85.9±8.98%, OKS-M 처리군이 82.0±4.97%, OKS-M을 도입한 체세포에 TSA, 5-aza, 2i 처리군이 각각 88.4±7.89, 75.3±8.10, 74.2±2.90%로 OKS-M과 TSA를 함께 처리하였을 때 가장 높은 분할률을 보였고, 배반포와 상실배기 까지의 발달률 은 somatic cells이 9.6±3.79%, OKS-M 처리군이 12.6±6.54%, OKS-M을 도입한 체세포에 TSA, 5-aza, 2i를 처리하였을 때 각각 11.1±6.87, 20.1±5.89, 9.5±1.53%로 OKS-M과 5- aza 를 함께 처리하였을 때 유의적으로(p<0.05) 가장 높은 발달률을 보였다. 따라서 전사인자의 도입과 후생학적 변형과 관련된 억제제의 처리는 소 복제 수정란의 발달률 향상에 영향을 주는 것으로 나타남에 따라, 앞으로 다양한 억제제와 처리조건에 따 라 복제수정란의 향상을 위한 최적화된 방법을 유도할 필요가 있다.
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정원상,김상헌,김혁,김영학,강정호,최윤영,이철범 대한흉부외과학회 2003 Journal of Chest Surgery (J Chest Surg) Vol.36 No.6
배경: 장기 심장 이식 후에 나타나는 거부반응의 정도와 상태에 대한 정확한 진단은 내심근 조직검사(endomyocardial biopsy)로 이루어지고 있으나, 이 방법은 환자에 침습적이고 보다 자주 시행하여 감시하기에는 부적합하여, 덜 침습적이고 계속 지속적으로 감시할 수 있는 방법을 찾고자 하였다. 대상 및 방법: 250~300 gm 정도의 백서에서 이소성의 심장이식(heterotopic heart transplantation)을 Ono- Lindsey Method로 시행한 후 1개월 후에 99mTc-pyrophosphate (PYP) 1.5 mCi를 꼬리 정맥을 통해 주입한 후 스캔(scan)을 시행하고 심장과 척추의 섭취비를 구하여 이식된 심장의 거부반응에 민감하게 반응할 수 있을 지에 대해 조직 검사와 비교관찰 하였다. 결과: 20마리의 이식된 심장에 99mTc-PYP 스캔에서의 심장/척추 섭취비와 조직 검사 결과를 분석하여 심장/척추 섭취비가 0.09 이상을 거부반응이 있는 것으로 판정하였을 때 20마리에서 진양성 3예, 진음성 12예, 가양성 3예, 가음성 2예로 예민도(Sensitivity) 60%, 특이도(Specificity) 80%의 결과를 얻었다. 결론: 이식된 장기의 거부반응이 장기이식의 예후에 미치는 중요한 원인이 되므로, 이에 대한 조기 진단할 수 있는 방법으로 99mTc-PYP스캔이 유용하였으며, 비침습적이고 간단한 검사방법이므로 거부반응 여부를 감시하는 데 도움이 될 것으로 판단된다.
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