공배양이 초기배아 발달에 미치는 효과에 있어 Leukemia Inhibitory Factor의 역할 규명에 관한 연구

이규섭(Kyu Sup Lee),김상우(Sang Woo Kim),나용진(Yong Jin Na),이영아(Young Ah Lee),김하정(Ha Jung Kim),장성규(Sung Kyu Jang) 대한산부인과학회 2000 Obstetrics & Gynecology Science Vol.43 No.7

목적 : LIF가 착상전 초기 생쥐배아의 발달에 미치는 영향을 이해하기 위하여 재조합 인간 LIF 에 대한 항체 및 재조합 인간 LIF를 이용하여 본 연구를 수행하였다. 연구방법 : 과배란 유도 후 얻은 ICR 계통의 생쥐 1-세포기 배아를 인간 난관상피세포와 96시간 동안 CO2 배양기 (37 ℃, 5% CO2)에서 공배양하고, 대조군으로 1-세포기 배아를 0.4% BSA 를 함유한 HTF 배양액에서 배양하였다. 다음으로 인간 난관상피세포와의 공배양군에 anti-LIF antibody를 각각 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng씩 농도를 달리하여 첨가하여 anti-LIF antibody가 첨가되지 않은 인간 난관상피세포와의 공배양군에서의 배양결과와 비교하였다. 또한 0.4% BSA 를 함유한 HTF 배양액에 rhLIF 를 각각 2000 U, 1000 U, 100 U, 10 U씩 농도를 달리하여 첨가하여 LIF 가 첨가되지 않은 단순 배양액에서의 배양결과와 비교관찰하였다. 결과 : 1. 배양액(0.4% BSA가 첨가된 HTF)단독으로 배양한 경우보다 인간난관 상피세포를 이용한 공배양의 경우 배아의 난할정도가 의미있게 높았다(p<0.05). 2. 재조합 인간 LIF 에 대한 항체를 난관상피세포와의 공배양에 첨가한 경우 첨가한 항체의 농도가 높을수록 4-세포기 이후로의 난할율이 낮아지는 것을 볼 수 있었으며(p<0.05), 첨가한 항체의 농도가 1 ng이상인 경우에는 2-세포기 이후로는 난할이 관찰되지 않았다. 3. 2-세포기 정지가 일어난 ICR 계통의 생쥐배아 배양시 재조합 인간 LIF 를 첨가한 경우와 배양액 단독으로 배양한 결과를 비교하여 보았을 때 양군 모두 4-세포기까지는 난할이 일어나는 것을 볼 수 있었으나, 그 이상의 분화는 일어나지 않았고, 재조합 인간 LIF를 첨가한 군에서 분화정도가 의미있게 높았다(p<0.05). 결론 : 이상의 결과로 볼 때 공배양 동안 인간난관 상피세포에서 분비되는 LIF 는 착상전 초기배아의 발달에 중요한 영향을 미치는 인자로 작용하나, 체외배양시에 재조합 인간 LIF 의 첨가만으로는 정상적인 배발생이 진행되지 않는 것으로 보아 공배양의 효과는 LIF 와 다른 인자와의 상호작용에 의해 나타나는 것으로 사료된다. 또한 재조합 인간 LIF 를 첨가한 배양액에서 2-세포기 억제가 극복되었다는 사실은 LIF 가 2-세포기 억제현상과 밀접한 관계가 있음을 시사하는 소견이라 생각된다. Objective : To assess the effect of recombinant human leukemia inhibitory factor on in vitro development of 1-cell ICR mouse embryo.Materials and Method : ICR mice were superovulated with PMSG/hCG and 1-cell stage mouse embryos were recruited. 1-cell mouse embryo were cocultured on human oviductal cells in a CO2 incubator (coculture group) and were cultured on 0.4% BSA+HTF media (control group). And anti-hLIF Ab was added to the cocultured group in a different concentration (1pg, 10pg, 100pg, 1ng) and developmental rate was compaired to the control group, and rhLIF was added to the preincubated 0.4% BSA+HTF media in a different concentration (2000U, 1000U, 100U, 10U) and its developmental rate was compaired to group which was cultured on 0.4% BSA+HTF media only.Result :1. The cleavage rate of 2-cell mouse embryo co-cultured with human tubal epithelial cell was significantly higher than that of cultured with media alone (HTF with 0.4% BSA) (p<0.05). 2. When LIF antibody was added to the medium with human tubal epitherlial cell, the mouse embryo could not cleave more than 2-cell in 1 ng of LIF antibody, and less than 1 ng, the cleavage rate was lower than cultured without LIF antibody group(p<0.05).3. Two cell blocked ICR mouse embryos were developed into four cells under LIF(p<0.05), but no further development was observed. Conclusion : These results shows that LIF enhances the development of preimplantation embryo, and when rhLIF is applicated in vitro, it has positive effects on the development of early mouse embryo and can help overcoming the two-cell block.

단층세포배양중에 있는 젖샘자극세포와 성장자극세포의 세포분열 능력

이은영,이병란,차중익,조사선,백상호 대한해부학회 1993 Anatomy & Cell Biology Vol.26 No.1

단순 고환조직 이식방법을 통한 생쥐 성체 내 존재하는 정원줄기세포의 과밀화 및 체외배양

임정진,김형준,조윤정,허영선,송승훈,이동률 한국발생생물학회 2011 한국발생생물학회 학술발표대회 Vol.30 No.-

포유동물 생식세포를 생산하는 정자형성과정은 정원줄기세포 (spermatogonial stem cells, SSCs)가 일생 동안 정소 내 기저부에 존재하면서 계속적인 증식을 통해 그 수를 유지하고, 그 중 일부가 감수분열에 진입하여 남성생식세포인 정자를 생산하는 일련의 과정이다. 신생 및 성체의 정원줄기세포는 의학과 접목하여 불임 및 저출산 치료에 크게 기여할 것으로 사료되어, 이미 많은 연구자에 의하여 활발히 연구가 진행되고 있다. 그러나 이중 성체 정소 유래의 정원줄기세포는 신생 정소에 비하여 체세포당 비율이 매우 낮아 이를 분리하여 배양하기 위해서는 효율 높은 정원줄기세포의 분리 방법의 개발이 필요하다. 따라서 본 연구는 인간에 적용하기에 가장 적합하다고 생각되는 조직이식 방법을 통하여 성체 생쥐의 정원줄기세포를 과밀화하고, 이렇게 얻어진 세포를 체외에서 배양하고자 하였다. 6~8주령의 정상적인 정자형성과정이 일어나고 있는 성체 생쥐 (BDF1)의 정소를 분리하였고, 정소 내 존재하는 분화된 생식세포를 줄여주기 위하여 면역이 결핍된 누드마우스의 등쪽에 이식하였다. 이때 생착효율을 알아보기 위하여 실험군은 3개 (whole testis under dorsal skin, slice testis under dorsal skin and whole testis in the abdominal cavity)의 그룹으로 나누어 이식하였다. 이식 2~4주 후 이식한 정소 조직을 채취하여 일부는 기존의 방법 (정소 조직의 이식방법을 사용하지 않은 대조군)과 비교해서 조직이식을 시행 후 세정관내 존재하는 정원줄기세포의 비율을 조직화학적 방법으로 비교 분석하였다. 나머지 조직은 개개의 세포로 분리하여 정원줄기세포의 증식 및 유지에 필요한 성장인자 (GDNF, bFGF, LIF, EGF, IGF-1)를 첨가한 후 배양하였으며, 7~10일마다 계대배양하였다. 배양된 세포는 RT-PCR, AP staining, TUNEL staining, Immunocytochemistry 및 FACS analysis를 통하여 정원줄기세포 특징을 분석하였다. 이식 2주 후 3그룹 내 정원줄기세포가 포함되어 있는 비율은 각각 93% (13/14), 92% (12/13), 57% (4/7)로 나타났으며, 이식된 조직의 seminiferous tubules내에는 분화된 생식세포가 사라지거나 퇴화된 것을 확인하였다. TUNEL assays를 통하여 Whole과 Sliced testis 그룹에서는 7.3±3.3%과 8.3±3.9% 만이 세포사가 진행되는 세포를 관찰한대 반하여 Abdominal cavity에 이식한 군에서는 70.9±16.2%로 매우 높은 세포사율을 관찰하였다. 체외배양 기간 동안 정원줄기세포의 colonization 효율은 이식하지 않은 대조군에 비하여 높게 관찰하였다. 조직 이식 후 배양한 성체 유래 정원줄기세포는 위 성장인자가 포함된 배양액에서 2.5달 (8계대) 동안 성공적으로 유지 배양되었다. 배양된 세포는 정원줄기세포의 특징인 AP activity를 강하게 나타냈으며, 표지인자인 Thy-1와 GFRα-1 또한 강하게 발현되는 것을 FACS와 Immunocytochemistry를 통하여 확인하였다. 또한 RT-PCR를 통하여 정원줄기세포 표지유전자 마커인 integrin β1, mvh, ngn3 mRNA는 강하게 발현되는데 비하여 생식세포 분화유전자 마커인 piwil2, stra8, c-kit, TH2B and TP-1 mRNA는 발현되지 않거나 약하게 발현되었다. 조직이식을 통하여 성체 내 존재하는 극소수의 성체 정원줄기세포의 분리 및 배양이 가능함을 확인하였다. 이러한 생쥐 모델 시스템을 인간에게 적용할 경우 autologous한 조직이식을 통해 단순화된 방법으로 정원줄기세포 분리 및 배양이 가능할 것으로 사료된다.

인간난관상피세포 및 Vero 세포가 생쥐배아의 발생에 미치는 영향에 대한 연구

김수곤(Su Kon Kim),박진완(Jin Wan Park),허의종(Eui Jong Hur) 대한산부인과학회 2002 Obstetrics & Gynecology Science Vol.45 No.6

목적 : 본 연구는 사람의 난관세포와 Vero 세포를 각각 생쥐의 배아와 공배양함으로써 사람의 난관세포와 Vero 세포의 공배양이 배아발생에 미치는 영향에 대해 비교해 보고자 한다. 연구 방법 : 자궁절제술을 받은 가임기 여성의 난관에서 채취된 난관상피세포와 Vero 세포를 배양하여 준비한 후, 생쥐에서 얻은 배아를 FBS (Fetal Bovine Serum)을 첨가한 Ham`s F-10 배양액에서 공배양하여 배아의 발달 단계별로 관찰하고 Ham`s F-10에 10% FBS가 첨가된 배양액에서 세포없이 배아 단독으로 배양한 군을 대조군으로 하여 비교 분석하였다. 결과 : 1. 난관상피세포 및 Vero 세포와 공배양한 군에서 배아 발생율은 각각 81%와 79.5%로 나타났으며, 대조군의 65.5%에 비하여 유의하게 높게 나타났다 (p<0.05). 난관상피세포 및 Vero 세포와 공배양한 군에서 배아의 부화율 (hatching rate)도 각각 63.5%와 60.5%로 대조군의 34.5%에 비해 유의하게 높게 나타났다 (p<0.05). 2. 계대 배양된 난관상피세포와 생쥐배아를 공배양하였을 때 계대 배양된 상피세포와의 공배양시 발생율과 부화율은 각각의 계대간 상피세포와의 공배양이 배아의 발생에는 유의하게 작용하지 않았다. 또한 계대 배양된 Vero 세포와의 공배양시 발생율과 부화율은 각각 83.3%와 63.3%로 계대 배양된 상피세포와의 계대 배양된 Vero 세포와의 비교에서도 통계학적으로 유의하지 않았다. 3. 동결-해빙한 공배양 세포와 공배양시 배아의 발생율을 살펴보면 난관상피세포와 공배양할 경우 계대 배양시 발생율과 부화율은 동결-해빙후 계대 배양한 공배양군에서의 발생율 및 부화율과 유의한 차이는 나타나지 않았다. 또한 동결-해빙후 배양된 Vero 세포와의 공배양에서는 발생율과 부화율은 각각 81.3%와 67.3%로 동결-해빙후 계대된 상피세포와의 비교에서도 통계학적으로 유의하지 않았다. 4. 계대 배양된 난관상피세포와 동결-해빙된 난관상피세포에서 공배양시 각각의 발생율과 부화율은 유의한 차이는 나타나지 않았다. 또한 계대 배양한 Vero 세포와 동결-해빙된 Vero 세포에서 공배양시 각각에서 발생율과 부화율은 유의한 차이가 나타나지 않았다. 결론 : 체외수정 시술에서 사람의 난관세포 및 Vero 세포와의 공배양은 생쥐배아의 발달 및 부화에 증진 효과가 있음을 확인할 수 있다. 또한 난관상피세포 및 Vero 세포와의 공배양이 생쥐배아의 발생율과 부화율에는 유의한 차이가 없음을 관찰할 수 있으며 공배양세포를 동결-해빙하여도 그 기능에는 큰 차이가 없음을 관찰 할 수 있다. 따라서 체외수정 프로그램시 난관상피세포나 Vero 세포를 사용하여 공배양하면 임신성공율 향상에 좋은 결과를 가져올 것으로 생각된다. Objective : The purpose of the study was to determine the effects of co-culture with oviductal epithelial cells and Vero cells on mouse embryo. Method : For the control group, mouse embryos were cultured alone in Ham`s F-10 with 10% FBS. Subcultured oviductal epithelial cell and Vero cell were cocultured in Ham`s F-10 with 10% FBS with the mouse embryo and used as the treatment group. Development of mouse embryos were observed. Result : The development rate and hatching rate of embryos that cocultured with oviductal epithelial cell and Vero cell was significantly higher (p<0.05) than control group. When subcultured oviductal epithelial cells were co-cultured with mouse embryo, there was no significant difference in development rate and hatching rate among subculture step. When oviductal epithelial cells that have been frozen-thawed were co-cultured with mouse embryo, there was no significant difference in development rate and hatching rate among subculture step. No statistical significance was seen in the development rate and hatching rate between subcultured oviductal epithelial cells and frozen-thawed oviductal epithelial cells when cocultured with mouse embryo, Vero cells and frozen-thawed when cocultured with mouse embryo, and Vero cells and oviductal epithelial cells when cocultured with mouse embryo. Conclusion : Oviductal epithelial cells and Vero cell may have a stimulatory role in early mouse embryonal development compared to control in vitro. As well, there is no significant difference in development rate and hatching rate among subculture step, when early mouse embryo was cocultured with cells that subcultured and frozen-thawed.

탯줄유래 줄기세포의 계대배양에 따른 특성 변화의 분석

박세아,강현미,허진영,윤진아,김해권,Park, Se-Ah,Kang, Hyun-Mi,Heo, Jin-Yeong,Yoon, Jin-Ah,Kim, Hae-Kwon 대한생식의학회 2009 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.36 No.1

목 적: 중간엽 줄기세포를 임상에 적용하기 위해서는 체외 배양을 통한 세포증식 과정이 필요하나, 오랜 기간 동안 체외 배양을 하게 되면 노화되어 특성이 변하고 분화 능력 또한 감소하게 된다. 따라서 현재까지는 초기 계대배양의 세포만이 임상에 적용되고 있는 실정이며 체외에서의 세포 배양이 세포의 특성에 미치는 영향에 대한 연구와 함께 세포의 특성 변화 없이 체외증식이 가능하도록 하는 연구들이 골수 및 지방유래 중간엽 줄기세포에서 보고되고 있다. 그러나 현재 탯줄유래 줄기세포의 체외 배양에 따른 특성 변화 분석 연구는 아직 잘 이루어지지 않고 있다. 본 연구의 목적은 탯줄유래 줄기세포의 체외 배양 시 계대배양 증가에 따른 줄기세포의 특성 변화를 분석하고자 하였다. 연구방법: 사람의 탯줄유래 줄기세포 (human umbilical cord-derived stem cells, HUC)를 분리하여 in vitro에서 계대배양하였다. 계대배양에 따른 세포의 형태와 population doubling time (PDT)을 조사하고 RT-PCR 방법을 이용하여 mRNA 분석을 하였으며 면역세포화학 염색법을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다. 결 과: 탯줄유래 줄기세포는 평균 10번의 계대배양 후 senescence를 나타냈다. 세포의 형태는 7번째 계대배양 이후 세포질이 넓어지고 세포의 크기가 커지는 변화를 나타냈으며 PDT가 증가하기 시작하였다. 계대배양 4, 8, 10번째 시기의 세포의 mRNA 변화를 분석한 결과 Oct-4, HNF-4${\alpha}$, mRNA는 10번째 계대배양까지 지속적으로 발현하였으나 nestin, vimentin mRNA는 지속적으로 발현이 감소하였고 SCF mRNA는 지속적으로 발현이 감소하였다. 이에 반해 HLA-DR${\alpha}$, Pax-6, BMP-2 mRNA는 모든 계대배양 시기의 세포에서 발현되지 않았다. 면역세포화학 분석법을 통한 3, 6, 9번째 계대배양 세포의 단백질 발현 분석 결과 SSEA-3와 SSEA-4는 3, 6, 9번째 계대배양 세포 모두에서 발현하였으나 ICAM-1과 HLA-ABC는 계대배양이 증가함에 따라 발현이 증가되었다. Thy-1 단백질은 p9에서 발현이 증가되었으며 이와 반대로 TRA-1-60와 VCAM-1 단백질은 p6과 p9 시기에 발현이 감소되었다. HLA-DR 단백질은 모든 계대배양 시기에 발현되지 않았다. 결 론: 본 연구결과 탯줄유래 줄기세포는 체외 배양 시 줄기세포 특성이 일부 변하는 것을 관찰하였다. 앞으로 줄기세포의 특성을 유지할 수 있는 체외 배양법의 발달을 위한 연구들이 수행 되야 할 것으로 사료된다. Objectives: Mesenchymal stem cells (MSC) comprise a promising tool for cellular therapy. It is known that long-term in vitro culture of human bone marrow and adipose tissue derived-MSCs lead to a reduction of life span and a change of stem-like characters. The aim of our study was to examine whether stem cell properties of human umbilical cord-derived stem cells (HUC) could be affected by in vitro expansion. Methods: HUC were isolated from human umbilical cord and cultured for 10 passages in vitro. Morphology and population doubling time (PDT) were investigated, and changes of stem cell properties were examined using RT-PCR and immunocytochemistry during serial subcultures. Results: Morphology and PDT of HUC began to change slightly from the 7th passage (p7). Expression level of nestin and vimentin mRNAs increased along with the culture period from p4 until p10. In contrast, expression level of SCF mRNA decreased during the same culture period. Expression level of Oct-4 and HNF-4${\alpha}$ mRNAs was not significantly changed throughout the culture period until p10. Expression level of BMP-4, FGF-5, NCAM and HLA-ABC mRNAs appeared to increase as the culture continued, however, the difference was not significant. Immunocytochemical studies showed that HUC at p3, p6 and p9 positively were stained with antibodies against SSEA-3 and SSEA-4 proteins. Interestingly, staining intensity of HUC for ICAM-1 and HLA-ABC gradually increased throughout the culture period. Intensity against thy-1 and fibronectin antibodies increased at p9 while that against TRA-1-60 and VCAM-1 antibodies began to decrease at p6 until p9. Conclusions: These results suggest that HUC change some of their stem cell characteristics during in vitro culture. Development of culture system might be needed for the maintenance of characteristics.

성장생물학 : 지방과 근육 세포주의 단독 및 공동배양을 통한 세포형태학 및 세포물질 비교 연구

연성흠 ( Seong Heum Yeon ),조원모 ( Won Mo Cho ),백경훈 ( Kyung Hoon Baek ),송만강 ( Man Kang Song ),최창원 ( Chang Weon Choi ),황보순 ( Bo Soon Hwang ),박성권 ( Sung Kwon Park ) 한국동물자원과학회 ( 구 한국축산학회 ) 2012 한국축산학회지 Vol.54 No.2

본 연구는 기존 단독배양 위주로 이루어져온 세포배양 연구의 방법학적 한계의 극복과 대안을 제시하고자 지방과 근육세포주의 단독 및 공동배양에서 배양기법에 따른 지방 및 근육세포의 분화에 미치는 영향을 비교 조사하고자 실시하였다. 3T3-L1(지방세포) 및 L6(근육세포) 세포주는 성장배지인 10% FBS/DMEM(1% Pen- Strep solution 및 0.1% Fungizone 첨가) 하에서 48h 동안 단독배양 후 5% FBS/DMEM에서 배양하였다. 분화를 위한 단독 및 공동배양에서는 지방 및 근육세포 모두 분화유도물질 없이 2% FBS/DMEM으로 배양하였고, 공동배양에서는 0.4㎛ insert membrane을 사용하여 6 well plate 하단에 L6 cell을, 상단에는 3T3-L1 cell을 공생시켰다. 지방 및 근육세포 분화정도 측정은 세포별 형태학적 측정과 glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH) 및 creatine kinase(CK) 분석을 통해 조사되었다. 형태학적으로 볼때 3T3-L1 세포주는 공동배양보다 단독배양 시 분화가 더욱 잘 일어났고 L6 세포주의 경우 역으로 같았다. 세포물질분석에서는 분화배지 처리일(day 0)과 비교해 단독 및 공동배양 모두 지방세포 내 GPDH의 활성도가 유의적으로(P<0.05) 증가했음을 확인할 수 있었고 단독배양이 공동배양보다 유의적으로(P<0.05) 높은 수준의 GPDH 활성도를 보였다. L6 역시 마찬가지로 분화배지 처리일에 비하여 단독 및 공동배양 모두 CK 활성도가 유의적으로(P<0.05) 높았고, CK 활성도가 공동배양에서 유의적으로(P<0.05) 높게 나타남을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 기존 연구에서 이용된 단독 배양을 통한 세포 분화 결과 등은 생체와 비교 시 방법학적 한계로 인해 실제 생체 내에서는 그 분화정도가 매우 다를 것으로 생각되며, 이것은 앞으로 정확한 세포배양 결과 확보를 위해서는 단독배양보다는 공동배양기법을 사용해야 함을 의미한다. 향후 다양한 조건과 분화조절 물질들의 첨가를 통한 추가적인 공동배양실험이나 지방분화관련 분자생물학적 물질분석 등 다양한 실험 수행 시 보다 현실적이고 대량의 기초자료 확보가 가능할 것으로 판단된다. Present study was performed to investigate the effect of single and co-culture of adipocyte and muscle cell lines on cell differentiation. 3T3-L1(adipocyte) and L6(muscle) cell lines were single-cultured on the condition of 10% fetal bovine serum (FBS)/Dulbeco`s modified eagle`s medium(DMEM) for 48 h followed by culture within 5% FBS/DMEM as a growth media. Then, the growth media was replaced by differentiation media composed of 2% FBS/DMEM without additives in single- or co-culture of the 3T3-L1 and the L6 cells to induce differentiation of both cell types. In co-culture system, the 3T3-L1 and the L6 cells were grown in separated places by being seeded on a 0.4μm insert membrane and on the bottom of 6 well plate, respectively. Cell differentiation was measured using morphological investigation and cytosolic analysis of glycerol-3-phosphate dehydrogenase(GPDH; for 3T3-L1) and creatine kinase(CK; for L6). Based on the GPDH results, the presence of L6 cells did not stimulate 3T3-L1 differentiation showing more differentiation of 3T3-L1 cells in the single-culture compared to the co-culture condition. In contrast, 3T3-L1 cells in the co-culture promoted differentiation of L6 cells. Enzymatic analysis supported this result showing that 3T3-L1 cells showed statistically(P<0.05) higher GPDH activity in the single-culture than the co-culture, whereas CK results of L6 cells were vice versa(P<0.05). Overall, present results may indicate that co-culture system is more reliable and precise technique compared to single-culture. Further studies on several co-culture trials including different media conditions, supplementation of differentiating substances, molecular biological analysis, etc. should be required to obtain practical and fundamental mass data.

인간 난관상피세포의 공배양이 생쥐 초기배아의 체외성장에 미치는 영향

이규섭(Kyu Sup Lee),고형권(Hyeong Gweon Ko),신병섭(Byeong Sub Shin),이영아(Young A Lee),김상우(Sang Woo Kim),나용진(Yong Jin Na) 대한산부인과학회 2000 Obstetrics & Gynecology Science Vol.43 No.6

목적 : 공배양술이 생쥐 초기배아의 발생에 미치는 효과를 조사하고, 공배양을 초기배아의 유전자 활성화 시기인 1-세포기 배아 전후에 적용하여 공배양의 시작시기와 기간이 배아발달에 미치는 효과를 알아보고자 하였다. 연구방법: 과배란 유도 후 얻은 ICR 계통의 생쥐 1-세포기 배아를 인간 난관상피세포와 96시간동안 CO2 배양기(37 ℃, 5 % CO2)에서 공배양하였으며, 대조군으로 1-세포기 배아를 0.4 % BSA를 함유한 HTF 배양액에서 단독배양하였다(실험 1). 생쥐 1-세포기 배아를 인간 난관상피세포와 공배양 후 hCG 주사시간을 기준으로 36, 44, 52, 60시간째 각각 0.4 % BSA를 함유한 HTF 배양액으로 옮겨 계속 배양하였으며(실험 2), 반대로 생쥐 1-세포기 배아를 0.4 % BSA를 함유한 HTF 배양액으로 먼저 배양한 후 hCG 주사시간을 기준으로 36, 44, 52, 60시간째 각각 난관상피세포와 공배양하였다(실험 3). 배양 24, 48, 72, 96, 120, 144시간 후에 각 배아의 난할 정도를 관찰하여 2-세포기, 4∼8 세포기, 상실배 및 포배 등으로 분류하였다. 결과 : 실험 1에서 2-세포기로 발생한 경우는 공배양군과 배양액 단독군간에 유의한 차이는 없었다(p>0.05). 그렇지만 4-세포기 이후의 발달율은 공배양군에서 배양액 단독군에 비해 통계적으로 유의하게 높았다(p<0.05). 실험 2에서 4-세포기 이후의 배아발달율은 공배양의 처리시기에 따라 유의한 차이를 보였는데 hCG 주사 후 60시간군에서 포배까지의 배아발달율은 포배까지 계속 공배양을 한 군과 유의한 차이가 없는 반면, hCG 주사 후 60시간 이전에 공배양의 효과를 제거한 나머지 3개군은 포배기배아 발달율이 유의하게 감소하였다(p<0.05). 실험 3에서 4-세포기 이후의 배아발달율은 공배양을 초기부터 시작할수록 높았으며, hCG 주사 후 52시간부터 공배양 했을 때 4-세포기 이후 포배까지의 배아발달율은 지속적으로 공배양을 한 군에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.05). 결론 : 배아의 발달율을 높이기 위해서는 초기부터 공배양을 시작하는 것이 좋으며, 특히 배아의 2차 핵분열이 일어나는 기간동안 공배양 환경을 지속시켜 주어야만 공배양에 의하여 2-cell block을 극복하여 포배이후까지의 배아발달에 도달할 수 있을 것으로 사료된다. Objective: To examine the effects of coculture with human oviductal cells regarding the development of 1-cell stage ICR mouse embryos and to investigate the effects of duration and start time of coculture. Materials and Methods: ICR mice were superovulated with PMSG/hCG and 1-cell stage mouse embryos were recruited. 1-cell mouse embryos were cocultured on human oviductal cells in a CO2 incubator(coculture group) and were cultured on 0.4 % BSA+HTF media(control group)(Experiment 1). 1-cell mouse embryos were cocultured on human oviductal cells for 36, 44, 52, 60 hours after hCG IP respectively, and then were transferred to 0.4 % BSA+HTF media(Experiment 2). In comparison, 1-cell mouse embryos were cultured by using 0.4 % BSA+HTF media, and then were transferred to human oviductal cell coculture system using the same schedule(Experiment 3). Afterward, they were examined regarding the development to 2-cell, 4∼8 cell stage mouse embryos, morulas and blastocysts. Results: In experiment 1, the developmental rates to 2-cell embryos of coculture group and control group were 97.3 % and 98.7 %, respectively. After 2-cell embryos, coculture group showed significantly higher developmental rate than control group (p<0.05). In experiment 2, the developmental rates after 2-cell embryos showed the significant differences. The groups with coculture effects removed before post-hCG 60 hours showed significantly lower developmental rates (p<0.05). In experiment 3, the developmental rates after 2-cell embryos were higher when the coculture started at an earlier stage. Furthermore, the groups which were cocultured from post-hCG 52 hours exhibited significant lower developmental rate than the groups which were cocultured continuously (p<0.05). Conclusion: The coculture with human oviductal cell could improve the development of the embryos in vitro and might mimic the natural physiological condition better than media environment. The degree of improvement was more pronounced when the coculture started at an earlier stage and the duration of coculture was longer. More importantly, the changes of culture condition at post-hCG 52 hours in which secondary mitosis occurs, have significant detrimental effects on growth and development of mouse embryos.

Phenotypic Characterization of Cementum-Derived Cells in Human

김수환,양병근,구영,류인철,정종평,한수부,이용무,Kim, Su-Hwan,Yang, Byung-Kun,Ku, Young,Rhyu, In-Chul,Chung, Chong-Pyoung,Han, Soo-Boo,Lee, Yong-Moo The Korean Academy of Periodontoloy 2004 Journal of Periodontal & Implant Science Vol.34 No.2

백악질 세포의 분리 및 배양방법을 확립하고, 이를 이용하여 백악질 세포의 형질특성을 알아보고자 하였다. 교정목적으로 발거된 소구치를 이용하여, 치은섬유아세포, 치주인대 세포 및 백악질 유래세포를 분리, 배양하였다. 백악질 유래 세포 배양시에는 백악질을 절제한 후 Collagenase P를 이용하여 백악질 유래 세포 외의 다른 세포의 개제를 배제하였고, 기질을 분해하여 세포의 분리 및 배양이 용이하도록 하였다. 분리 및 배양시기의 세포의 형태를 광화현미정을 이용하여 관찰하였다. 조골세포의 특성을 가지는 SaOs-2 세포를 대조군으로 이용하여 분리 및 배양된 세포군들을 동일한 조건으로 배양하였다. 3일 및 7일째에 세포증식도를 측정하였고 7일째에 ALPase 효소 활성도를 측정하였다. 각 세포의 형질 특성을 알아보기 위해 RT-PCR을 실시하여 조골세포 분화 표식자와 연관된 osteopontin(OPN), Alkaline phosphatase(ALP), type I collagen(COL-I), Bone sialoprotein(BSP), BMP-2 및 osteocalcin(OC)의 발현을 비교 관찰하였다. 백악질 유래 세포의 분리 및 배양을 시도한 5명의 치아 중에서 3명의 치아에서 세포군을 배양해 낼 수 있었다. 배양한 백악질 유래 세포는 섬유아세포와 유사한 형태와 증식을 보였다. ALPase 효소 활성도 검사 결과 백악질 유래 세포는 SaOs-2 세포보다 낮은 활성도를 나타내었으며, 배양된 세포의 RT-PCR 결과 백악질 유래 세포군에서는 ALPase의 발현이 나타나지 않았고, 다른 조골세포 표식자의 발현도 낮게 나타났다. 이는 백악질 유래 세포가 조골세포 및 다른 대조군의 세포와는 다른 형질 특성을 가지고 있다는 것을 시사한다. 이상의 관찰결과로 사람의 백악질 유래 세포롤 백악질의 절제 및 효소처리 방법으로 효과적인 분리 및 배양이 가능하며, 이는 향후 백악질 세포의 형질 특성 및 백악질 형성의 분자적 기전을 파악하는 중요한 연구자료로 활용 될 수 있을 것으로 사료된다.

사람 정상중이점막 상피세포의 계대 배양과 분비세포로의 분화 유도

이호기,윤주헌,박홍준,문성균,정명현,김희남 대한이비인후과학회 1999 대한이비인후과학회지 두경부외과학 Vol.42 No.8

Long-Term Culture of Gonadal Primordial Germ Cells(gPGCs) for Genetic Manipulation in Chicken

Kim, Seon-Ku,Lee, Gil-Wang,Han, Jae-Yong,Hong, Yeong-Ho,Cho, Byung-Wook 密陽産業大學校 農業技術開發硏究所 1998 農業技術開發硏究所報 Vol.2 No.1

닭을 포함한 조류의 원시생식세포는 포유류의 원시생식세포와는 다르게 초기 배 발달 단계 중 extraembryonic 부위에 존재하면서 혈관계를 따라 원시생식기로 이동한다. 따라서 원시생식 세포의 분리 및 배양 그리고 게놈의 조작에 의한 수용체에로의 주입은 형질전환 닭 생산을 위한 매우 매력적인 과제라 할 수 있다. 비록 단기간 (5일정도) 배양에 대한 보고가 있으나, 닭의 embryonic stem cell (ES) 또는 PGC의 장기간 배양에 대한 보고는 거의 전무한 상태이다. Mouse의 경우 원시생식세포의 중식, 성장 그리고 분화는 여러 요인들에 의해 조정된다 LIF, IGF-1, SCF, bFGF, IL-11등과 같은 인자에 의한 닭 원시생식세포의 장기배양 결과 원시생식기의 stroma 세포를 feeder, layer로 사용하였으며, 약 3개월간 성공적으로 배양할 수 있었다. 배양 초기 1-2일을 전후해 세포의 수가 급감함을 관찰할 수 있었는데 이는 초기 세포 분리시 피해입은 세포등에 의한 원인이라 생각된다. 배양된 원시생식세포는 쥐의 ES 세포에 특이 적인 항체인 MC-480 (anti-SSEA-1)에 특이적으로 염색이되어 ES 세포의 특성을 가지면서 장기간 배양이 가능함을 입증하였다. 또한 배양 기간중 약 50%의 원시생식세포가 분열중임을 proliferation assay을 하여 입증하였으며, pCMV-GFP plasmid DNA을 전기충격 법을 이용하여 원시생식세포에 전이시켜 약 2달간 배양한 후 2.5일령의 수용체에 주입하여 부화시킨 다음 생식기, 간. 심장등으로부터 DNA을 추출한 다음 PCR을 수행한 결과 생식기에서는 모두 관찰이 가능하였고, 한 개체에서는 간과 심장에서도 발현이 되었다. 결론적으로 원시생식세포를 체외에서 성공적으로 장기간 배양이 가능하였으며, 유전자 전이에 의한 주입결과 수용체 생식기로 이동함을 확인하였다. 이러한 결과는 원시생식기세포의 장기 배양이 가능함으로써 체외에서의 유전적 조작이 가능하고 EG cell로서의 개발도 가능하여 형질전환 닭 생산에 많은 기여를 할 수 있을것으로 사료된다. Gonadal primordial germ cells (gPGCs) were isolated from the gonad of 6days old embryo and cultured in the presence of IGF-I, LIF IL-II SCF, and germ cells (gPGCs) were isolated from the gonad of 6 bFGF for 3 months without passage. The gPGCs started to form colonies composing about 10 gPGCs after 7 days of culture. The morpholegical and histochemical characteristics of gPGC cultured for 3 months remained same compared to those of gPGCs cultured for 6 days. The long-term cultured gPGCs expressed the murine ES cell specific epitopes, SSEA-1 PGC-specific antibody. The gPGC population showed capacity of proliferation during culture period. The gPGCs cultured for 3 weeks after tansfection were injected to the recipient embryos and the embryos were incubated for an additional 3.5 days or to hatching at 37 .The exogenous gene was detected in forty out of fifty recipient embryos gonads. PCR analysis of DNA from the hatched chicks showed that exogenous DNA was detected in the gonads and not in the liver or heart. These results indicated that the long-term cultured gPGCs can contribute to gonadal formation after transfer to embryo and be used as useful vector for the genetic manipulation to produce transgenic chicken.