출아효모에서 연속적 δ-sequence 삽입유도에 의한 β-1,3-glucanase 활성 증가

김민정(Min-Jung Kim),김연희(Yeon-Hee Kim) 한국생명과학회 2014 생명과학회지 Vol.24 No.10

β-1,3-glucanase는 다양한 바이오공정에 널리 사용되어지는 효소로서 산업적 이용가치 증대를 위해 β-1,3-glucanase의 대량생산이 요구되어 지고 있다. 본 연구에서는 반복서열 δ-sequence에 의한 integration를 통해 Aspergillus oryzae유래의 β-1,3-glucanase (EXGA)의 과발현 유도를 연구하였다. 먼저 효모내의 여러 염색체상에 EXGA 유전자를 integration하기 위해 pRSδ-exgA와 pRSδK-exgA 플라스미드를 구축하였다. 이 플라스미드는 유전자의 구성적 발현을 위한 ADH1 프로모터, 분비생산을 위한 signal sequence와 β-1,3-glucanase유전자의 integration을 위한 δ-sequence를 포함하고 있다. 먼저 pRSδ-exgA 플라스미드를 BY4742△exg1 균주에 형질전환하고, 재조합 β-1.3-glucanase가 안정하게 과발현 및 분비생산됨을 확인하였다. 다음으로 geneticin 선별을 통한 integration유도와 β-1,3-glucanase 활성과의 관계를 조사해보기 위해 pRSδK-exgA 플라스미드를 BY4742△exg1(YKY082) 균주에 도입한 결과, geneticin 농도 증가에 따라 β-1,3-glucanase 활성도 증가되었고, geneticin 농도 0.8 ㎎/ml가 β-1,3-glucanase과발현에 적합한 농도임을 확인 할 수 있었다. 이어서 pRSδK-exgA 플라스미드는 연속적 δ-integration에 의해 효모세포 내에 도입되어, 한번, 두번, 세번 그리고 네번의 integration에 의해 β-1,3-glucanase의 비활성은 0.063, 0.095, 0.131 그리고 0.165 unit/ml/OD600로 증가되었다. 또한 연속적 integration에 의해 β-1,3-glucanase의 활성이 증가됨에 따라 다양한 염색체에 도입된 EXGA 유전자의 복제수(integration 빈도)도 같이 증가되었음을 확인하였다. 따라서 본 연구 결과는 반복적 δ-sequence integration방법을 통해 재조합 β-1,3-glucanase의 활성을 점진적으로 안정하게 증가시킬 수 있음을 제시하였다. Beta-1,3-glucanase is widely used in various biotechnological and industrial processes, with overproduction required to enable versatile utilization. We examined the overexpression of β-1,3-glucanase (EXGA) from Aspergillus oryzae using δ-sequence-mediated integration. We constructed pRSδ-exgA and pRSδK-exgA plasmids for integration of the EXGA gene into various chromosomes of Saccharomyces cerevisiae. These plasmids contain the ADH1 promoter for constitutive expression, a signal sequence (exoinulinase signal sequence [INU1 s.s]) for secretory production, and a δ-sequence for integration of β-1,3-glucanase. The pRSδ-exgA plasmid was transformed into the S. cerevisiae BY4742△exg1 strain, and β-1.3-glucanase was stably overexpressed and secreted. Another plasmid, pRSδK-exgA, was introduced into the S. cerevisiae BY4742△exg1 (YKY082) strain, and overexpression of β-1,3-glucanase was examined by inducible integration under geneticin selection. The activity of β-1,3-glucanase increased in accordance with a rise in the geneticin concentration, with 0.8 mg/ml of geneticin suitable for overexpression of β-1,3-glucanase. Subsequently, pRSδK-exgA was repeatedly transformed for sequential δ-integration. The activity of β-1,3-glucanase reached about 0.063 unit/ml/OD600, 0.095 unit/ml/OD600, 0.131 unit/ml/OD600 and 0.165 unit/ml/OD600 by the first, second, third, and fourth round of integration, respectively. According to the increase in the activity of β-1,3-glucanase by sequential δ-integration, the copy number (integration rate) of the EXGA gene also increased in various chromosomes. These results suggest that recombinant β-1,3- glucanase activity can be sequentially increased by repeated δ-sequence integration.

麥酒麥의 (1-3,1-4)-β-glucanase 遺傳子의 構造와 發現 樣狀

유남희,윤성중,최경구,김제환,박충웅 全北大學校 基礎科學硏究所 1994 基礎科學 Vol.16 No.-

禾穀類 種子 發芽時 호분층과 ??組織의 細胞壁에 多量 含有되어 있는 (1-3, 1-4)-β-glucan을 分解하여 種子의 發芽에 必要한 加水分解酵素의 分泌 및 擴散 浸透를 돕는다. 本 硏究에서는 國內 麥酒麥의 (1-3, 1-4)-β-glucanase 遺傳子의 構造 및 發現 에 대한 基礎 情報를 얻기 위하여 生化學的 및 分子生物學的 方法을 利用하여 發芽種子 및 어린 잎에서의 酵素活性과 遺傳子의 發芽樣狀 그리고 遺傳子의 構造 等을 調査하였다. 麥酒麥 發芽種子中 (1-3, 1-4)-β-glucanase 活性은 發芽 7日째에 제일 높았다. (1-3, 1-4)-β-glucanase의 活性測定에 使用한 (1-3, 1-4)-β-glucan이 (1-4)-β-glucanase에 의해 分解될 可能性이 있으므로 (1-4)-β-glucanase의 活性도 測定하였는데 (1-4)-β-glucanase의 活性이 매우 낮게 나타나서(1-4)-β-glucanase가 (1-3, 1-4)-β-glucanase을 分解하여 (1-3, 1-4)-β-glucanse의 活性에 影響을 미쳤을 可能性이 매우 낮았다. 麥酒麥의 (1-3, 1-4)-β-glucanase 遺傳子 構造를 PCR을 利用하여 調査하였던바 國內 麥酒麥의 (1-3, 1-4)-β-glucanase 遺傳子 構造는 外國의 다른 品種들이나 귀리의 遺傳子 構造와 대단히 類似하였다. 酵素活性 測定과 귀리의 (1-3, 1-4)-β-glucanase cDNA clone을 ?識子로 利用한 보리의 mRNA 分析에 의해서 發芽傳子 및 어린 잎에서 (1-3, 1-4)-β-glucanase가 種子發芽 以外에도 生育中인 組織細胞의 伸張과 發育 및 β-glucan 再利用에 泌要한 β-glucan 代謝에 關與하고 있음을 示唆하는 結果라 생각된다. (1-3, 1-4)-β-glucans hydrolysis of cell wall (1-3, 1-4)-β-glucanas accompanies degradation of endosperm cell walls during cereal seed germination. To investigate (1-3, 1-4)-β-glucanase expression pattern in Korean malting barley, (1-3, 1-4)-β-glucanase activity, gene structure and mRNA expression patterns werre examined. (1-3, 1-4)-β-glucanase activity increased as germination proceeded and the highest enzyme activity was detected in seeds germinated for 7 days. Because (1-4)-β-glucanase have a potential to degrade (1-3, 1-4)-β-glucans, (1-4)-β-glucanase activity was also determined. (1-4)-β-glucanase activity, however, was very low minimizing possibility of (1-4)-β-glucanase action on (1-3, 1-4)-β-glucan substrate. PCR technique was employed to investigate (1-3, 1-4)-β-glucanase gene structure. The amplification product of the expected size from the targeted sites of Dusan #29 indicated that (1-3, 1-4)-β-glucanase systems were conserved in different barley varieties and even in oats. (1-3, 1-4)-β-glucanase activity and mRNAs were detected in young leaves as well as in germinating seeds. This may suggest that (1-3, 1-4)-β-glucanase are also involved in β-glucan metabolism required for cell elongation and β-glucan reutilization during leaf growth and developmetn.

치면세균막 분해효소인 α-1,3 glucanase를 생산하는 미생물의 분리 및 효소 특성

조효상,허태련,윤정원 한국산업미생물학회 1993 한국미생물·생명공학회지 Vol.21 No.3

S. mutans가 만들어내는 불용성 glucan을 완전히 분해시킬 수 있는 새로운 α-1,3 glucanase를 탐색하기 위하여 S. mutans가 직접 만들어 낸 불용성 glucan을 기질로 사용하여 자연으로부터 미생물을 탐색한 결과, 자연에 존재하는 여러 균주 중 17종의 불용성 glucan 분해능력을 가진 미생물을 분리하였으며 위 균주를 액체배양하여 배양액으로 부터 α-1,3 glucanase를 추출한 결과, 균주 SW-522와 SW-713 균주에서 각각 97.6%와 49.3%의 불용성 glucan을 5시간 후에 분해시키는 효소역가를 보였다. SW-522의 α-1,3 glucanase의 역가는 1.3 ㎎ IG/min·mg protein으로 기존의 발견된 효소보다 십배이상 높았고, SW-522의 α-1,3 glucanase는 S. mutans에 의해 test tube에 형성된 불용성 glucan을 12시간 후에 완전히 분해시켰으며 시판 α-amylase와 기존세치제에 사용되어온 dextranase는 불용성 glucan의 분해도가 각각 10.2%와 6.3%인데 비해 SW-522의 α-1,3 glucanase는 90% 이상의 분해도를 나타냈다. 따라서 새로운 α-1,3 glucanase는 세치제 또는 식품 등에 첨가하여 치아우식예방에 효과가 뛰어난 구강 환경위생용품을 개발할 수 있다고 사료된다. Seventeen strains were isolated from soil, cattle rumen, cereal, sewage dregs, insect on agar plate containing insoluble glucan as a sole carbon source from immobilized Streptococcus mutans, which produced α-1,3 glucanase ofr lysis of dental plaque. Among these strains isolated from soil, SW-522 and SW-713 that had appeared to produce the high level of α-1,3 glucanase, degraded insoluble glucan from S. mutans 97.6% and 49.4%, respectively in 5 hours. The activity of crude α-1,3 glucanase from SW-522 was 1.3 ㎎ insoluble glucan/min·㎎ protein. This enzyme was entirely degraded insoluble glucan on glass tube which produced by S. mutans in TH medium with 5% sucrose.

등숙 중인 보리 종실중 (1-3, 1-4)-$\beta$-Glucan과 전분 함량 및 이들의 가수분해효소 활성

윤성중,박상래,유남희 한국작물학회 1997 Korean journal of crop science Vol.42 No.4

취반용 보리 종실 내 (1-3, 1-4)-$\beta$-glucan의 축적기작을 알아보기 위하여 개화 후 일정 간격으로 보리 종실을 채취하여 (1-3, 1-4)-$\beta$-glucan 함량, (1-3, 1-4)-$\beta$-glucanase 활성 및 전분함량과 $\alpha$-amylase 활성을 조사하였다. $\beta$-glucan 함량은 등숙 초기에 매우 낮았으나 개화 후 15~25일 사이에 급속히 증가하였고 개화 후 30일경에는 종실 건물중의 3.5~4%로 증가하였다. (1-3, 1-4)-$\beta$-glucanase 활성은 등숙 초기에 높았으며 등숙이 진전될수록 감소하였다. $\beta$-glucan 함량과 (1-3, 1-4)-$\beta$-glucanase 활성간에는 고도로 유의한 부의 상관관계가 인정되었으나 등숙 종실 중의(1-3, 1-4)-$\beta$-glucanase 활성이 매우 낮은 수준이므로 $\beta$-glucan 축적량에 크게 영향을 미치지 않을 것으로 추정되었다. 전분함량은 등숙이 진전됨에 따라 지속적으로 증가하였으며 개화 후 10~20일에 가장 뚜렷하게 증가하였다. 포도당함량은 등숙이 진전됨에 따라 현저히 감소하였으며, 등숙 초기와 중기에 감소 정도가 매우 컸다. $\alpha$-amylase의 활성도 등숙이 진전됨에 따라 현저히 감소하였으며, 감소 정도는 등숙 초기와 중기에 매우 컸다. To obtain information on the accumulation of (1-3, 1-4)-$\beta$-glucans during kernel maturation, (1-3, 1-4)-$\beta$-glucan contents and (1-3, 1-4)-$\beta$-glucanase activities were determined in developing kernels of the two Korean cooking barley varieties, Neulssalbori and Saessalbori. (1-3, 1-4)-$\beta$-Glucan contents in kernels at 5 and 10 days after anthesis(DAA) were very low and the contents increased rapidly in kernels at 15 to 25 DAA. (1-3, 1-4)-$\beta$-Glucan content in kernels at harvest was about 3.5 to 4% of kernel dry matter. (1-3, 1-4)-$\beta$-Glucanase activities were relatively higher in younger kernels but the levels of the activity were very low compared with those in germinating kernels. A significant negative correlation was observed between (1-3, 1-4)-$\beta$-glucan contents and (1-3, 1-4)-$\beta$-glucanase activities. Low levels of (1-3, 1-4)-$\beta$-glucanase activites in kernels at 15 to 30 DAA, however, may indicate that (1-3, 1-4)-$\beta$-glucanases have little effect on the final content of (1-3, 1-4)-$\beta$-glucans in barley kernels. Starch contents and $\alpha$-amylase activities were also determined in developing barley kernels. Starch contents increased rapidly as kernels matured and the content at harvest was about 60% of kernel dry matter. Relativley higher levels of $\alpha$-amylase activities in kernels at the earlier developmental stage decreased rapidly as kernels matured.

Streptomyces sp. Y9343이 生産하는 齒面細菌膜 分解酵素의 精製와 特性

김성주,한홍근,윤정원 한국미생물생명공학회 ( 구 한국산업미생물학회 ) 1996 한국미생물·생명공학회지 Vol.24 No.1

치면세균막을 제거하거나 형성을 억제하여 치아우식증 예방제를 개발할 목적으로 α-1,3 glucanase를 분비하는 새로운 균주로 부터 분리 정제하여 그 특성을 조사하였다. 불용성 glucan을 유일탄소원으로 하는 agar plate를 제조하여 토양으로 부터 α-1,3 glucanase 분비균주를 탐색한 결과 Streptomyces sp. Y9343을 얻었다. 액체배양시 최적 효소생산조건은 탄소원으로 1% soluble starch와 indcer로 0.5% insoluble glucan을 첨가하였을 때 가장 효율적이었다. α-1,3 glucanase는 황산 암모늄 염석, DEAE-CEllulose 이온교환 크로마토그래피, Sephadex G-75 겔 여과 등에 의하여 32.1배까지 정제되었고 수율은 0.53%이었으며, 이 때의 활성도는 7840.9 U/mg protein이었다. 정제된 α-1,3 glucanase를 SDS-PAGE로 분석한 결과, 단일체임을 확인하였으며, 이 때 분자량은 22,500이었다. 효소의 최적 pH는 6.5이었다. 효소의 최저온도는 37℃이었고, 열에 대한 안정성은 70℃ 이상에서 40%~60%의 효소활성이 상실함을 보였다. Detergent의 영향은 SDS에 의해 83%, Tween 20에 의해서는 약 27% 정도의 활성저해를 받았다. 효소활성의 금속이온에 의한 영향은 Co^2+, Mn^2_+에 의해 각각 81.8, 69.7%의 활성의 증가를 보였고 이들의 최적농도는 10mM이었으며, 반면에 Hg^2+에 의해서는 93.9%의 효소활성의 저해를 나타내었다. 또한 초기속도(30분 이내)에 금속이온에 의한 영향이 큰 것으로 나타났다. α-1,3 glucanase의 불용성 glucan에 대한 K_m 값은 2.50mM이었고, V_max는 0.0431 mM/min이었다. α-1,3 glucanase의 기질특이성을 조사한 결과, 반응 30분 후 IG와 soluble starch에는 각각73, 100%의 높은 분해력을 보였으며, raw starch, dextran T-10에 대해서는 낮은 분해력을 보였다. 한편, 인조치면세균막을 S. mutans로부터 시험관 벽에 제조한 후, α-1,3 glucanase를 처리한 결과 2시간 이내에 완전히 분해 제거되는 것을 알 수 있어 강력한 치아우식예방제로 개발될 수 있음을 보여 주었다. Streptococcus mutans has been implicated as primary causative agents of dental caries by insoluble glucan (IG) in human and experimental animals. An attempt was made to search for the α-1,3 glucanase that degrades IG produced by S. mutans. α-1,3 glucanase was detected in the culture supernatant of microorganisms, which are isolated from soils on agar medium containing IG as a sole carbon source. This Streptomyces sp. hydrolysed IG produced by immobilized S. mutans and was named as Y9343. This enzyme required α-1,3 glucan (IG) as an inducer. The optimum conditions for enzyme production were studied. The enzyme was purified by 30~70% (NH_4)_2SO_4 precipitation, anion exchange chromatography on DEAE-cellulose and gel filration on Sepadex G-75. The purified enzyme has a specific activity of 7840.0 U/mg protein giving 32.1-fold purification and final yield of 0.53%. The molecular weight was estimated to be about 22.5 kDa by SDS-PAGE. The optimum pH and temperature for enzyme reactiorr were 6.5 and 37℃, respectively and the enzyme was relatively stable at the temperature below 60℃. The activity of purified enzyme was enhanced by adding Co^2+, Mn^2+, and Mg^2+ into the medium, whereas inhiited by adding Hg^2+, Zn^2+ and SDS. The K_m and V_max value of α-1,3 glucanase for IG were estimated to be 2.50 mM and 0.0431 mM/min, respectively. The thin layer chromatographic analysis of hydrolysates from IG with α-1,3 glucanase showed that glucose was the main product of reaction. This enzyme activity was about 14 times higher than marketing dextranase as preventive agent against artificial dental caries by S. mutans in TH medium including 5% sucrose after 30 minutes.

등숙 중인 보리 종실종 (1-3, 1-4)-β-Glucan과 전분 함량 및 이들의 가수분해효소 활성

윤성중,박상래,유남희 한국작물학회 1997 Korean journal of crop science Vol.42 No.4

취반용 보리 종실 내 (1-3, 1-4)-β-glucan의 축적기작을 알아보기 위하여 개화 후 일정 간격으로 보리 종실을 채취하여 (1-3, 1-4)-β-glucan 함량, (1-3, 1-4)-β-glucanase 활성 및 전분함량과 α -amylase 활성을 조사하였다. β-glucan 함량은 등숙 초기에 매우 낮았으나 개화 후 15~25일 사이에 급속히 증가하였고 개화 후 30일경에는 종실 건물중의 3.5~4%로 증가하였다. (1-3, 1-4)-β-glucanase 활성은 등숙 초기에 높았으며 등숙이 진전될수록 감소하였다. β-glucan 함량과 (1-3, 1-4)-β-glucanase 활성간에는 고도로 유의한 부의 상관관계가 인정되었으나 등숙 종실 중의(1-3, 1-4)-β-glucanase 활성이 매우 낮은 수준이므로 β-glucan 축적량에 크게 영향을 미치지 않을 것으로 추정되었다. 전분함량은 등숙이 진전됨에 따라 지속적으로 증가하였으며 개화 후 10~20일에 가장 뚜렷하게 증가하였다. 포도당함량은 등숙이 진전됨에 따라 현저히 감소하였으며, 등숙 초기와 중기에 감소 정도가 매우 컸다. α -amylase의 활성도 등숙이 진전됨에 따라 현저히 감소하였으며, 감소 정도는 등숙 초기와 중기에 매우 컸다. To obtain information on the accumulation of (1-3, 1-4)-β -glucans during kernel maturation, (1-3, 1-4)-β -glucan contents and (1-3, 1-4)-β -glucanase activities were determined in developing kernels of the two Korean cooking barley varieties, Neulssalbori and Saessalbori. (1-3, 1-4)-β -Glucan contents in kernels at 5 and 10 days after anthesis(DAA) were very low and the contents increased rapidly in kernels at 15 to 25 DAA. (1-3, 1-4)-β -Glucan content in kernels at harvest was about 3.5 to 4% of kernel dry matter. (1-3, 1-4)-β -Glucanase activities were relatively higher in younger kernels but the levels of the activity were very low compared with those in germinating kernels. A significant negative correlation was observed between (1-3, 1-4)-β -glucan contents and (1-3, 1-4)-β -glucanase activities. Low levels of (1-3, 1-4)-β -glucanase activites in kernels at 15 to 30 DAA, however, may indicate that (1-3, 1-4)-β -glucanases have little effect on the final content of (1-3, 1-4)-β -glucans in barley kernels. Starch contents and α -amylase activities were also determined in developing barley kernels. Starch contents increased rapidly as kernels matured and the content at harvest was about 60% of kernel dry matter. Relativley higher levels of α -amylase activities in kernels at the earlier developmental stage decreased rapidly as kernels matured.

녹맥아에서 추출한 $endo-{\beta}-1,3-glucanase$의 효소학적 성질

손봉수,성낙계,Son, Bong-Soo,Sung, Nack-Kie 한국응용생명화학회 1992 Applied Biological Chemistry (Appl Biol Chem) Vol.35 No.3

녹맥아로부터 $endo-{\beta}-1,3-glucanase$를 추출하여 각종 수지로써 정제하여 glucanase I과 glucanase II의 존재를 확인하였고, 정제한 두 효소의 특성에 대하여 실험한 결과, 두 정제 효소의 분자량은 각각 35,000과 28,000으로 추정되었으며 최적 pH는 5.5이었고 pH 안정 범위는 각각 달랐다. 두 정제효소의 최적 온도는 glucanase I, II 다 같이 $40^{\circ}C$이었으며 glucanase I에 비해 glucanase II가 열에 다소 안정하였다. 그리고 $AgNO_3$와 $HgCl_2$와 같은 화합물은 효소활성을 저해하였다. Laminarin을 기질로 하여 측정한 Km값은 glucanase I, II 각각 1.03 mg/ml, 1.20 mg/ml이었다. Two types of $endo-{\beta}-1,3-glucanases$ were purified from green malt and their basic characteristics were studied. Molecular weights of glucanase I and glucanase II were estimated, by electrophoresis, to be 35,000 and 28,000, respectively. Purified glucanase I and II showed the highest activity at pH $5.0{\sim}7.0$ and $5.0{\sim}8.0$, respectively. The optimal temperature of purified glucanase I and II was $40^{\circ}C$. Purified glucanase I and glucanase II were stable at $40^{\circ}$ for 60 min and at $50^{\circ}$ for 30 min. All enzymes were inactivited by $AgNO_3$ and $HgCl_2$ while those were not activated by various compounds tried. Km values of glucanase I and II were 1.03 mg/ml, 1.20 mg/ml, respectively.

Pyrococcus furiosus의 β-1,3-glucanase를 처리한 laminarin 분해 산물을 이용한 바이오 에탄올의 생산

Dong-Gyun Kim(김동균),Eun-Young Kim(김은영),Yu-Ri Kim(김유리),Joong Kyun Kim(김중균),Han-Seung Lee(이한승),In-Soo Kong(공인수) 한국생명과학회 2011 생명과학회지 Vol.21 No.1

갈조류 유래의 다당류인 laminarin을 기질로써 호열성 미생물인 Pyrococcus furiosus의 β-1,3-glucanase와 반응시킨 뒤, 분해산물을 yeast를 이용한 알코올 발효과정을 통하여 에탄올을 생산하고자 하는 연구를 수행하였다. 33 kDa (297 a.a, 894 bp)의 재조합 β-1,3-glucanase를 대장균에게 발현 후 순수하게 정제 하였으며, 정제한 β-1,3-glucanase와 laminarin을 반응시킨 결과 단당을 포함하여 oligo당 형태로 분해됨을 TLC와 HPLC로써 확인하였다. 그리고 이러한 분해산물을 에탄올 생산 배지의 유일한 탄소원으로써 첨가하여 yeast를 배양한 결과 48시간 뒤에는 세포 외로 최소 0.3%의 알코올을 생산함을 gas chromatography로써 확인하였다. 따라서 β-1,3-glucanase와 laminarin의 최적 분해반응 및 yeast의 최적 알코올 발효 조건을 확립한다면 본 연구의 방법을 이용한 해조류로부터의 bio-ethanol의 생산을 성공적으로 수행 할 수 있으리라고 판단된다. β-1,3-glucanase from Pyrococcus furiosus was applied for the saccharification of laminarin, which is a major oligo-saccharide component of brown algae, and the reaction mixture produced from laminarin was utilized as a substrate for alcohol fermentation using yeast. To prepare the recombinant β-1,3-glucanase, a β-1,3-glucanase gene was overexpressed in Escherichia coli and purified. Laminarin was degraded to an oligo- and mono-saccharide, such as glucose, after reaction with the purified recombinant β-1,3-glucanase, and the products after enzymatic treatment were confirmed by TLC and HPLC analysis. Decomposed laminarin after enzyme reaction was only added to the medium as a C-source for yeast alcohol production reaction. 0.3% alcohol production was detected from the cultured broth by gas chromatography after 48 hr of incubation. Further evaluation for optimal conditions of saccharification and alcohol fermentation can be suggested, as well as the possibility of using this enzymatic method to produce ethanol using laminarin.

Bacillus circulans β-1, 3-1, 4-glucanase 유전자의 고초균과 거대균에서의 클로닝 및 발현

김지연,이동석 인제대학교 1998 仁濟論叢 Vol.14 No.2

재조합 플라스미드 pLL200K에 함유된 Bacillus circluans ATCC21367 β-1,3-1,4-glucanase 유전자를 Pub110을 이용하여 shuttle 플라스미드 pLLS920을 만들면서 Bacillus 세포로 이동·발현시켰다. 고초균과 거대균으로 형질전환된 pLLS920은 β-1,3-1,4-glucanase를 실질적으로 생산하였는데 효소들은 세포증식과 비례하여 생산되었다. 형질전환주가 생산하는 β-1,3-1,4-glucanase의 최대활성을 유전자 공여균주인 B. circulans와 비교하여 보니, 고초균은 약 83배, 거대균은 약 7배 정도의 높은 활성을 나타내었다. 고초균이나 거대균 형질전환주가 생산하는 효소들은 대부분 성장배지로 분비되는 반면에 대장균 형질전환주의 경우에는 생산하는 전체효소의 10% 정도만이 분비되는 것을 알 수 있었다. 한편, activity staining을 통해 대장균과 고초균, 거대균에서 발현된 효소를 분석해 본 결과 분자량은 약 28,000으로 추정되었으며, 특히 고초균에서는 효소 단백질의 processing이 일어남을 관찰할 수 있었다. A Bacillus circulans ATCC21367 β-1,3-1,4-glucanase gene contained in a recombinant plasmid pLL200K was transferred into a new shuttle vector plasmid pLLS920 by ligating linearized DNAs of pLL200K and pUB110. B. subtilis RM125 and B. megaterium ATCC14945 transformed with pLLS920 produced the β-1,3-1,4-glucanase substantially. Most of the enzyme was produced during the exponential growth period. The maximum activities of the β-1,3-1,4-glucanase produced by the Bacillus transformants were compared with that of the B. circulans gene donor strain. The B. subtilis RM125(pLLS920) enzyme showed the activity 83 times higher than that of the gene donor cells, followed by the B. megaterium ATCC14945(pLLS920) enzyme with activity 7 times higher than that of the gene donor cells. Although all or most of the enzyme produced by the B. subtilis or B. megaterium was secreted into the culture broth, only about 10% of the total enzyme produced by the Escherichia coli transformant was detected in the culture supernatant. The activity staining of the enzyme produced in E. coli(pLLS920) or B. megaterium(pLLS920) indicated a molecular weight of about 28,000. The zymogram of the enzyme from B. subtilis(pLLS920), however, showed shortened band, suggesting proteolytic processing of the enzyme.

Saccharomyces cerevisiae에서 Aspergillus oryzae 유래의 exo-β-1,3- glucanase (laminarinase)의 생산 최적화

김민정(Min-Jung Kim),남수완(Soo-Wan Nam),Koichi Tamano,Masayuki Machida,김성구(Sung-Koo Kim),김연희(Yeon-Hee Kim) 한국생물공학회 2011 KSBB Journal Vol.26 No.5

In this study, a EXGA gene code for exo-β-1,3-glucanase from Aspergillus oryzae was overexpressed and secretory produced in Saccharomyces cerevisiae. To overexpress the β-1,3-glucanase, pGInu-exgA and pAInu-exgA plasmids having GAL10 and ADH1 promoter, respectively, and exoinulinase signal sequence (Inu s.s) were constructed and introduced in S. cerevisiae SEY2102 and 2805. The recombinant β-1,3- glucanase was successfully expressed and secreted into the medium and the β-1,3-glucanase activity in 2102/pGInu-exgA and 2102/pAInu-exgA strain were 5.01 unit/mL and 4.09 unit/mL, respectively. In the 2805/pGInu-exgA and 2805/pAInu-exgA strain, the β-1,3-glucanase activity showed 3.23 unit/mL and 3.22 unit/mL, respectively. Secretory efficiency in each strain reached 95% to 98%. Subsequently, the recombinant β-1,3-glucanase was used for ethanol production. Ethanol productivity in 2102/pAInu-exgA strain was 0.83 g/L when pre-treated Laminaria japonica which has initial reducing sugar of 1.4 g/L was used as substrate. It is assumed that the polysaccharides of Laminaria japonica was effectively saccharified by recombinant β-1,3-glucanase, resulting in increase of ethanol productivity. These results suggested that recombinant β-1,3- glucanase was efficiently overexpressed and secreted in S. cerevisiae SEY2102 as host strain by using ADH1 promoter-Inu s.s system.