PCR-DHPLC를 이용한 한국인 제2형 당뇨환자의 GCK와 HNF-1α의 유전자다형성 분석

남윤형,박대용,박상범,안영창,이상현,조민호,박수민,장원철,Nam, Youn-Hyoung,Park, Dae-Yong,Park, Sang-Bum,An, Young-Chang,Lee, Sang-Hyun,Cho, Min-Ho,Park, Su-Min,Jang, Won-Cheoul 대한화학회 2007 대한화학회지 Vol.51 No.6

MODY는 일반적으로 제 2 형 당뇨의 특수형으로 25세 이전에 발병하며 상염색체 우성으로 유전되 며 인슐린 분비장애를 특징으로 한다. GCK와 HNF-1α의 유전자 돌연변이는 제 2 형 당뇨에서 가장 큰 원인 중에 하나이다. 따라서 이들 유전자다형성의 연관성을 다양한 분석 방법으로 연구할 필요성이 대두되고 있다. GCK와 HNF-1α 유전자의 exon과 exon에 근접한 intron을 실험하였고, 또한 promotor까지 PCR-DHPLC (Polymerase Chain Reaction - Denaturing High Performance Liquid Chromatography) 방법과 direct sequencing 방 법을 사용하였다. 시료는 11명의 환자와 20명의 정상인에서 DNA를 추출하였고 GCK와 HNF-1α의 단일 염기 다형성을 PCR-DHPLC 방법으로 확인하였다. 결과적으로 GCK 유전자에서는 1개(R135G)를 검출하였고 HNF-1α 유전자에서는 2개(I27L, S487N)를 검출하였으며 intron 8에서도 돌연변이를 검출할 수 있었다. Maturity-onset diabetes of the young (MODY) is a genetically heterogeneous subtype of Type 2 diabetes characterized (non-insulin-dependent) by early onset, usually before 25 years of age, autosomal dominant inheritance and a primary defect in insulin secretion. Mutations in the glucokinase (GCK) and hepatocyte nuclear factor (HNF)-1α genes are the major causes of monogenic forms of Type 2 diabetes mellitus. Therefore it is need to study relation with these polymorphisms by diverse analysis methods. The promotor and coding regions inclusive intron exon boundaries of the GCK, HNF-1α genes were examined by PCR-DHPLC (Polymerase Chain Reaction - Denaturing High Performance Liquid Chromatography) and direct sequencing. We extracted DNA from 11 patients and 20 normals. Then we confirmed a single-nucleotide polymorphism using PCR-DHPLC. As results, we identified one mutation (R135G) in GCK gene and two mutations (I27L, S487N) in HNF-1a and at the same time detected mutation in intron 8.

B. cereus의 검출을 위한 칩-기반 실시간 PCR과 시험관-기반 실시간 PCR의 방법 비교

남윤형,안영창,박수민,조민호,서재원,윤일규,박상범,김종규,Nam, Youn-Hyoung,Ahn, Young-Chang,Park, Su-Min,Cho, Min-Ho,Seo, Jae-Won,Yoon, Il-Kyu,Park, Sang-Bum,Kim, Jong-Gyu 대한화학회 2008 대한화학회지 Vol.52 No.2

등온 증폭법을 이용한 결핵균의 빠른 검출 시스템 개발

안영창,남윤형,박수민,조민호,서재원,윤일규,박용현,장원철,Ahn, Young-Chang,Nam, Youn-Hyoung,Park, Su-Min,Cho, Min-Ho,Seo, Jae-Won,Yoon, Il-Kyu,Park, Yong-Hyun,Jang, Won-Cheoul 대한화학회 2008 대한화학회지 Vol.52 No.3

결핵은 전 세계적으로 심각한 공중보건문제로 남아있다. 최근에는 결핵의 발병률이 증가하고 있는 추세이며 이에 따른 결핵의 정확한 조기치료와 심각한 부작용, 그리고 전염을 방지하기 위해서는 신속하고 정확한 결핵의 진단이 절실하게 필요하다. 본 연구에서는 결핵유전자를 빠르게 검출하는데 있어서 등온증폭법이 가지고 있는 높은 특이성과 신속성에 대하여 평가하였다. 결핵 DNA의 순차적 10배위 정량희석 DNA를 사용하였으며 일반PCR 방법과 등온증폭법의 실험방법의 검출한계, 민감성, 특이성, 재현성을 비교하였다. 그 결과 등온 증폭법은 빠른 증폭 시간과 높은 민감성, 높은 특이성을 가지고 있었으며 병원이나 연구실, 진단 검사실 등에서 결핵유전자를 빠르고 정확하게 진단할 수 있는 유용한 방법이 될 수 있을 것이다. Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major worldwide public health problem. In recent years, the incidence of MTB has been rising. Rapid and reliable diagnosis of Mycobacterium tuberculosis is essential to initiate correct treatment, avoid severe complications, and prevent transmission. LAMP was used to develop a rapid and sensitive laboratory diagnostic system for the MTB. In this research, the loop-mediated isothermal amplification method (LAMP) that amplifies DNA with high specificity and rapidity at an isothermal condition was evaluated for rapid detection of MTB. Undiluted DNA (2.10 × 106 copy/mL), 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 and 10-6 (copy/mL) of MTB DNA were amplified by PCR and LAMP to determine the sensitivity of the assay. At results, the LAMP assay reported here has the advantages of rapid amplification, high sensitivity, and high specificity and will be useful for rapid and reliable clinical diagnosis of MTB in hospital clinical laboratory.

한국인 베체트 환자의 분자유전학적 연구

박상범,남윤형,박수민,이상현,안영창,조민호,김종규,최재구,김성규,장원철,Park, Sang-Bum,Nam, Youn-Hyoung,Park, Su-Min,Lee, Sang-Hyun,Ahn, Young-Chang,Cho, Min-Ho,Kim, Jong-Gyu,Choi, Jae-Gu,Kim, Seong-Kyu,Jang, Won-Cheoul 대한화학회 2007 대한화학회지 Vol.51 No.6

베체트 병은 여러 장기에서 발생하는 만성 염증성 질환이다. 베체트병에서 염증은 T-helper type 1 (Th1) 림프구에서 분비된 싸이토카인에 의해 유도된다. 베체트병의 발병원인이나 기전에 대해 확실히 밝 혀지지는 않았으나 유전적인 소인이 있는 사람에서 감염 등 환경적인 요인이 면역 반응에 이상을 일으켜 질병의 여러 증상이 발현된다. 주조직복합체(major histocompatibility complex, MHC)와 non-MHC gene 등 다양한 유전자들이 베체트병의 병인으로 관여한다. 이 연구에서는 HLA-B51, IL-18, SLC11A1, TNF-α의 유 전적 다형성이 한국인 베체트병의 감수성에 관여하는지를 확인하였다. 실험 결과, HLA-B51이 베체트병과 가장 연관성이 큰 유전인자로 나타났지만, HLA 분자가 베체트병의 직접접인 병인인지는 확실하지 않다. IL- 18은 베체트병 환자와 대조군 간에 연관성은 없었으나 안구병변을 가지고 있는 환자에서 -137 G/G 유전자 형이 높게 나타났다. SLC11A1 유전자에서 (GT)n의 다형성의 allele 3과 genotype allele 3/ allele 3이 한국 인 베체트병의 방어 효과를 갖는 것으로 추정된다. TNF-α gene의 유전자 다형성은 베체트병 감수성에 있 어서의 연관성을 찾지 못하였다. Behcet's disease (BD) is a chronic inflammatory disorder, involving several organs. Inflammation in the disease is thought to be mediated by cytokines derived from T-helper type 1 (Th1) lymphocytes. Although the exact pathogenesis for BD is not completely understood, it has been suggested that the disease is triggered in genetically susceptible individuals by environmental factors, such as microbial agents. It is noted that multiple genes, including MHC (major histocompatibility complex) and non-MHC genes, are implicated in the pathogenesis of BD. This study tries to determine whether HLA-B51, IL-18, SLC11A1 and TNF-α polymorphisms are associated with susceptibility to Behcet's disease in Koreans. As a results, HLA-B51 was a genetic factor with the strongest association with BD. But it is still uncertain whether this HLA molecule is directly involved in the pathogenesis of BD. Although the IL-18 gene polymorphisms were not associated with a susceptibility to BD in the Korean population, the patients carrying the GG genotype at position 137 had a higher risk of developing the ocular lesions. This study suggests that the allele 3 and the genotype allele 3 / allele 3 of 5'-promoter (GT)n polymorphism in the SLC11A1 gene may have a protective effect for the development of BD in the Korean population. There were no evidences for genetic association conferred by the TNF-α gene with respect to susceptibility to BD.

Micro-PCR과 Real-Time PCR을 이용한 B형 간염 바이러스 검출

강원,박상범,남윤형,안영창,이상현,장원철,박수민,김종완,정성춘,Kang, Won,Park, Sang-Bum,Nam, Youn-Hyoung,An, Young-Chang,Lee, Sang-Hyun,Jang, Won-Cheoul,Park, Su-Min,Kim, Jong-Wan,Chong, Song-Chun 대한화학회 2007 대한화학회지 Vol.51 No.1

B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus, HBV)는 만성감염, 간암의 원인이 되는 등 가장 큰 공중보건문제 중의 하나이다. 그리하여 감염 초기에 바이러스의 DNA 농도를 측정하여 관찰 하는 것이 중요하다. 본 연구에서는 기존의 Real Time-PCR과 새로운 방법인 Micro-PCR를 이용하여 HBV를 검출하였다. 단국대학교 병원에서 HBV 감염 환자의 혈청 샘플 120개를 얻은 후 분석하였고 각각 장비에서의 검출한계와 재현성, 민감성, 특이성, 분석시간을 비교해 보았다. 그 결과 Micro-PCR과 Real-Time PCR은 높은 검출한계와 재현성, 민감성, 특이성을 가지고 있었다. 그러나 Micro-PCR은 Real-Time PCR보다 빠른 시간 안에 증폭이 가능하며 조작하는데 있어 간편하였고 적은 양의 시약이 소모됨을 알 수 있었다. 그러므로 Micro-PCR은 신뢰성 있고 빠른 임상적 진단이나 각종 검사가 요구되는 곳에서 이용 가치가 높은 장비라 할 수 있겠다. Hepatitis B is a serious public health problem leading to chronic infection and liver cancer. Quantitation of circulating hepatitis B virus (HBV) is important for monitoring disease progression and for assessing the response to antiviral therapy. In this study, by using Real-Time PCR and novel Micro-PCR assay method, we measured HBV concentration in the clinical sample. A total of 120 serum samples from patients with HBV infection collected was in Dankook university hospital to compare the detection limit, sensitivity, specificity and reproducibility of the two assay methods. These findings of this study suggest that Micro-PCR and Real-Time PCR assay methods are comparable to each other in there detection limit, sensitivity, and reproducibility for HBV DNA quantitation. However, Micro-PCR assay is more efficient than Real-Time PCR method, because Real-Time PCR is not so time - consuming, technically easy and need to reagent of a small quantity. It will be useful for rapid and reliable clinical diagnosis of HBV in many countries.

SSCP와 DHPLC에 의한 β₂-교감신경수용체 유전자의 돌연변이 분석

박상범,한상만,남윤형,장원철,Park, Sang-Bum,Han, Sang-Man,Nam, Youn-Hyoung,Jang, Won-Cheoul 한국분석과학회 2004 분석과학 Vol.17 No.1

현재 일반적으로 많이 사용되는 single strand conformation polymorphism (SSCP)나 denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)같은 돌연변이 검출법은 많은 시간과 비용, 그리고 노동력이 소모된다는 단점과 실험자의 실험에 대한 숙련도에 의해 실험 결과가 달라지는 한계점을 가지고 있다. 이런 단점들을 보완하기 위하여 ion-pair reversed phase chromatography (IP-RPC)방식을 이용한 denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC)방법을 사용하여 기관지 천식 (bronchial asthma)을 조절하는 베타2-교감신경수용체 유전자의 돌연변이를 검출하였다. 80명의 천식 환자의 혈액에서 genomic DNA를 추출하여 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction)을 이용해 증폭하고, 그 산물을 SSCP와 DHPLC로 분석하였다. 그 결과, 베타2-교감신경수용체 유전자에서 SSCP는 80명의 sample 가운데 19개 (23.75%)의 돌연변이를 검출하였고, DHPLC는 25개 (31.25%)의 변이를 검출하였다. 돌연변이 검출법으로 DHPLC 분석법이 SSCP보다 더 빠르고 효과적인 방법임을 확인하였다. Up to now, methods for the detection of genetic alterations as single strand conformation polymorphism (SSCP) or denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) have been used. It is too labor-intensive and expensive to serve for routine analysis. Moreover, lower in its sensitivity and specificity being also strongly dependent on the experience of the investigater. To improve these problems, we analysed mutation of ${\beta}_2$-adrenergic receptor gene that controls bronchial asthma by denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) according to ion-pair reversed phase chromatography (IP-RPC). We extracted genomic DNA from 80 asthma patients and then amplified DNA using PCR and analysed PCR product by SSCP and DHPLC. As a result, we analysed mutation frequency is 19 (23.75%) on SSCP and 25 (31.25%) on DHPLC in ${\beta}_2$-adrenergic receptor gene. We conclude that DHPLC is a fast and simple screening method rather than SSCP analysis.

대장암에서 PCR-SSCP와 DHPLC를 이용한 p53 돌연변이의 검출

박상범,한상만,남윤형,장원철,Sang-Bum Park,Sang-Man Han,Youn-Hyoung Nam,Won-Cheoul Jang 대한화학회 2003 대한화학회지 Vol.47 No.5

p53 유전자의 변이는 다양한 인체암 중 가장 일반적인 유전자적 변화로 알려져 있으며, 양성에서 악성 대장암으로 전이되는 과정에서 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 PCR-SSCP와 DHPLC를 이용하여 대장암 환자의 조직에서 p53 유전자의 엑손 5-8에서 돌연변이를 분석하였다. SSCP에서는 50개의 샘플중 엑손 5에서 C13109>T 형태의 돌연변이가 7례가(14%) 발견되었고, DHPLC에서는 C13109>T 7례와 C13202>A, C13204>G 형태의 돌연변이 2례, 모두 9례의(18%) 변이가 검출되었다. DHPLC 분석법을 이용하여 SSCP에서 발견하지 못했던 2례(4%)의 변이를 더 발견하였다. 최종적으로 염기서열분석법을 통해 위의 결과를 확인하였고, p53 돌연변이 검출법으로 SSCP보다 DHPLC가 더 감도가 좋고 효과적인 검출법임을 확인하였다. Structural alteration of p53 and overexpression of p53 protein are the most common genetic abnormalities in various kinds of human cancer. Mutations in the p53 tumor-suppressor gene are usually associated with an advanced development of colorectal cancer characterized by the transition from the adenoma to carcinoma stage. Mutations in exons 5-8 of the p53 gene were analyzed by the polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP) and denaturing high performance liquid chromatography(DHPLC). SSCP analysis detected 7 mutations(C13109>T) in 50 colorectal cancer samples(14%) at exon 5, and DHPLC analysis detected 7 mutations (C13109>T) and 2 mutation(C13202>A, C13204>G) in 50 colorectal cancer samples(18%) at exon 5. All of 9 mutations were proved by sequencing analysis. We conclude that DHPLC is a highly sensitive and specific method for p53 gene mutations.

두경부 종양에서 DHPLC를 이용한 p53체세포 돌연변이 검출 연구

김광열,박상범,한상만,남윤형,장원철,Kim, Kwang-Youl,Park, Sang-Bum,Han, Sang-Man,Nam, Youn-Hyoung,Jang, Won-Cheoul 대한화학회 2004 대한화학회지 Vol.48 No.1

두경부 편평 세포암종(HNSCC: head and neck squamous cell carcinoma) 의 발생과 관련하여 p53 종양 억제 유전자 (tumor suppressor gene) 의 돌연변이는 높은 비율로 나타나는 것으로 보고 되고 있다. 단국대학교 병원에서 두경부 종양으로 진단 받고 수술 받은 환자의 조직 50개를 대상으로 p53 종양 억제 유전자의 exon 5-8 까지의 영역에서 DNA를 추출하여 PCR-SSCP(polymerase chain reaction single strand conformational polymorphism) 방법과 DHPLC(denaturing high performance liquid chromatography) 방법으로 p53체세포 돌연변이(somatic mutation)를 비교 분석하였다. 그 결과 SSCP 분석 방법은 16개(32%), DHPLC 분석 방법은 17개(34%) 를 검출하였고 그 중 SSCP와 DHPLC 분석 방법 모두 exon 8번에서 결실(deletion) 형태의 돌연변이를 확인하였으며 최종적으로 자동 염기 서열 분석기(automatic DNA sequencer) 를 통하여 모든 돌연변이를 확인하였다. DHPLC 분석방법이 SSCP 방법보다 분석 시간이나 노력이 덜 소모되며 보다 더 정확한 돌연변이 검출 방법임을 확인하였다. Mutation of p53 tumor suppressor gene in HNSCC (head and neck squamous cell carcinoma) has been proposed high rate. We extracted genomic DNA from 50 head and neck cancer. The DNA was amplified by PCR at exon 5-8 in p53 tumor suppressor gene. We have compared single strand conformation polymorphism (SSCP) and denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) method for analysis of p53 somatic mutation. As a result, 16 deleted mutations (32%) were detected by SSCP analysis and 17 deleted mutations (34%) were detected by DHPLC analysis at exon 8. All of 17 mutations were proved by sequencing. We conclude that DHPLC is a fast and simple screening method rather than SSCP analysis.

변성 고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 한우, 젖소 그리고 혼입육의 구분

안영창,조민호,서재원,윤일규,정덕현,이은영,남윤형,박수민,장원철,Ahn, Young-Chang,Cho, Min-Ho,Seo, Jae-Won,Yoon, Il-Kyu,Jung, Duck-Hyun,Lee, Eun-Young,Nam, Youn-Hyoung,Park, Su-Min,Jang, Won-Cheoul 대한화학회 2009 대한화학회지 Vol.53 No.6

In the meat industry, correct breed information in food labeling is required to assure meat quality. Genetic markers provide corroborating evidence to identify breed. We described the development of DNA markers to discriminate between Korean beef cattle (Hanwoo), Holstein, and mixed cow beefs. As most breeds are standardized for coat colour, the melanocortin 1 receptor (MC1R) gene, involved in the regulation of eu/pheomelanins synthesis, has been suggested as marker for breed traceability of products of animal origin. We also designed sex-determining region Y (SRY) gene specific primers for Y chromosome detection. In this study, fragments of MC1R gene and SRY gene were amplified by multiplex-PCR and subjected to digestion by MspA1I restriction endonuclease. Reaction products were analysised by denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC). As a result, we identified 6 DHPLC peak types from MC1R gene and SRY gene analysis. DHPLC method showed more sensitive than RFLP method for DNA fragments analysis. Therefore, DHPLC method can apply to identify for Hanwoo, Holstein and mixed beef. 정육 사업에서 고기의 원산지와 종을 표기 하는 것은 육질의 판단에 영향을 미친다. 유전자 마커는 종을 판별하기 위한 증거로 사용되므로, 우리는 한우와 젖소 그리고 혼입육을 판단 할 수 있는 유전자 마커의 개발 계획을 수립하였다. 소의 모든 종은 모색 유전자에 의하여 그 종이 결정 되며 모색 유전자의 조절에 의하여 유멜라닌 또는 페오멜라닌이 합성되고, 이로 인하여 모색에 차이가 생기는 점을 이용하여, 종을 판별하는 유전자 마커로 사용된다. 암소와 수소를 판별하기 위하여 Y 염색체 상에 존재하는 성 결정 부위 유전자에 대응하는 프라이머를 제작하였다. 본 연구에서는 모색 유전자와 성 결정 유전자를 다중 중합효소연쇄반응(multiplex-PCR)을 이용하여 증폭하였고, 증폭 산물을 제한 효소 MspA1I로 소화 시켰다. 이 반응물을 변성 고성능 액체 크로마토그래피(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)를 이용하여 분석하였다. 분석 결과 6가지의 크로마토그램을 확인 할 수 있었고, DHPLC 분석 방법은 한우, 젖소 그리고 혼입육을 쉽게 구별해 낼 수 있었다.

[화학] SSCP와 DHPLC에 의한 β₂-교감신경수용체 유전자의 돌연변이 분석

박상범(Sang-Bum Park),한상만(Sang-Man Han),남윤형(Youn-Hyoung Nam),장원철(Won-Cheoul Jang) 한국분석과학회 2004 분석과학 Vol.17 No.1