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Bacillus stearothermophilus KJ16이 생산하는 Cyclodextrin Glucanotransferase 의 정제와 효소특성
권현주,남수완,김광현,송승구,윤종원,김병우,Kwon, Hyun-Ju,Nam, Soo-Wan,Kim, Kwang-Hyun,Song, Seong-Koo,Yun, Jong-Won,Kim, Byung-Woo 한국생명과학회 1998 생명과학회지 Vol.8 No.3
Cyclodextrin glucanotransferase from B. stearothermophilus KJ16 that can produce both cyclodextrin glucanotransferase and cyclodextrinase was purified by ammonium sulfate precipitation, DEAE-cellulose chromatography, Sephadex G-100 chromatography, and FPLC. The molecular weight of the purifice enzyme was about 65,000 dalton by SDS-PAGE. The optimal pH and temperature were 6.0 and $60^{\circ}C$, respectively. The enzyme was stable at $50^{\circ}C$ for 1 hr and in the pH range of 5.5 and 8.5. Mercaptoethanol and dithiothreitol inhibited the enzyme activity strongly. The enzyme produced 60% cyclodextrin(CD) from 5% soluble starch with the $^{\alpha}$, $^{\beta}$, $^{\gamma}$-CD ratio of 42:46:12. Amylopectin was the most suitable substrate with 67% conversion to CD.
고온.내산성 Bacillus sp. SJ-15를 이용한 음식물 쓰레기의 호기적 퇴비화
김춘희,남수완,최우봉,이종환,강병원,김회수,전숭종,Kim, Choon-Hee,Nam, Soo-Wan,Choi, Woo-Bong,Lee, Jong-Hwan,Kang, Byoung-Won,Kim, Hweh-Su,Jeon, Sung-Jong 한국생명과학회 2007 생명과학회지 Vol.17 No.5
고온 내산성 미생물을 퇴비에서 분리하고, 생리 및 생화학적 특성을 조사하여 Bacillus sp. SJ-15로 명명하였다. 생장을 위한 최적 온도와 pH는 각각 $55^{\circ}C$와 5.0 이었다. 분리된 SJ-15 균주는 음식물쓰레기의 고온 고속 퇴비화 공정에 적용하였다. 퇴비화 과정에서 16시간 만에 최대 생균수인 $9.2{\times}10^9/ml$를 나타내었다. 본 퇴비화 공정은 개시 100일 후에 약 88%의 감량율을 나타내었고, 퇴비성분의 농도를 분석한 결과 본 공정을 통해 생산된 퇴비는 염분을 제외하면 유기질 비료의 기준을 모두 만족하는 것으로 나타났다. A thermoacidophilic bacterium was isolated from the compost and designated as Bacillus sp. SJ-15 by physiological and biochemical characteristics. The optimum temperature and pH for growth were at $55^{\circ}C$ and pH 5.0, respectively. The strain SJ-15 was adapted in process of accelerated high-temperature composting of garbage. The highest viable cell count of composting process reached to $9.2{\times}10^9/ml$ in 16 hours. After running times of 100 days, the composting process showed a reduction rate of approximately 88%, and the concentrations of components were sufficiently high or low to satisfied the standard of organic compost except for salinity.
Saccharomyces cerevisiae와 Pichia pastoris에서 Bovine Pancreatic Deoxyribonuclease I의 과발현과 특성
조은수 ( Eun Soo Cho ),김정환 ( Jeong Hwan Kim ),윤기홍 ( Ki Hong Yoon ),김연희 ( Yeon Hee Kim ),남수완 ( Soo Wan Nam ) 한국미생물생명공학회(구 한국산업미생물학회) 2012 한국미생물·생명공학회지 Vol.40 No.4
본 연구에서는 S. cerevisiae와 P. pastoris에서 bovine pancreatic (bp-) DNase I의 과발현과 재조합 DNase I의 특성을 조사하였다. bp-DNase I 유전자는 GAL10 promoter, MFα, GAL7 terminator 사이에 삽입하여 재조합 plasmid인 pGAL-MFα-DNaseI (6.4 kb)를 구축하였다. 그리고 bp-DNase I 유전자를 AOX1 promoter, MFα, AOX1 terminator에 삽입하여 재조합 plasmid인 pPEXI (8.8 kb)를 구축하였다. 재조합 plasmid인 pGAL-MFα-DNaseI과 pPEXI를 각각 S. cerevisiae와 P. pastoris 숙주세포에 형질전환시켰다. 형질전환된 효모세포들을 galactose와 methanol 배지에서 30oC, 48시간 배양하면 bp-DNase I은 대부분이 배양 상등액으로 과발현되었다. P. pastoris 형질전환체는 배양 상등액에서 45.5 unit/mL의 DNase I 활성을 보였으며, 반면에 S.cerevisiae 형질전환체는 37.7 unit/mL의 DNase I 활성을 보였다. 또한 DNA 분해 특성을 조사한 결과, P. pastoris 재조합 DNase I으로 기질 DNA(calf thymus)를 처리하였을 때 1분 이내 DNA가 분해되는 것을 확인할 수 있었으며 이는 상업용 bp-DNase I과 S. cerevisiae 재조합 DNase I으로 처리했을 때보다 빠른 분해 패턴을 보였다. In the present study, we investigated the overexpression and characterization of bovine pancreatic (bp)- DNase I in Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris. The bp-DNase I gene was fused in frame with the GAL10 promoter, MFα, and GAL7 terminator sequences, resulting in the plasmid, pGAL-MFα-DNaseI (6.4 kb). Also, the bp-DNase I gene was fused in frame with the AOX1 promoter, MFα, and AOX1 terminator sequences, resulting in the plasmid, pPEXI (8.8 kb). The recombinant plasmids, pGAL-MFα-DNaseI and pPEXI were introduced into S. cerevisiae and P. pastoris host cells, respectively. When the transformed yeast cells were cultured at 30oC for 48 h in galactose or methanol medium, bp-DNase I was overexpressed and the most of activity was found in the extracellular fraction. P. pastoris transformant activity showed 45.5 unit/mL in the culture medium at 48 h cultivation, whereas S. cerevisiae transformant revealed 37.7 unit/mL in the extracellular fraction at 48 h cultivation. The enzymatic characteristics, such as DNA cleavage and half life were investigated. Treatment of the recombinant DNase I from P. pastoris induced degradation of the calf thymus DNA within 1 minute, and this DNA degradation rate was higher than that of commercial bp-DNase I (SIGMA) and the recombinant DNase I from S. cerevisiae.
김현철,김정현,전숭종,최우봉,남수완,Kim Hyun-Chul,Kim Jeong-Hyun,Jeon Sung-Jong,Choi Woo-Bong,Nam Soo-Wan 한국생명과학회 2005 생명과학회지 Vol.15 No.3
Paenibacillus macerans 유래의 cycloinulooligosaccharide fructanotransferase (CFTase) 유전자(cft)를 Saccharomyces cerevisiae SEY2102에 발현시키기 위해 대장균과 효모의 shuttle vector인 pYES2.0에 subcloning 하였다. 구축된 pYGECFTN (8.6 kb) plasmid를 S. cerevisiae SEY2102에 형질전환하였고, uracil이 결핍된 SD 배지에서 선별하였다. cft 유전자는 선별된 형질전환체(S. cerevisiae SEY2102/pYCECFTN)에서 GAL1 promoter 조절하에 성공적으로 발현되어 cyclofructan(CF)을 생성함을 TLC로 확인하였다. 그러나, 균체 외로의 효소 분비는 이루어지지 않았고 cytoplasm보다 periplasmic space에 많이 존재하였다 S. cerevisiae에서 발현된 P. polymyxa유래 CFTase보다 P. macerans 유래 CFTase의 CF 생성이 image analyzer로 확인한 결과, 더 많음을 알 수 있었다. 효소반응 5분째부터 CF가 생성됨을 확인하였고, 최적온도와 최적 pH는 각각 $45^{\circ}C$와 pH 8.0로 나타났으며, $55^{\circ}C$까지 효소활성이 안정적으로 유지되었다. Dahlia tubers, chicory root, Jerusalem artichoke 등의 inulin 기질에 따른 반응산물 분석 결과, 모든 기질로부터 CF가 생산되었으며, dahlia tubers와 Jerusalem artichoke로부터 가장 효과적으로 생성되었다. The cycloinulooligosaccharide fructanotransferase (CFTase) gene (cft) from Paenibacillus macerans was subcloned into an E. coli-yeast shuttle vector, pYES2.0, resulting in pYGECFTN. The plasmid pYGECFTN (8.6 kb) was introduced into Saccharomyces cerevisiae SEY2102 cells and then the transformants were selected on the synthetic defined media lacking uracil. The cft gene expression in yeast transformant was demonstrated by the analyses cyclofructan (CF) spots on thin-layer chromatogram. The recombinant CFTase was not secreted into the medium and localized in the periplasmic space. The production of CF was observed after 5 min of the enzymatic reaction with inulin. The optimun pH and temperature for CF production were found to be at pH 8.0 and $45^{\circ}C$, respectively. Enzyme activity was stably maintained up to $55^{\circ}C$. The CF was produced from all inulin sources and was most efficiently produced from dahlia tubers and Jerusalem artichokes.
배유진,장경진,전숭종,남수완,이재형,김영만,김동은,Bae, Yu-Jin,Jang, Kyoung-Jin,Jeon, Sung-Jong,Nam, Soo-Wan,Lee, Jae-Hyung,Kim, Young-Man,Kim, Dong-Eun Korean Society of Life Science 2007 생명과학회지 Vol.17 No.2
이 연구의 목적은 대장균 분자 샤페론 GroEL의 시험관 내 단백질 접힘에 있어서 반응온도의 영향과 보조샤페론의 필요 여부를 자발적 재접힘이 가능한 온도와 그렇지 않은 온도조건에서 조사하는 것이다. 여러 조건하에서 GroEL에 의한 두 가지 기질 단백질의 재접힘을 반응속도론적으로 조사하기 위하여 GroEL에 의한 단백질 침전생성억제와 변성된 단백질의 재접힘을 광범위하게 조사하였다. 자발적 재접힘이 가능하지 않은 $37^{\circ}C$에서는 ATP와 완전한 GroEL 시스템이 변성된 폴리펩티드의 재접힘을 위하여 필요하다는 것을 확인하였다. 하지만, 자발적 재접힘이 가능한 낮은 온도에서는 자발적 재접힘과 샤페론 의존적 단백질 재접힘이 서로 경쟁하는 것을 알 수 있었다. 따라서 GroEL은 변성된 폴리펩티드의 자발적 접힘 경로를 더 효율적인 단백질 재접힘 경로인 샤페론 의존적 단백질 재접힘 경로로 유도하는 것으로 보인다. The goal of this study is to investigate effects of temperature and co-chaperonin requirement for in vitro protein refolding assisted by E. coli chaperone GroEL under permissive and nonpermissive temperature conditions. In vitro protein refolding of two denatured proteins was kinetically investigated under several conditions in the presence of GroEL. Effects of temperature and GroES-requirement on the process of prevention of protein aggregation and refolding of denatured protein were extensively monitored. We have found that E. coli GroEL chaperone system along with ATP is required for invitro refolding of unfolded polypeptide under nonpermissive temperature of $37^{\circ}C$. However, under permissive condition spontaneous refolding can occur due to lower temperature, which can competes with chaperone-mediated protein refolding via GroEL chaperone system. Thus, GroEL seemed to divert spontaneous refolding pathway of unfolded polypeptide toward chaperone-assisted refolding pathway, which is more efficient protein refolding pathway.