RraB의 발현에 따른 대장균의 성장 저해의 원인 규명

류상미,염지현,고하영,신은경,이강석,Ryou, Sang-Mi,Yeom, Ji-Hyun,Go, Ha-Young,Shin, Eun-Kyoung,Lee, Kang-Seok 한국미생물학회 2010 미생물학회지 Vol.46 No.2

RNase E는 대장균 내에 있는 수많은 RNA의 분해와 가공에 관여하며, 또한 RNA 대사 작용에 관련된 거대한 단백질 복합체인 데그라도좀을 구성하는 중요한 효소로 알려져 있다. RraA와 RraB는 최근에 밝혀진 RNase E의 단백질 저해제이며, 진화적으로 잘 보존되어 있다. 이 연구에서는 RraA를 발현 시킬 때와는 달리 세포 내에서 RraB를 발현 시키면, RNase E의 과발현에 따른 세포의 성장 저해를 회복시키지 못하고 더 저해하는 것을 확인하였다. 이 현상이 RraA와 RraB가 세포내 RNase E의 기질들에 대해 특이적으로 영향을 미치기 때문인지를 알아보기 위해 세 개의 RNase E 기질을 분석하였다. 그 결과, ColE1-타입 플라스미드의 복제수를 조절하는 RNA I과 라이보좀 단백질 S15를 코딩하는 rpsO mRNA의 경우 RraA가 RraB 보다 효과적으로 RNase E의 활성을 저해하며, RNase P의 RNA 구성요소의 전구체인 pM1 RNA에 대한 RNase E의 효소 활성은 RraB가 저해하지 못하는 것을 관찰하였다. 이 결과는 RraB가 RraA보다는 높은 기질 특이적으로 RNase E의 효소활성을 저해하며, 이러한 이유로 RNase E의 과발현에 의한 세포의 성장 저해를 RraB의 과발현으로 극복할 수 없었다고 추론할 수 있다. RNase E plays a major role in the degradation and processing of a large number of RNA transcripts in Escherichia coli and forms the core component of the degradosome, a large protein complex involved in RNA metabolism. RraA and RraB are recently discovered protein inhibitors of RNase E and are evolutionarily conserved. In this study, we observed that, unlike RraA, overexpression of RraB did not rescue growth arrest of E. coli cells overexpressing RNase E. To examine whether this phenomenon stems from differential inhibitory effects of RraA and RraB on RNase E substrates, we analyzed three in vivo RNase E substrates. The results showed that RraA inhibited RNase E activity more efficiently than RraB on the degradation of RNA I, which controls the copy number of ColE1-type plasmid, and rpsO mRNA encoding ribosomal protein S15, while RraB was unable to inhibit the processing of pM1 RNA, a precursor of the RNA component of RNase P, by RNase E. Our results imply that RraB inhibits RNase E activity in a more substrate-dependent manner than RraA and this property of RraB may explain why overexpression of RraB could not rescue cells overexpressing RNase E from growth arrest.

Streptomyces coelicolor의 RraA 동족체인 RraAS2에 의한 Escherichia coli RNase E 활성조절

안상미,신은경,염지현,이강석,Ahn, Sang-Mi,Shin, Eun-Kyoung,Yeom, Ji-Hyun,Lee, Kang-Seok 한국미생물학회 2008 미생물학회지 Vol.44 No.2

최근 Escherichia coli에서 RNA의 분해와 가공과정에 중추적인 역할을 하는 리보핵산 내부분해효소인 RNase E의 효소활성을 조절하는 단백질 조절자인 RraA가 밝혀졌으며, 이 단백질은 E. coli RNase E의 효소활성 부위와 36%의 유사성을 가지는, Streptomyces coelicolor RNase ES의 효소활성을 조절하는 것으로 알려져 있다. S. coelicolor의 유전체에는 RraA와 아미노산 서열이 35.4% 이상 유사한 단백질을 코딩하는 유전자가 두 개 존재하는데, 그 중 하나인 rraAS2를 클로닝하여 E. coli RNase E의 효소활성을 조절하는지를 알아보았다. 그 결과 세포내에서 RraAS2를 발현시키면 RNase E의 과발현에 의해 저해된 세포의 생장을 RraA와 같이 효과적으로는 아니지만, 어느 정도 복원시키는 것을 확인하였다. 또한 RraAS2가 발현됨으로서 RNase E의 과발현에 의해 증가된 ColE1-타입 플라스미드의 복제 수를 14% 감소시키는 것을 관찰하였다. 이러한 결과는 RraAS2가 RNase E의 RNA I분자에 대한 효소 활성을 저해하는 능력을 가지고 있음을 시사한다. 동일한 배양조건에서 E. coli 세포내에서의 RNase E에 대한 RraAS2의 상대적인 발현양이 RraA에 비해 6.2배 낮은 것을 확인하였고, 이로 인해 RraAS2가 RNase E의 과발현에 의한 세포 생장의 저해를 복원하는데 필요한 모든 RNA의 가공과 분해속도를 효과적으로 조절하지는 못한다는 것을 추론할 수 있다. RraA is a recently discovered protein inhibitor that regulates the enzymatic activity of RNase E, which plays a major role in the decay and processing of RNAs in Escherichia coli. It has also been shown to regulate the activity of RNase ES, a functional Streptomyces coelicolor ortholog of RNase E, which has 36% identity to the amino-terminal region of RNase E. There are two open reading frames in S. coelicolor genome that can potentially encode proteins having more than 35.4% similarity to the amino acid sequence of RraA. DNA fragment encoding one of these RraA orthologs, designated as RraAS2 here, was amplified and cloned in to E. coli vector to test whether it has ability to regulate RNase E activity in E. coli cells. Co-expression of RraAS2 partially rescued E. coli cells over-producing RNase E from growth arrest, although not as efficiently as RraA, induced by the increased ribonucleolytic activity in the cells. The copy number of ColEl-type plasmid in these cells was also decreased by 14% compared to that in cells over-producing RNase E only, indicating the ability of RraAS2 to inhibit RNase E action on RNA I. We observed that the expression level of RraAS2 was lower than that of RraA by 4.2 folds under the same culture condition, suggesting that because of inefficient expression of RraAS2 in E. coli cells, co-expression of RraAS2 was not efficiently able to inhibit RNase E activity to the level for proper processing and decay of all RNA species that is required to restore normal cellular growth to the cells over-producing RNase E.

SecM에서 유래한 접착펩타이드에 의한 라이보솜 정지를 우회하는 SSU rRNA 돌연변이체 발굴을 위한 유전학적 시스템 개발

하혜정,김홍만,염지현,이강석,Ha, Hye-Jeong,Kim, Hong-Man,Yeom, Ji-Hyun,Lee, Kang-Seok 한국미생물학회 2008 미생물학회지 Vol.44 No.4

최근 단백질 합성 과정 중 라이보솜의 일시적인 정지에 의한 라이보솜의 A자리에서 전사체가 분해되는 현상이 여러 생명체에서 보고되었다. 이러한 현상이 라이보솜의 작은 소단위체를 이루고 있는 SSU rRNA의 기능과 관련 있는지를 알아보기 위해, SecM에서 유래한 접착펩타이드에 의한 라이보솜 정지를 우회하는 SSU rRNA 돌연변이체 발굴을 위한 유전학적 시스템을 개발하였다. 이 시스템에서는 SecM에서 유래한 접착펩타이를 포함하는 CAT 단백질을 코딩하는 CAT-SecM 전사체가 플라스미드에서 유래한 SSU rRNA를 포함한 재조합 라이보솜에 의해서만 해독된다. 이러한 재조합 라이보솜은 접착펩타이드를 합성한 후 CAT-SecM mRNA 상에서 일시 정체하며, 재조합 라이보솜의 발현은 이 전사체의 양을 감소시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 개발된 시스템을 이용해 라이보솜 검지를 우회하는 SSU rRNA 돌연변이체의 선별이 가능하다는 것을 보여주며, 이러한 변이체에 대한 연구는 단백질 합성 단계에서 일어나는 라이보솜 정지와 전사체 절단 현상에 있어서, SSU rRNA의 역할을 규명하는데 기여할 것이다. Ribosome stalling by nascent sticky peptide has been reported in several organisms across the kingdom. To test whether small subunit (SSU) rRNA is involved in this phenomenon, we developed a genetic system that utilized the specialized ribosome system to isolate SSU rRNA mutants that enable ribosomes to bypass the SecM-derived sticky peptide in protein synthesis. In this system, CAT-SecM mRNA, which encodes CAT protein containing the sticky peptide derived from SecM, is only translated by specialized ribosomes. These ribosomes were shown to transiently stall on CAT-SecM mRNA followed by the synthesis of the sticky peptide. Expression of specialized ribosomes resulted in the decreased steady-state level of CAT-SecM mRNA, which is consistent with a notion that ribosome stalling induces mRNA degradation. Isolation and characterization of SSU rRNA mutations using this genetic system that are sufficient to circumvent ribosome stalling induced by the SecM-derived sticky peptide will provide evidence of SSU rRNA function in mRNA cleavage.

혼합물 실험계획과 다수 반응변수 최적화를 통한 속경화 초저온접착제 개발 사례

변재현 ( Jai Hyun Byun ),서판석 ( Pan Seok Seo ),신지은 ( Ji Eun Shin ),이륜규 ( Lyun Gyu Lee ),염지현 ( Ji Hyun Yeom ) 한국품질경영학회 2014 품질경영학회지 Vol.42 No.4

Purpose: In this paper we present a case study of developing fast curing adhesives for insulation material of LNG carriers using an extreme vertices design with four mixture components. Three material properties are considered . shear strength, viscosity, and tensile strength. In the optimization experiment, we used hardness instead of tensile strength due to shortage of specimens. Methods: We employ four-factor extreme vertices design with 19 runs and desirability function approach for simultaneously optimizing three responses. After selecting optimal condition of the mixture components, we do confirmation experiments to verify the reproducibility of the optimal condition under manufacturing circumstance. Results: Simultaneous optimal condition for the three responses, that is, shear strength, viscosity, and harness is obtained. At the optimal condition, confirmation experiments are executed in manufacturing circumstance. The variation for the shear strength is not satisfactory, which is due to the variation of the humidity. Conclusion: At the optimal condition three material properties are satisfactory. To reduce the variability for the shear strength, robust design is needed.

Implications of Streptomyces coelicolor RraAS1 as an activator of ribonuclease activity of Escherichia coli RNase E

허지훈,서소진,이보은,염지현,이강석,Heo, Jihune,Seo, Sojin,Lee, Boeun,Yeom, Ji-Hyun,Lee, Kangseok The Microbiological Society of Korea 2016 미생물학회지 Vol.52 No.3

RNase E (Rne) is an essential enzyme involved in the processing and degradation of a large portion of RNAs in Escherichia coli. The enzymatic activity of RNase E is controlled by regulators of ribonuclease activity, namely, RraA and RraB. Gram-positive bacterium Streptomyces coelicolor also contains homologs of Rne and RraA, designated as RNase ES (Rns), RraAS1, and RraAS2. In the present study, we investigated the effect of S. coelicolor RraAS1 on the ribonucleolytic activity of RNase E in E. coli. Coexpression of RraAS1 with Rne resulted in the decreased levels of rpsO, ftsZ, and rnhB mRNAs, which are RNase E substrates, and augmented the toxic effect of Rne overexpression on cell growth. These in vivo effects appeared to be induced by the binding of RraAS1 to Rne, as indicated by the results of co-immunoprecipitation analysis. These results suggested that RraAS1 induces ribonucleolytic activity of RNase E in E. coli. RNase E는 대장균(Escherichia coli)에서 수많은 RNA의 가공 및 분해에 관여하는 필수적인 효소이다. RNase E의 효소 활성은 RraA와 RraB에 의해 조절된다. 그람양성균인 Streptomyces coelicolor는 RNase ES, RraAS1, RraAS2라고 명명되는 RNase E와 RraA의 동족체를 가지고 있다. 이 연구에서는 S. coelicolor 유래의 RraAS1이 E. coli에서 RNase E의 효소활성을 저해하는지 연구하였다. 대장균에서 RraAS1의 발현은 RNase E의 과발현에 의해 감소된 세포생장을 더욱 저하시켰으며, RNase E의 기질인 rpsO, ftsZ, rnhB mRNA의 양을 감소시키는 것을 확인 하였다. 이러한 RraAS1의 효과는 공동면역침전실험을 수행한 결과에서 유추할 수 있듯이, Rne 단백질과 RraAS1의 결합으로 유도되는 것으로 보인다. 이러한 결과는 RraAS1이 대장균에서 RNase E의 리보핵산 가수분해 활성을 유도함을 시사한다.

SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell에서 에스트로겐의 신경세포 보호효과에 대한 기전

염지현,김희,홍현석,방오영,허균,묵인희 대한치매학회 2003 Dementia and Neurocognitive Disorders Vol.2 No.1

Apoptosis is one major mechanism underlying neuronal cell death in degenerative diseases in the central nervous system. Previous studies have shown that estrogen has neuroprotective effects in several neuronal cell death model systems. In the present study, we established a staurosporine-induced apoptotic neuronal cell death system with human SH-SY5Y cell line. 17b-estradiol(E2) blocked staurosporine-induced apoptosis of SH-SY5Y cells as revealed by MTT as well as LDH assay. The cells showed typical DNA fragmentation at 4 h and 8 h following staurosporine treatment, which was attenuated by E2 pretreatment. Staurosporine-induced chromatin condensation was also reduced by E2 treatment. Because apoptotic stimuli are known to induce caspase-3 activation and PARP cleavage, we examined whether E2 blocks these processes. E2 markedly attenuated staurosporine-induced casapase-3 activation and PARP cleavage. This study shows that E2 blocks staurosporine-induced apoptosis in SH-SY5Y human neuroblastoma cells, suggesting that E2 is a neuroprotective agent that may be used for the treatment of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease.