난소암 세포주에서 Mullerian Inhibiting Substance의 증식 억제 효과

류기성 ( Ki Sung Ryu ),서미영 ( Mi Young Seo ),조윤성 ( Yun Sung Jo ),김미란 ( Mee Ran Kim ),김진우 ( Jin Woo Kim ),한구택 ( Goo Taik Han ),이준모 ( Joon Mo Lee ),김장흡 ( Jang Heub Kim ) 대한산부인과학회 2006 Obstetrics & Gynecology Science Vol.49 No.11

목적: 임신 7주경 태아 고환의 미숙 Sertoli 세포에서 생산되어 Muller관을 퇴행시키는 Mullerian inhibiting substance (MIS)는 성 발달과 가임기 여성의 생식생리 기전을 조절하는 이외에 Muller관으로부터 발생하는 일부 종양과 세포주의 성장을 in vivo와 in vitro에서 억제한다는 사실이 밝혀졌다. 이에 본 연구자들은 난소상피암 세포주들에서 MIS type II 수용체 (MISR II)의 발현을 확인하고, MIS를 투여하여 MIS의 세포 증식 억제효과와 그 기전을 밝힘으로서 종양치료제로서 MIS의 임상적 사용에 대한 가능성을 알아보고자 하였다. 연구 방법: 난소암 세포주인 SKOV-3, OVCAR-3 및 OVCAR-8에서 면역조직화학염색법으로 MISR II의 발현여부를 확인하였다. 난소암 세포주의 생존도는 고순도 MIS를 투여하여 24시간과 48시간동안 배양한 후 MTT assay로 측정하였다. MIS에 의한 세포주기 변화는 DNA 염색 후 flow cytometer로 분석하였으며 세포자멸사는 annexin-V-FITC 염색방법을 이용하여 flow cytometer로 평가하였다. MIS에 의한 난소암 세포주의 성장억제 감수성 차이와 세포자멸사 기전을 알아보기 위해 western blot 분석법을 이용하였다. 결과: 모든 난소암 세포주에서 MISR II 발현이 관찰되었지만, 발현정도는 OVCAR-8에서 제일 강했다. 세포 생존도는 OVCAR-8만이 MIS의 처치 용량과 시간에 따라 감소하였고, OVCAR-3은 고농도 MIS로 48시간 투여한 경우에만 의의 있게 감소하였으나, SKOV-3은 반응하지 않았다. Flow cytometer로 조사한 세포주기 변화는 OVCAR-8에서 10 μg/mL MIS로 24시간 처치한 경우에 G1세포주기 정지 소견을 보였으며, 48시간 후에는 세포자멸사를 의미하는 sub G0G1분기 분획이 7.02%로 나타나, MIS는 세포주기의 변화를 먼저 일으킨 후 세포자멸사를 유발하였다. OVCAR-3에서는 48시간 후 sub G0G1분기가 3.32%였으나 SKOV-3에서는 변화가 없었다. Annexin-V-FITC 염색방법으로, OVCAR-8과 OVCAR-3에서 48시간 MIS 처치 후에 각각 8.05%와 3.67%의 세포자멸사가 관찰되었다. Western blot 분석으로, OVCAR-8에서 MIS에 의한 세포 증식 억제에 이은 세포자멸사는 p16단백 증가와 연관이 있다고 판단된다. 또한 MIS는 OVCAR-8에서 MISR II와 결합한 후 pRb 비의존적인 세포내 경로를 통해 간접적으로 E2F1 활성 증가로 세포자멸사를 유도할 가능성이 있다. 결론: 본 연구에서 MIS가 난소암 세포주에서 증식 억제와 세포자멸사를 일으키는 기전을 완전히 규명하지는 못하였지만, MIS가 MIS 수용체를 발현하는 난소암에 대하여 in vitro에서 효과적인 항종양능을 나타낸다는 사실을 확인할 수 있었다. 향후 더 많은 연구로 MIS가 MIS 수용체를 발현하는 종양의 생물학적 조절제 혹은 치료제로 개발될 것이라고 예상된다. Objective: In order to explore Mullerian inhibiting substance (MIS) effects on the ovarian neoplasia, the expression and localization of the MIS type II receptor (MISR II), the growth inhibitory effects of MIS, and the underlying molecular mechanisms were investigated in the ovarian cancer cell lines. Methods: Expression of MISR Ⅱ were studied in SKOV-3, OVCAR-3, and OVCAR-8 cell lines by immunohistochemical staining. The antiproliferative effects of MIS in these cell lines were investigated by methylthiazoletetrazolium (MTT) assay, fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis, annexin-V-FITC binding, and western blot analysis. Results: All cell lines showed strong specific staining for MISR II, although staining in OVCAR-8 cells was more intense than that in SKOV-3 and OVCAR-3. Treatment of OVCAR-8 cells with MIS led to a dose- and time-dependent inhibition of cell growth and survival was determined use by MTT assay. But OVCAR-3 cells exhibited growth inhibition at higher doses after 48 hours of treatment and SKOV-3 cells did not demonstrate response. Using FACS analysis, exposure of OVCAR-8 cells to MIS (71 nM) resulted in G1 arrest after 24 hours of treatment. This pattern was changed by time-dependent increase in the percentage of cells with a sub G0G1 DNA content, suggesting apoptosis, after 48 hours of treatment. These results suggested that cell death be preceded by cell cycle arrest. Time-related induction of apoptosis was also observed in this cell line as measured by annexin-V-FITC binding. In OVCAR-8 cells, the growth inhibitory effects of MIS were mediated through specific induction of CDKI p16 protein expression and via regulation of E2F1 in the absence of detectable levels of pRb. We estimated that OVCAR-3 cells were affected by MIS through p16-independent, alternative mechanistic pathways, since the growth inhibitory effects of MIS were minimal. SKOV-3 cells did not express p16 protein. Conclusion: We have demonstrated that ovarian cancer cells express the MISR II. Epithelial ovarian cancer cells respond to MIS by growth inhibition. Although the precise mechanisms of MIS mediated inhibition of ovarian cancer cell growth have not been fully defined, these data suggest that MIS has activity against ovarian cancers in vitro and may also be an effective targeted therapy for ovarian cancer.

피부 각질화세포와 편평상피암세포에서 자외선 조사에 유발된 적응반응과 세포자멸사

문용석(Yong-Suk Moon) 대한해부학회 2007 Anatomy & Cell Biology Vol.40 No.4

적절한 자외선 조사가 정상 피부 각질화세포인 HaCaT 세포주와 편평상피암세포인 KUMA3 세포주에 미치는 영향을 세포생존율, 세포자멸사 비율 및 poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)의 발현을 통하여 조사하였다. 자외선 조사량에 대한 세포생존율은 HaCaT 세포주에서 높게 나타났으며, 세포자멸사 비율은 KUMA3 세포주에서 더 높게 나타났다. HaCaT 세포주의 경우 5 J/m2의 자외선을 전처리한 후 50 J/m2의 자외선을 처리한 군은 50 J/m2의 자외선을 단독으로 처리한 군에 비하여 세포생존율이 12% 정도 유의적으로 증가하여 자외선 조사에 대한 적응반응을 보였다. 반면, KUMA3 세포주에서는 5 J/m2의 자외선을 전처리한 후 50 J/m2의 자외선을 처리한 군이 50 J/m2의 자외선을 단독으로 처리한 군에 비하여 더 높은 세포자멸사의 비율을 나타내었다. PARP 항체를 이용한 면역세포화학 염색에서 HaCaT 세포주는 자외선 조사에 대하여 대부분 양성반응을 보였지만 KUMA3 세포주는 50 J/m2의 자외선을 조사한 군부터 음성반응을 보이는 세포들을 관찰할 수 있었다. Western blot 분석에서 HaCaT 세포주는 50 J/m2의 자외선을 조사한 군부터 85 kDa의 PARP 단백질 분절이 나타났지만 116 kDa의 본래의 PARP 단백질 발현이 강하게 유지되는 반면, KUMA3 세포주는 50 J/m2의 자외선을 조사한 군부터 85 kDa의 PARP 단백질 분절이 강하게 발현되기 시작하였고 그 이상의 조사량에서는 116 kDa의 본래의 PARP 단백질은 사라지고 85 kDa의 PARP 단백질 분절만 발현되었다. 이러한 결과들은 적절한 자외선 조사가 편평상피암세포의 세포자멸사에 효과적일 수 있음을 제시한다. The present study was investigated that the effects of suitable ultraviolet (UV) irradiation to the cell viability, apoptosis and expression of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) in HaCaT and KUMA3 cell lines that are skin keratinocyte and squamous cell carcinoma, respectively. The cell viability of UV irradiation dose appeared high in HaCaT cell line, and the percentage of apoptotic cells appeared higher in KUMA3 cell line. The cell viability in HaCaT cell line pretreated with 5 J/m2 UV and subsequently treated with 50 J/m2 UV was higher than that only treated with 50 J/m2 UV. On the other hand, the percentage of apoptotic cells in KUMA3 cell line only treated with 50 J/m2 UV was higher than that pretreated with 5 J/m2 UV and subsequently treated with 50 J/m2 UV. Immunocytochemical stain using PARP antibody, the most cells show positive reaction of UV irradiation in HaCaT cell line, but some negative reaction cells observe from treated with 50 J/m2 UV in KUMA3 cell line. The expression level of PARP by western blot analysis, concomitant with generation of the 85 kDa fragment in HaCaT cell line from treated with 50 J/m2 UV though the 116 kDa band was still retained. On the other hand, the 85 kDa fragment appeared in KUMA3 cell line from treated with 50 J/m2 UV but the intact PARP of 116 kDa disappears in more doses. These results present that suitable UV irradiation can be effective to apoptosis in squamous cell carcinoma.

난소암 세포 세포주기에 따른 항암제 감수성의 변화에 관한 연구

김미경 ( Mi Kyung Kim ),오창석 ( Chang Seok Oh ),이은주 ( Eun Joo Lee ) 대한산부인과학회 2009 Obstetrics & Gynecology Science Vol.52 No.6

목적: 이론적으로 항암제 감수성 검사는 환자에게 가장 효과적인 항암화학요법을 치료 시작 이전에 선택할 수 있게 한다. 그러나 실험실상의 결과에 따라 항암요법을 적용함에도 불구하고 치료 효과가 기대치와 상이하여 적극적으로 사용되고 있지 않다. 본 연구는 항암제 감수성검사 시 필수적인 배양단계에서 세포주기 단계의 변화가 항암제 감수성 결과에 어떤 영향을 주는지 알아보고자 하였다. 연구 방법: SKOV-3 세포주를 세포주기 단계 G0에 균질화 한 후 G0, G/G1, S 그리고 G2/M을 대표하는 시간에 MTT검사를 시행하였다. G0 세포주기에 균질화한 후 배양한 세포주를 실험군, 균질화 과정 없이 일반적인 배양을 시행한 세포주를 대조군으로 하였다. 6가지 약제 즉 5-FU, Etoposide, Cisplatin, Topotecan, Paclitaxel 그리고 Doxorubicin을 이용하여 각 세포주기의 대표시간당 3회씩 MTT검사를 시행하고 대조군과 비교하였다. 결과: 각 세포주기에 시행한 6가지 약제에 대한 MTT검사 결과는 다양하게 나타났다. 전체적으로 대조군에 대한 실험군의 항암제 감수성 차이는 21.3±15.1 (mean±S.D)%로 나타났다. 결론: 항암제 감수성 검사에 필수적인 배양단계에서 각각의 세포주기 분포가 변화함에 따라 항암 약제 감수성은 다르게 나타났다. 배양단계의 세포주기 변화가 실험실에서 측정된 항암약제 감수성이 체내의 반응을 정확하게 예측하지 못하게 하는 원인 중 하나일 수 있다. Objective: Theoretically, chemotherapy sensitivity and resistance assays help to predict which sensitive agent will be effective for patients. Due to low correlation between in vitro assay results and in vivo responses, chemosensitivity test is not generally applied in actual clinical practices. The aim of this study is to evaluate the influence of cell cycle in the course of cell culture stage on chemosensitivity test as a disturbing factor. Methods: After synchronization at G0, we conducted experiments on SKOV-3 cell line according to determined cell cycle span (G0, G0/G1, S, G2/M) with MTT (methylthiazolyl-diphenyl- tetrazolium bromide) chemosensitivity test. We evaluated the sensitivity changes of six chemotherapeutic agents (5-FU, Etoposide, Cisplatin, Topotecan, Paclitaxel, Doxorubicin) in each phase at target times. Results: Each phase represented the various results of MTT sensitivity on six chemotherapeutic agents. The variation of sensitivity between experimental (cell cycle synchronized culture) group and reference (conventional culture) group was 21.3±15.1 (mean±S.D)%. Conclusion: The cells in the each phase of cell cycle represent different levels of sensitivity to the same chemotherapeutic agent. The required cell culture stage of chemosensitivity test can blur the true candidate agent. This finding can be regarded as one of the reasons of mismatch between in vitro chemosensitivity and in vivo response of candidate chemotherapeutic agents.

두경부 편평상피암 세포주기에서 indomethacin에 유도된 세포주기의 정지

이동욱 충북대학교 의과대학 충북대학교 의학연구소 2004 忠北醫大學術誌 Vol.14 No.1

연구 목적: 최근. cyclooxygenase를 억제하는 비스테로이드성 항염제들이 대장암 세포들의 세포주기를 정지시키는 기전을 통하여 대장암 세포의 성장을 억제한다는 연구 결과들이 보고 되고 있다. 이에 저자는 비스테로이드성 항염제 중의 하나인 indomethacin이 두겨부 편평상피암 세포들의 세포주기에 어떠한 영향을 주는지 알아보고자 본 연구를 시행하였다. 대상 및 방법: 배양된 두경부 편평상피암 세포주에 다양한 농도의 indomethacin을 투여하였고, indomethacin이 두경부 편평상피암 세포들의 세포주기에 미치는 영향을 FACS 분석을 통하여 조사하였다. 결과: Indomethacin의 농도에 비례하는 양상으로 G0/G1 기 세포들의 분획이 증가하였으며, 동시에 S 기 세포들의 분획이 감소하였다. 이를 통해 indomethacin이 두경부 편평상피암 세포주에 있어서 세포주기를 정지시키는 효과가 있음을 알 수 있었다. 결론: 향후 indomethacin 등의 비스테로이드성 항염제가 두경부 편평상피암 세포들의 세포주기를 정지시키는 기전을 통하여 두경부 편평상피암의 예방이나 치료에 기여할 수 있으리라고 생각된다. Purpose: Recent studies have revealed that growth inhibition of colorectal cancer cells with nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), which inhibit cyclooxygenases (COX), involves cell cycle arrest. The aim of this study was to investigate the effects of indomethacin, an well-known NSAID, on cell cycle arrest of cultured head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) cell lines. Materials and Methods: HNSCC cells were cultured, and after addition of various concentrations of indomethacin, the effects of it on cell cycle of HNSCC cells were exam-ined using FACS analysis. Results: The percentage of cells in G0/G1 phases was increased in all the cell lines tested in a dose-dependent manner. And this increasing proportion of cells in G0/G1 phases was accompanied by a concomitant reduction in the number of cells at the S phase of the cell cycle demonstrating the indomethacin induced arrest of the cell cycle at the G0/G1 phases. Conclusion: It seems that inhibiting COX with NSAIDs, such as indomethacin, at an early stage may block the development of HNSCC from pre-malignant lesions and it may be able to improve the treatment outcome even if cancer is established through cell cycle arrest followed by inhibition of proliferation of cancer cells in HNSCC.

SCK 선암세포주에서 방사선 조사에 의해 유도되는 Apoptosis에 미치는 암유전자의 발현

이헝식,박홍규,문창우,윤선민,허원주,정수진,정민호,이상화,Lee Hyung Sik,Park Hong Kyu,Moon Chang Woo,Yoon Seon Min,Hur Won Joo,Jeong Su Jin,Jeong Min Ho,Lee Sang Hwa 대한방사선종양학회 1999 Radiation Oncology Journal Vol.17 No.1

목적 : 연구자들은 배양 배지의 산성환경이 SCK 선암세포에서 apoptosis를 유도하는 것과 산성환경이 SCK 선암 세포주에서 방사선에 의해 유도되는 apoptosis를 억제시킨다고 관찰하고 apoptosis 관련 유전자들인 p53, p21/WAF/CIP, Bcl-2 및 Bax 들의 발현과 배양 배지 pH 환경과의 연관성을 관찰하였다. 대상 및 방법 : SCK 선암 세포주를 체외 방사선 조사기를 이용하여 방사선 120Gy 조사 후 규정된 시간에 DNA fragmentation을 전기 영동으로 관찰하였다. 실험 조작으로 apoptosis가 유발된 세포군을 정량적으로 분석하고 세포주기 분석을 위하여 FACScan을 이용하였다. Apoptosis 관련 유전자들인 p53, P21/WAF/CIP, Bcl-2 및 Bax 들의 발현은 western blot으로 관찰하였다. 결과 : SCK 선암 세포주에서 방사선에 의해 유도되는 apoptosis는 산성환경(pH 6.6)에서는 apoptosis의 유발이 억제 된다는 사실을 관찰할 수 있었다. 세포주기 분석에서는 방사선조사 후 apoptosis가 뚜렷히 관찰된 pH 7.5 배양 배지 조건에 비하여 pH 6.6 배양 배지 조건에서 현저한 G2/M arrest가 관찰 되었다. apoptosis 관련 유전단백 분석에서는 Bcl-2 유전단백은 두 군 공히 발현의 차이를 관찰할 수 없었고, p53 및 p21은 pH 7.5 배양 배지 환경에서 뚜렷한 발현의 증가를 관찰하였고, p21은 pH 6.6 배양 배지 환경에서는 발현을 관찰할 수 없었다. Bax는 pH 7.5 배양 배지 환경에서 pH 6.6 환경에 비해 경미한 발현의 증가 및 지속성을 관찰하였다. 결론 . 저자들은 SCK 선암 세포주를 대상으로 방사선조사 후 상이한 pH 7.5 와 6.6의 배양 배지 조건에 따른 apoptosis의 관찰에 영향을 주는 유전자 발현에 관한 연구에서 Bcl-2 family의 발현에 비해 세포주기 관련 유전단백들인 p53 발현과 이에 따른 p21의 발현차이가 확연한 p53-dependent apoptotic pathway를 확인하였다. 방사선 조사 후 pH 6.6의 배양 배지 조건에서의 apoptosis 현상을 관찰할 수 없었던 이유는 pH 6.6의 경우 50-60$\%$의 세포가 G2/M arrest에서 세포주기를 순환하지 못함을 확인하였기에 G2/M arrest의 해지와 더불어 순환되는 세포주기의 결과에 따른 post-mitotic apoptosis 현상의 장애로 추론하였다. Purpose : The expression of p53, P211WAF/CIP, Bcl-2, and Bax underlying the radiation-induced apoptosis in different pH environments using SCK mammary adenocarcinoma cell line was investigated. Materials and Methods Mammary adenocarcinoma cells of hi) mice (SCK cells) in exponential growth phase were irradiated with a linear accelerator at room temperature. The cells were irradiated with 12 Gy and one hour later, the media was replaced with fresh media at a different pHs. After Incubation at 37Microbioiogy, College of Medicine Dong A University for 0$\~$48 h, the extort of apoptosis was determined using agarose gel electrophoresis and flow cytometry. The progression of cells through the cell cycle after irradiation in different pHs was also determined with flow cytometry. Western blot analysis was used to monitor p53, p211WAFfCIP, Bcl-2, and Bu protein levels. Results : The induction of apoptosis by irradiation in pH 6.6 medium was markedly less than that in pH 7.5 medium. The radiation-induced G2IM arrest in pH 6.6 medium lasted markedly longer than that in pH 7.5 medium. Considerable amounts of p53 and p21 proteins already existed at pH 7.5 and increased the level of p53 and p21 significantly after 12 Gy X-irradiation. An incubation at pH 6.6 after 12 Gy X-irradiation did not change the level of p53 and p21 protein levels significantly. Bcl-2 proteins were not significantly affected by radiation and showed no correlation with cell susceptibility to radiation-induced apoptosis in different pHs. An exposure to 12 Gy of X-rays increased the level of Bax protein at pH 7.5 but at pH 6.6, it was slight. Conclusions : The molecular mechanism underlying radiation-induced apoptosis in dinerent pH environments using SCK mammary adenocarcinoma cell line was dependent of the expression p53 and P211YVAF/CIP proteins. We may propose following hypothesis that an acidic stress augments the radiation-induced G2iM arrest, which inhibiting the irradiated cells undergo post-mitotic apoptosis. The effects of environmental acidity on anti-apoptotic and pro-apoptotic function of Bcl-2 family was unclear in SCK mammary adenocarcinoma cell line.

배추좀나방 (Plutella xylostella)의 번데기-유래 새로운 지방세포주 확립

차성재,한성식 한국곤충학회 1999 Entomological Research Vol.29 No.2

배추좀나방(Plutella xylostella)의 지방체로부터 새로운 지방세포주를 확립하였다. 이들 지방세포주는 빠른 성장을 보여주는 세포주로서, 확립 후 분열 시간은 34.5시간($25^{\circ}C$, pH 6.25, 300mOsm, 10% FBS)이었다. 이 세포주는 10% 혈청을 포함한 TNM-FM 배지에서 좋은 성장력을 보여주었다. 지방세포주 내에는 형태적 특징으로 보아 4가지의 subtype이 존재하고 있었다. 핵형분석을 통한 염색체수는 24에서 184개 이었다. 또한 10% DMSO가 포함된 배지에서 액체질소내에 10개월 이상 보관이 가능하였다. 이들 새로운 세포주는 Px-FK로 명명하였다. A novel fat cell line was obtained from the culture of the pupal fat bodies of Plutella xylostella. It was a fast- growing cell population, and its population doubling time was about thirty four and half hours after the culture was set up ($25^{\circ}C$, pH 6.25, 300 mOsm, 10% FBS). The cells were grown in the TNM- FM medium with 10% fetal bovine serum. This cell line could be divided into the four subtypes of fat cell lines by the morphological characters. A karyotype analysis showed a range between 24 and 184 chromosome numbers. The cells could be stored in the culture medium containing 10% DMSO in liquid nitrogen for over 10 months. The cell line was designated as Px- FK.

AT-1 심근세포를 대상으로 자발적인 박동을 나타내는 전.후단계에서 수종의 세포주기 조절 유전자의 벌현에 관한 연구

김경근,오창원,서국헌,고정태 대한순환기학회 1998 Korean Circulation Journal Vol.28 No.4

Trichostatin A, a Histone Deacetylase Inhibitor, Potentiated Cytotoxic Effect of Ionizing Radiation in Human Head and Neck Cancer Cell Lines

김진호(Jin Ho Kim),신진희(Jin Hee Shin),지의규(Eui Kyu Chie),우홍균(Hong-Gyun Wu),김재성(Jae Sung Kim, 김일한(Il Han Kim),하성환(Sung Whan Ha),박찬일(Charn Il Park),강위생(Wee-Saing Kang) 대한방사선종양학회 2004 Radiation Oncology Journal Vol.22 No.2

Purpose: We have previously reported that human glioblastoma cells are sensitized to radiation-induced death after their exposure to trichostatin A (TSA), a histone deacetylase inhibitor (HDAC-I), prior to the irradiation. We aimed to measure the magnitude of the radiosensitizing effect of TSA in human head and neck cancer cell lines. Materials and Methods: Human head and neck cancer cell lines, HN-3 and HN-9, were exposed to 0,50, 100, and 200 nM TSA for 18 hr prior to irradiation. Then, the TSA-treated cells were irradiated with 0, 2, 4, 6, and 8 Gy, and cell survival was measured by clonogenic assay. Results: Pre-irradiation exposure to TSA was found to radiosensitize HN-3 and HN-9 cell lines. In HN-9 cells, the fraction surviving after 2 Gy (SF2) was significantly reduced by treatment of TSA at concentration as low as 50 nM. However, a treatment with 200 nM TSA was required to significantly decrease SF2 in the HN-3 cell line. SER of pre-irradiation treatment with 200 nM TSA was 1.84 in HN-3 and 7.24 in HN-9, respectively. Conclusions: Our results clearly showed that human head and neck cancer cell lines can be sensitized to ionizing radiation by pre-irradiation inhibition of histone deacetylase (HDAC) using TSA, and that this potentiation might well be a general phenomenon. 목 적: 본 연구진이 기왕에 입증한 바 있는 히스톤탈아세틸효소 억제제 trichostatin A (TSA)가 나타내는 방사선 감 수성 증강 작용이 두경부암 세포주에서 발생하는 정도를 실험적으로 확인하고자 하였다. 대상 및 방법: 인간 두경부암 세포주인 HN-3과 HN-9를 0, 50, 100, 200 nM의 TSA에 18시간 동안 전처치시킨 후 각각 0, 2, 4, 6, 8 Gy 방사선을 조사하였다. 세포생존곡선은 clonogenic assay를 이용하여 산출하였고 linear quadratic 모델에 따라 분석하였다. 결 과: 방사선 조사 전 TSA 처리는 HN-3과 HN-9 세포주의 방사선 감수성을 증강시켰다. 50 nM의 TSA로 처리된 HN-9 세포주에서 2 Gy 조사후 생존분획(SF2)은 유의한 수준으로 감소하였으나, HN-3 세포주는 200 nM의 TSA 처리 후 SF2가 유의하게 감소하였다. HN-3과 HN-9 세포주에서 200 nM TSA의 sensitizer enhancement ratio는 각각 1.84와 7.24였다. 결 론: 방사선 조사 전 히스톤탈아세틸효소 억제는 인간 두경부암 세포주의 방사선 감수성을 증가시켰으며, 이 증강 작용이 암세포주에서의 일반적으로 관찰되는 현상일 가능성이 크다고 제안한다.

Nrf2 전사유전자의 이온수송체 유전자 조절기전

조혜정,안규윤 대한체질인류학회 2019 해부·생물인류학 (Anat Biol Anthropol) Vol.32 No.4

저칼륨 상태에서 활성산소종의 양이 증가되고, 증가된 활성산소종은 Nrf2의 핵 내 이동을 촉진한다고 하고, Nrf2 활성화는 extracellular-regulated kinase (ERK), Jun N-terminal kinase (JNK), p38과 phosphatidyl-inositol 3-kinase (PI3K)라는 인산화효소가 작용하는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 저칼륨 상태에서 어떤 인산화효소가Nrf2 활성화에 관여하는지, 그리고 활성화된 Nrf2가 이온수송체의 발현에 관련이 있는지 알아보고자 정상 및 칼륨제한 식이 흰쥐 신장과 CV-1, 293T 및 MEF (mouse embryonic fibroblast) 세포주를 정상 및 저칼륨 상태에서 배양하여각각 RT-PCR과 Western 분석으로 정량화하였다. 저칼륨 배양조건에서 증가된 Nrf2의 발현량이 LY294002와 SP600125로 처리하였을 때 감소하는 것을 관찰할 수 있었으나 PD98059와 SB203580로 처리하였을 때는 변화가 없었다. 이는 Nrf2 전사유전자 활성화에 Akt와 JNK 인산화효소가 관여할 가능성을 시사하였다. 칼륨제한 식이 신장조직에서는 ERK1/2 와 Akt의 활성화된 형태인 phospho- ERK1/2, phospho-Akt의 발현이 칼륨제한 식이가 길어질수록 증가하였고 JNK와 p38의 활성은 변화가 없었다. 저칼륨상태 CV-1 세포주에서는 phospho-ERK1/2, phospho-Akt의 발현이 증가함을 확인하였다. 또한 phospho- Nrf2가 칼륨제한 식이가 길어질수록 핵으로 많이 축적됨을 알 수 있었다. 저칼륨 배양조건 MEF-Nrf2 wild-type (+/+) 세포주에서는 Nrf2 발현이 증가하였지만 MEF- Nrf2 Hetero (+/- ) 세포주에서는 감소하였고, MEF-Nrf2 knock-out (- /- ) 세포주에서는 발현이 되지 않음을 확인하였다. kNBC1과 colonic H/K의 mRNA 발현 역시 저칼륨 배양조건 MEF-Nrf2 wild-type (+/+) 세포주에서는 증가하였으나 MEF-Nrf2 Hetero (+/- )와 MEF-Nrf2 knock-out (- /- ) 세포주에서는억제되었음을 관찰하였다. 이상의 결과로 저칼륨 상태에서 Nrf2는 ERK1/2와 Akt에 의해 활성화되고, 활성화된 Nrf2는 kNBC1과 colonic H/ K-ATPase 유전자의 전사를 조절할 것으로 추측하였다. The Nuclear factor-erythroid-2-related factor 2 (Nrf2) plays a key role in the cellular defense against oxidative stress. Low K+ increased the reactive oxygen species and it stimulate Nrf2 activation. Previous our study demonstrated that low potassium promoted expression of H/K-ATPase and kNBC1 by Nrf2 transcription factor in cultured models. In addition, phosphorylation of ERK, JNK, p38 and PI3K was involved in the activation of Nrf2 expression. This study aims to elucidate the mechanism which low potassium regulates Nrf2 expression through various in vitro and in vivo models. Using various kinase inhibitors, promotion of Nrf2 expression in low potassium condition was inhibited by LY294002 and SP600125 while PD98059 and SB203580 did not affect Nrf2, suggesting that phosphorylation of Akt and JNK is specifically involved in Nrf2 expression in low potassium condition. Kidney tissues from low potassium diet rats showed increased phospho-ERK1/2 and phospho-Akt in diet time dependent manner but no effect to JNK and p38 phosphorylation. Specifically, Phospho- Nrf2 was also increased in nuclear compartment by low potassium diet. In order to demonstrate direct evidence that low potassium regulates ionic transporters by Nrf2, Nrf2 knockout mice were employed. Mouse embryonic fibroblasts (MEF) were harvested for the study. As expected, low potassium promotes expression of Nrf2 and level of phospho-ERK1/2 and phospho-Akt in MEF-Nrf2 (+/+). Low potassium promoted expression of kNBC1 and H/K-ATPase in MEF-Nrf2 (+/+), but unchanged or even decreased in MEF-Nrf2 (+/- ) and MEFNrf2 (- /- ). Taken together, these results show that Nrf2 was activated by ERK1/2 and AKT in low potassium condition and further regulates expression of kNBC1 and colonic H/K-ATPase.

KUMA3 모세포주와 변이주에서 EGF에 대한 반응

오해일(Hai-Ill Oh),문용석(Yong-Suk Moon),최인장(In-Jang Choi) 대한해부학회 2002 Anatomy & Cell Biology Vol.35 No.6

세포의 신호전달체계 통로와 연관된 많은 성장인자 중 epidermal growth factor (EGF)의 기전이 가장 잘 밝혀져 있다. EGF는 표피의 재생과 EGF 수용체가 과발현되는 상피암의 약제치료에 항암제와 병용으로 사용함으로써 항암 효과를 상승시킨다. 그러나 과도한 EGF사용으로 생길 수 있는 부작용을 최소화하기 위해 아랫입술 편평상피암 조직에서 확립한KUMA3 모세포주와 과량의 EGF가 첨가된 배양액에서 장기간 계대배양으로 획득한 변이주를 대상으로 EGF에 대한 반응들을 관찰하였다. EGF 처리에 대한 세포군락 형성 형태는 모세포주에서는 세포들이 분산된 상태로 뚜렷한 세포돌기들이 관찰되는 반면에 변이주에서는 대조군과 유사한 형태로 둥근 세포들로 밀집된 상태였다. 대조군에 대한 EGF처리군의 세포군락수의 비율은 EGF농도에 따라 두 세포주에서 같은 양상으로 줄었으나, 변이주에서 세포군락수의 비율은 모세포주보다 더 높았다. 모세포주 세포와 변이주 세포를 같은 수로 동시에 배양하였을 때 EGF가 첨가되지 않은 배양액에서는 모세포주 세포가 우성적으로 성장하였으나, EGF가 첨가된 배양액들에서는 변이주 세포가 우세하게 자랐다. EGF에 의한 세포분화나 고사 및 증식에 관여하는 bc1-2, p53과 PCNA의 단백 변화를 휴지기 상태의 세포에 3, 6, 9, 12, 24시간으로 EGF로 처리하여 Western blot으로 관찰하였으나 두 세포주에서 변화의 차이가 없었다. EGF에 의한 EGF 수용체 단백의 세포 내 유입 후 탈감작이 모세포주에서는 EGF처리군 모두 동일한 상태였으나, 변이주에서는 EGF처리 시간별에 따른 EGF수용체 단백이 주 기성을 나타내었다. EGF 수용체 tyrosine kinase의 기질인 annexin I과 annexin II의 발현 변화는 모세포주에서는annexin I과 annexin II의 변화가 뚜렷하지 않았고, 변이주에서는 annexin I의 변화는 뚜렷하지 않았으나 annexin II는 EGF처리 12시간과 24시간에서 현저하게 감소하였다. 이러한 annexin II의 현저한 감소를 정확히 판명하기 위해 면역세포화학법으로 관찰하였을 때 모세포주에서는 EGF처리 9시간에서 세포질에 편재해 있던 annexin II가 핵막 쪽으로 이동되었으나 변이주에서는 annexin II가 세포막 쪽으로 이동되어 있었다. 변이주의 EGF처리 12시간과 24시간에서 annexin II가 현저하게 감소된 것은 annexin II가 세포밖으로 분비되었기 때문이다. 이상의 결과들을 통해 변이주에서 EGF처리에도 불구하고 모세포주와 다르게 세포군락 형성 형태와 세포모양이 대조군과 유사하게 유지될 수 있는 것은 EGF 수용체 단백의 EGF처리에 따른 시간별 주기성과 EGF처리로 인한 annexin II의 세포 밖 분비에 기인한 것으로 생각되어진다. 그러므로 이러한 결과들은 여러 상피암에 약제치료 시 항암제에 EGF 병용여부를 결정하는 좋은 자료가 될 것으로 생각된다. EGF has been a representive growth factor for understanding the signal transduction that underlies the biological response of a number of growth factors. EGF plays an important role in the regulation of growth inhibition in the squamous cell carcinoma with over-expressed EGF receptors, but the mechanism that determine sensitivity to the growth inhibition by EGF are not well understood. The KUMA3 parental cell line, derived from a squamous cell carcinoma of the human lower lip, was established and variant cell line derived from the parental cell line was acquired by treatment with high dose EGF (200 ng/mL) for 6 months. The KUMA3 parental cells treated with EGF showed marked scattering cells with prominent dendritic processes. On the other hand, EGF treated cells in the variant cell line showed a dense monolayer of ovoid cells similar to untreated cells. Therefore, it was conformed that the variant cell line was resistant to the growth-inhibitory effect of EGF. To gain insight into the action mechanism of EGF in the KUMA3 parental and variant cell lines, Western blot analysis was examined to identify transregulation of EGF receptor. In the all parental cell lines treated with EGF, EGF receptor proteins were completely disappeared by lysosomal degradation. However, EGF receptor proteins were shown the periodic appearance according to the time course in the variant cell lines treated with EGF. In Western blot and immunocytochemical analyses, annexin II protein evenly distributed in the cytoplasm relocated to the plasma membrane at 9 hrexposure to EGF and was significantly decreased at 12 hr- and 24 hr-exposures to EGF in the variant cell line. However, annexin II protein relocated to the nuclear membrane at 9 hr-exposure to EGF and was not any change in amount at 12 hr- and 24-exposure to EGF in the parental cell line. In conclusion, this study suggests that the retention of colony formation pattern and cell morphology in the variant cell line treated with EGF might be owing to the heterologous desensitization of EGF receptor and exocytosis of annexin II.