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        가압가열 및 Microwave 처리에 의한 중력분 Gliadin의 항원성 변화

        곽지희(Ji-Hee Kwak),김꽃봉우리(Koth-Bong-Woo-Ri Kim),이청조(Chung-Jo Lee),김민지(Min-Ji Kim),김동현(Dong-Hyun Kim),선우찬(Chan Sunwoo),정슬아(Seul-A Jung),강주연(Ju-Youn Kang),김현지(Hyun-Jee Kim),최정수(Jung-Su Choi),김성원(Seong-Won 한국식품영양과학회 2011 한국식품영양과학회지 Vol.40 No.10

        본 연구에서는 가압가열 및 microwave 처리가 gliadin의 항원성에 미치는 영향을 살펴보기 위해 중력분에 가압가열과 microwave를 단독 또는 병행으로 처리하여 Ci-ELISA, SDS-PAGE 및 immunoblotting을 실시하였다. 가압가열 처리의 경우, 처리 시간이 길어질수록 IgG와의 결합력이 감소하였으며, 특히 50분 처리구에서 약 69%로 가장 낮은 결합력을 보였다. 또한 SDS-PAGE와 immunoblotting 결과에서도 무처리구에서 강하게 보였던 gliadin band가 처리에 의해 거의 소실되고 항체와 반응하지 않았다. 가압가열 및 microwave를 병행 처리한 경우도 마찬가지로 gliadin의 결합력이 다소 감소하였으며, 처리구 중에서는 가압가열 50분, microwave 5분 처리구에서 약 73%로 가장 낮은 결합력을 보였다. 반면 microwave를 단독으로 처리하였을 때에는 일부 단백질의 변화는 관찰되었으나 항원성 감소에는 큰 영향을 미치지 않았다. 이상의 결과를 통해 가압가열을 단독 처리에 의해 gliadin의 항원성이 다소 감소되었으며, microwave 병행 처리에 의한 차이는 크게 나타나지 않은 것을 확인하였다. This study was conducted to evaluate the effect of physical treatments on the antigenicity of gliadin in medium wheat flour. The wheat flour was treated with an autoclave (5, 10, 30, 50 min), a microwave (1, 5, 10 min), and both (10, 30, 50 min/ 5, 10 min), and investigated by SDS-PAGE, immunoblotting and Ci-ELISA using anti-gliadin IgG. The results showed that the binding ability of anti-gliadin IgG to gliadin in wheat flour was slightly decreased when autoclaved or when autoclaved and microwaved. Especially, it was reduced to about 69% after autoclaving for 50 min and 73% after autoclaving for 50 min and microwaving for 5 min. In addition, gliadin bands in the 50 min autoclaved group disappeared in both SDS-PAGE and immunoblotting. On the other hand, the antigenicity of gliadin was unaffected by microwaving alone. Consequently, there were no considerable changes in using an autoclave alone or in combination with a microwave. These results suggest that autoclaving may affect the reduction of the antigenicity of gliadin in medium wheat flour.

      • SCOPUSKCI등재

        가압가열 및 microwave에 의한 중력분 반죽 gliadin의 항원성 변화

        곽지희(Ji-Hee Kwak),김꽃봉우리(Koth-Bong-Woo-Ri Kim),이청조(Chung-Jo Lee),김민지(Min-Ji Kim),김동현(Dong-Hyun Kim),선우찬(Chan Sunwoo),정슬아(Seul-A Jung),김현지(Hyun-Jee Kim),최정수(Jung-Su Choi),김성원(Seong-Won Kim),안동현(Dong-Hyun 한국식품과학회 2012 한국식품과학회지 Vol.44 No.1

        본 연구에서는 가압가열 및 microwave 처리에 의한 중력분 반죽 추출물 내의 gliadin 단백질의 항원성 변화에 대해 살펴보았다. 중력분 반죽에 가압가열과 microwave를 단독 또는 병행으로 처리하여 ci-ELISA, SDS-PAGE 및 immunoblotting을 실시하였으며, 가압가열 처리에 의해서 anti-gliadin IgG 항체와 gliadin과의 결합력이 다소 감소한 것을 확인하였다. 특히 30 min 이상 처리시 더욱 감소한 것으로 나타났으며, SDS-PAGE와 immunoblotting 결과에서도 gliadin band의 강도가 약해지고 항체와의 반응도 나타나지 않았다. Microwave 처리의 경우, 5 min 이상 처리시 일부 gliadin 단백질의 소실이 관찰되었으나, 항원성에는 큰 변화가 없었다. 또한 가압가열 및 microwave 병행 처리에 의해 항원-항체 결합력이 더욱 감소되었으며, 특히 가압가열 50 min, microwave 10 min 처리시 약 35.0%로 감소되었다. 이상의 결과를 통해 가압가열 처리에 의해 중력분 반죽 추출물 내 gliadin의 항원성이 감소되는 것을 확인하였으며, microwave와 병행 처리하는 경우, 더욱 감소하는 것을 확인하였다. The aim of this study was to determine the optimal physical treatment to reduce the antigenicity of gliadin in wheat dough. Medium wheat dough was treated with an autoclave (5, 10, 30, and 50 min at 121℃, 1 atm), a microwave (1, 5, and 10 min) or both (10, 30, and 50 min/5, 10 min). The proteins in the dough extracts were analyzed by SDS-PAGE and the binding ability of anti-gliadin IgG to gliadin was examined by ci-ELISA and immunoblotting. Results showed that the ability of anti-gliadin IgG to bind to gliadin in wheat dough treated with an autoclave alone or in combination with a microwave was decreased. Especially, it declined to ~77% after autoclaving for 30 min and 35% after both autoclaving for 50 min and microwaving for 5 min. In addition, the intensity of gliadin bands in SDS-PAGE were weakened and anti-gliadin IgG did not recognize gliadin in immunoblotting. However, microwaving alone did not affect the antigenicity of gliadin in wheat dough. These results indicate that autoclaving may affect the reduction of the antigenicity of gliadin in medium wheat dough. Moreover, autoclaving in combination with microwaving is more effective for reducing the antigenicity of wheat dough.

      • KCI등재

        직접 검화법을 이용한 조제분유의 콜레스테롤 분석법 개발

        김진만,박정민,윤태형,임동길,윤창용,정자영,정인식,곽병만,안장혁,Kim, Jin-Man,Park, Jung-Min,Yoon, Tae-Hyung,Leem, Dong-Gil,Yoon, Chang-Yong,Jeong, Ja-Young,Jeong, In-Seek,Kwak, Byung-Man,Ahn, Jang-Hyuk 한국축산식품학회 2011 한국축산식품학회지 Vol.31 No.6

        본 연구에서는 조제분유 중의 콜레스테롤을 신속하고 정확하게 분석하기 위해 지방 추출 과정을 거치지 않는 직접 검화 방법을 선택하여 분석법 개발을 시도하였다. 조제분유 분말시료를 직접 검화 수기에 취하여 검화 온도, 검화 시간, KOH 농도의 3가지 인자에 대해 콜레스테롤 회수율이 가장 양호하게 나타나는 최적 검화조건을 확립하고, 검화 후 수세과정에서 액액 분배가 용이한 용매 조건도 확립하였다. 또한 콜레스테롤 피크의 완전한 분리를 위한 적정 기기 조건을 확립하였다. 그 결과, 시료 약 2 g에 16 M-KOH 10 mL를 넣고 $90^{\circ}C$에서 60분 가열하여 검화한 후 diethyl ether로 3회 추출하고 hexane을 최종시험용액으로 하여 기기분석을 했을 때의 회수율이 98.80%로서 가장 양호하게 나타났다. 본 연구를 통해 개발된 조제분유의 효율적인 액액분배 및 직접가열 검화법은 일원배치 분산법에 의해 유화가공식품의 콜레스테롤 분석법으로 유효성이 검증되었으며, 아울러 개발된 전처리 방법 및 기기 분석 조건을 활용해 다양한 분석 기관에서 신속 정확하고 효율적인 콜레스테롤 분석을 수행할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 산업체의 품질관리 및 검증기관에서 필요시 모니터링에 적극 활용 가능할 것으로 사료되며, 이를 통해 유화가공식품 류의 함량표시 및 규격관리의 정확성과 효율성 증대에 기여하여 제조업체의 정확하고도 효과적인 품질 및 안전성 확보에 기여할 수 있을 것으로 판단된다. 특히 위해 물질에 대한 정확한 함량 판단이 중요한 조제분유 등의 영 유아용 식품의 안전성 확보에 지대한 공헌을 할 수 있을 것으로 기대된다. An improved cholesterol analysis method was developed for powdered infant formula by gas chromatographic separation after liquid-liquid extraction and partition. In the official Korea Food Standard method for cholesterol analysis, the water phase and solvent phase were not well separated in the case of emulsified foods such as powdered infant formulas and baby foods. For the rapid and simple sample preparation method, an optimized direct saponification condition was established for heating temperature, heating time, and KOH concentration. From the results, the optimum conditions were as follows: heating temperature $90^{\circ}C$, heating time 60 min, and 16 M KOH 10 mL for a 2 g infant formula sample; improved separation condition for gas chromatography was as follows: the initial oven condition was $250^{\circ}C$ for 25 min, the oven temperature was increased to $290^{\circ}C$ by $10^{\circ}C$/min ratio, and finally the oven temperature remained at $290^{\circ}C$for 9 min. The developed method could be implemented for the study of cholesterol, providing the advantages of reduced inspection time and cost in emulsified foods such as infant formula.

      • KCI등재

        물리․화학적 처리에 의한 요구르트 오염균의 생육 억제효과

        선우찬(Chan Sunwoo),이소영(So-Young Lee),윤소영(So-Young Yoon),정지연(Ji-Yeon Jung),김꽃봉우리(Koth-Bong-Woo-Ri Kim),이청조(Chung-Jo Lee),곽지희(Ji-Hee Kwak),김민지(Min-Ji Kim),김동현(Dong-Hyun Kim),정슬아(Seul-A Jung),김현지(Hyun-Jee 한국식품영양과학회 2011 한국식품영양과학회지 Vol.40 No.12

        물리?화학적 처리에 의한 요구르트 오염균의 생육억제 효과를 알아보기 위해, 요구르트의 주요 오염균을 분리?동정하고, 열, pH, 전해수, 오존가스, microwave 처리 및 감마선을 조사하여 오염균주에 대한 사멸효과를 알아보았다. 오염된 요구르트로부터 분리한 효모의 지방산 조성 분석과 API(Analytic Profile Index) kit 분석을 실시한 결과, Hanseniaspora uvarum으로 동정되었으며 잠정적으로 Hanseniaspora uvarum Y1으로 명명하였다. H. uvarum Y1의 열 및 pH 처리에 의한 생육억제 효과를 측정한 결과, 70℃ 및 80℃에서 15분 가열처리로 균이 사멸되었으며, pH 처리 시 pH 2, 3 및 9에서 생육이 다소 억제되었으며, pH 1 및 10에서 완전히 억제되었다. 전해수 처리의 경우, clear zone이 5 mm 이상으로 H. uvarum Y1이 전해수에 높은 감수성을 가지는 것으로 나타났다. 오존가스 처리에 의한 H. uvarum Y1의 사멸효과를 측정한 결과, 102 CFU의 균은 10분, 103 CFU의 균은 20분 처리 시 모두 사멸한 것으로 나타났으며, microwave 처리의 경우, 106 CFU 가량의 균이 1분 처리 시 모두 사멸되었다. 방사선 조사의 경우, 균수를 90% 이상 감소시키는데 필요한 조사선량이 20 kGy 이상으로 H. uvarum Y1은 감마선에 저항성이 있는 균임을 알 수 있었다. 이상의 결과를 종합해볼 때 열, pH, 전해수, 오존가스, microwave 처리를 통해 요구르트 오염균주인 H. uvarum Y1의 생육을 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 생각된다. This study was conducted to investigate the cause of microbiological contamination in yogurt and evaluate the effect of physicochemical treatment on the growth inhibition of Hanseniaspora uvarum isolated from yogurt. The yeast strain Hanseniaspora uvarum Y1 was subjected to heat and pH treatments. H. uvarum Y1 was killed at 70oC and 80oC after 15 min and survived in a wide pH range from pH 2 to 9. However, it did not survive under pH 1 and over pH 10. In a disk diffusion susceptibility test on H. uvarum Y1, a clear zone (5 mm) of growth inhibition was observed upon treatment with electrolyzed water. The effect of ozone gas on the growth of H. uvarum Y1 was evaluated by viable cell count. Initial cell numbers of 102 and 103 CFU/mL of H. uvarum Y1 were completely killed by treatment for 10 and 30 min, respectively. H. uvarum Y1 was also sterilized by microwave treatment for 1 min. When treated with gamma-irradiation, the rate of killing of H. uvarum Y1 was proportional to the irradiation dose. and complete killing occurred at a dose of 50 kGy.

      • KCI등재

        물리ㆍ화학적 처리에 의한 멸균 초콜릿 우유 오염균의 생육억제 효과

        최문경(Moon-Kyoung Choi),윤소영(So-Young Yoon),이소영(So-Young Lee),김꽃봉우리(Koth-Bong-Woo-Ri Kim),이청조(Chung-Jo Lee),정지연(Ji-Yeon Jung),곽지희(Ji-Hee Kwak),김민지(Min-Ji Kim),김동현(Dong-Hyun Kim),선우찬(Chan Sunwoo),이주운(Ju-W 한국식품영양과학회 2011 한국식품영양과학회지 Vol.40 No.8

        멸균 초콜릿 우유로부터 분리한 내열성 균주에 대해 열, pH, 전해수, 오존처리, microwave 및 감마선 처리를 하여 균주의 사멸효과에 대해 알아보았다. 균주의 지방산 분석과 API kit를 통하여 균주를 동정한 결과, Bacillus lentus로 동정되었으며, 잠정적으로 Bacillus lentus M1으로 명명하였다. B. lentus M1에 110℃, 15분간 열처리하였을 경우 생육이 억제되었으며, pH 처리 시 pH 5 이하, 10 이상에서 생육이 억제된 것으로 나타났다. B. lentus M1에 대한 전해수의 항균활성을 paper disc법으로 측정한 결과, 높은 생육억제를 보였으며, 오존 처리의 경우 초기 균수가 10² CFU가량의 균을 10분 동안, 10³ CFU가량의 균을 30분 동안 처리 시 균의 생육이 억제되는 것으로 나타났다. Microwave를 1분간 처리 시 B. lentus M1이 모두 사멸한 것으로 나타났다. 감마선 조사의 경우, 1 kGy 조사 시 생균수가 1.61×10³ CFU로 초기 균수에 비해 4 log cycle 가량 균수가 감소하였으며 7 kGy에서 완전히 사멸하였다. 이상의 결과를 통해 열, pH, 전해수, 오존 처리 및 방사선 처리 방법이 멸균 초콜릿 우유의 생존 오염균인 B. lentus M1을 효과적으로 사멸시킬 수 있을 것으로 사료된다. This study was conducted to investigate the cause of microbiological contaminants in aseptic chocolate milk and evaluate the effect of a physicochemical treatment on the growth inhibition of isolated bacterial strains. The bacterium isolated from aseptic chocolate milk was identified as Bacillus lentus and was named B. lentus M1. In the heat and pH treatment, the growth of B. lentus was inhibited at 110℃ for >15 min and at pH’s <5 and >10. An electrolyzed water treatment against B. lentus M1, revealed 5 ㎜ growth past the inhibition zone. The effect of ozone gas on B. lentus M1 growth was evaluated using viable cell counts. When the initial number of B. lentus M1 was 10² and 10³ CFU, the bacteria were completely suppressed by ozone gas treatment for 10 and 30 min, respectively. In a microwave treatment, B. lentus M1 was sterilized following microwave treatment for 1 min. As the result of γ-irradiation against B. lentus M1, numbers decreased as the γ-irradiation dosage increased. These results show the growth inhibition effects against contaminants in aseptic chocolate milk using physicochemical treatments.

      • KCI등재후보

        뉴질랜드 낙농업의 구조변화 분석

        곽영태,박민수,천동원 한국국제농업개발학회 2004 韓國國際農業開發學會誌 Vol.16 No.4

        뉴질랜드의 낙농업은 온화한 기후, 연중 고른 강수량, 넓은 면적의 초지 및 외부로부터 격리된 지리적 여건 등 천혜의 자연적 환경으로 인하여 일찍부터 국가 기간산업으로 발달되어 왔다. 또한 1984년부터 실시된 경제개혁의 결과 지금은 세계 유제품 시장의 약 31%를 차지하는 낙농 강국으로 성장 하였으며, 최근 10년간(1993년~2002년)뉴질랜드 낙농업의 구조변화를 요약하면 다음과 같다. 1. 군수는 5.6%나 감소하여 규모화가 진행되고 있으며, 반면 사육두수는 4.2%, 평균 군 규모는 50.6%, 목장 평균면적은 39.2% 각각 증가하였다. 또한 호당 초지 면적이 2001/02년도 현재 103 ㏊, 호당 사육규모는 271두로 초지에 바탕을 둔 방목위주 사육으로 저비용 고품질의 우유를 생산하고 있다. 2. 노동 집약적인 낙농업에 종사하면서도 여유로운 생활을 즐기기 위해 자가 운영형태에서 분배 착유형태로의 운영구조 전환이 서서히 이루어지고 있는 것으로 나타나고 있다. 3. 사육규모별로 볼 때 200두 미만의 군수가 급격히 감소 추세에 있으며, 상대적으로 300두 이상의 군수가 증가 추세에 있다. 특히, 500두 이상 규모의 확대가 빠르게 진행되고 있다 4. 매년 생산된 유제품의 90% 이상을 세계시장으로 수출하는 수출형 낙농으로 확고한 기반을 확립하고 있다. 5. 조수입의 증가율이 133%로 나타난 반면 경영비 증가율은 94%에 불과하여 소득 증가율이 232%로 높게 나타났다. 6. 뉴질랜드 낙농농가의 자본구조는 매우 양호한 상태로 나타나고 있다. 즉 2001/02년 현재 자기 자본비율 67%, 부채비율 50%로 나타나 국제경쟁력 강화에 긍정적인 요소로 작용하고 있다. 특징적인 면은 고정자산에 투자된 비율이 높은 것으로 나타났다. 따라서 위의 결과를 통해서 볼 때, 우리나라의 낙농업이 초지부족에 따른 방목위주로의 전환이 어려운 현실임을 감안하더라도 기존 초지의 철저한 활용, 답리작 사료작물 재배 및 임간초지의 개발 등으로 조사료 급여 비율을 높임으로써 농후 사료비를 절감 할 수 있는 방안을 강구하여야 할 것이다. 아울러 생산비 절감을 위한 규모 확대 방안을 적극적으로 마련해야만 국제경쟁력을 가질 것으로 판단된다. The objectives of this study are to analyze the structural change of New Zealand dairy industry for the last ten years and to make a few suggestions to strengthen the competitive power of Korean dairy industry. The main results are as follows; First, there were big changes in dairy herd size, dairy cattle number and dairy farm size. Second, in operating structure, the ratio of sharemilkers was increasing, on the other hand, the ratio of owner-operators was decreasing, Third, in herd size, herds below 200 heads were decreasing, herds over 300 heads were increasing. Fourth, dairy industry focuses on export, annually over 90% of milk products produced was exported. Fifth, farm revenue increased by 133%, operating cost increased by 94%, farm profit increased by 232% for the last ten years. Sixth, in capital structure, owner's equity ratio was 67%, debt ratio was 50% in 2001/02, on the other hand, ratio of investment in fixed assets was high. As a result, this study suggests that Korean dairy industry has to enlarge grass-land as much as possible to reduce a production cost, also it has to strengthen a competitive power with enlargement in farm size.

      • KCI등재

        삼풍 사고 생존자들의 정신과적 증상

        이민수,한창수,곽동일,이준상 大韓神經精神醫學會 1997 신경정신의학 Vol.36 No.5

        1995년 6월 29일 발생한 삼풍 백화점 붕괴사고의 생존자들을 정신과적으로 면담하여 이들의 정신적인 후유증의 여부와 증상의 빈도를 보고자 하였다. 1995년 11월에 안암병원에 내원한 삼풍사고 생존자 중, 정신과적 진찰을 받은 681명의 면담 자료를 대상으로 하여 기술통계 및 빈도분석을 실시하였다. 대상 환자들이 호소하는 증상 중 가장 흔한 증상은 수면장애로 전체환자의 54.2%가 호소하였다. 그 다음으로 두통(31.8%), 예민성(23.3%), 기억나는 상황에서의 심한 고통(24.2%)의 순으로 나타났다. 신체증상 중에는 두통, 흉부 불편감, 사지통, 요통, 소화기계 이상의 순으로 증상을 호소하였다. 위의 결과로 보아 내원 환자의 대부분이 정신과적 증상을 호소하고 있었다. 본 연구에서는 생존자들이 한국의 문화적, 사회적 배경에 따라 서구의 환자들과 다른 양상으로 신체 증상을 호소할 가능성을 고려하였으나, 결과는 서구의 연구결과와 큰 차이를 보이지 않았다. 향후 이 결과를 근거로 하여 외상후에 나타나는 증상들을 한국적 상황에 맞게 분별할 수 있는 자료를 제시할 수 있을 것이다. In order to evaluate psychiatric symptoms in survivors of the Sampoong accident, we interviewed 624 survivors of the accident. The most common complaint of the subjects was sleep disturbance(54.2%). And then, headache(31.8%), irritability and anger(23.3%), intense distress over reminders(24.2%) followed. Common somatic complaints were headache, chest discomfort, extremity pain, backache, and gastrointestinal discomfort. This study revealed that most of the subjects had various psychiatric symptoms after the Sampoong accident.

      • KCI등재

        자폐아동에서 FMR-1 유전자에 대한 분자유전학적 연구

        강경미,곽동일,이민수 大韓神經精神醫學會 1999 신경정신의학 Vol.38 No.6

        연구목적: 자폐장애가 유전성이 있다고 제시하는 많은 쌍생아 및 가족연구와 유전자 연구에도 불구하고 이 질환의 유전방식과 관련 유전자는 현재까지 알려져 있지 않고, 이 장애는 임상적으로 이질적 장애이며 유전방식과 관련 유전자는 현재까지 알려져 있지 않고, 이 장애는 임상적 이질적 장애이며 유전적으로도 다인자 질환일 가능성이 높은 것으로 생각된다. 본 연구에서는 자폐장애와 FMR-1 유전자간의 연관성을 조사하고자 자폐장애 아동 총 66명을 대상으로 분자유전학적 검사를 시행하였다. 방 법: 연구대상군은 DSM-Ⅳ 진단기준으로 자폐장애가 해당하고 K-CARS 점수가 30점 이상인 아동들을 대상으로 하였다. Genomic DNA를 전혈에서 추출한후, 탐침 Xho/PstⅠ과 두 개의 제한효소(EcoR Ⅰ, Eag Ⅰ)를 사용하여 썼던 블롯팅을 시행하였다. 결 과: 연구대상 총 66명중 1명의 남아가 메칠화된 모자이크의 양상을 보이었고, 3명의 남아와 2명의 여아는 불완전 변이 양상을 보이었으나 완전 변이의 양상은 없었다. 결 론: 본 연구에서는 FMR-1 유전자가 자폐장애의 유전적 요인과 관련이 있다는 이전의 보고를 뒷받침할만한 명백한 결과를 얻지 못하였다. Objectives: To elucidate an association of the fragile X syndrome with autism, Southern blot analysis was performed in 66 autistic children aged from 2 years to 11 years. Methods: Subjects were 66 autistic children with of autistic disorder diagnosed by DSM-Ⅳ criteria and Childhood Autism Rating Scale-Korean version. Genomic DNA was extracted from peripheral blood and DNA was used to detect a FMR(Fragile Mental Retardation)-1 gene. Xho/PstI probes and two restriction enzymes(EcoRI, EagI)were used for Southern blot analysis. Results: There were one boy with a methylated mosaic pattern and 3 boys and 2 girls with an unmethylated premutation band. But there was no full mutation pattern. Conclusion: Although the possibility of the relationship between autistic disorder and FMR-1 gene has been suggested, the results from this study do not provide any definite association of FMR-1 gene with autism in autistic children.

      • 축산폐수처리장의 운영실태 및 개선방안에 관한 연구

        정팔진,곽동희,조선영,전민식 전북대학교 공학연구원 ( 구 전북대학교 공업기술연구소 ) 2002 工學硏究 Vol.33 No.-

        This study was carried out to gain operating conditions and performance improvement in J livestock treatment facility. In order to livestock wastewater, Hybrid system (biological treatment and physicochemical treatment) was operated with B3 system and advanced treatment system. Conclusions of this study were as follows: 1. COD and TN was excess design removal efficiency in treatment process 2. Influent quality was are fluctuating sharply 3. The result of biodegradability test was NBD 50%, then was led to biological treatment limit.

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