Mannose 선발체계를 이용한 HSP101 유전자의 배추형질전환

허설혜,민병환 한국식물생명공학회 2010 JOURNAL OF PLANT BIOTECHNOLOGY Vol.37 No.2

A new selectable marker system has been adapted for use in Agrobacterium mediated transformation of Chinese cabbage. This selection system utilizes the pmi gene encoding for phosphomannose-isomerase that converts mannose-6-phosphate to fructose-6-phosphate. Only transgenic plants were able to metabolize the selection agent, mannose, into a usable source of carbon, fructose. Cotyledon explants from 5-day-old seedlings with 2 days pre-culture were infected with Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 harboring a new constructed vector pNWBHSP101 containing the heat tolerance responsible heat shock protein 101 (HSP101) gene with full codon modification. After culture and selection on MS medium supplemented with 3 mg/L BAP, 1 mg/L NAA, 0.6% mannose, 2.0% sucrose. Polymerase chain reaction, Southern blot analysis and Northern blot analysis were used to identify and characterize the transgenic plants with the integrated HSP101 gene. Transgenic plants have been established in soil and flowered in the greenhouse. 새로운 선발마커체계를 이용하여 배추의 자엽에 형질전환을 수행하였다. 이러한 선발체계는 mannose-6-phosphate를 fructose-6-phosphate로 전환시키는 효소인 phosphomannoseisomerase를인지하는 유전자인 pmi 를 사용하여 오직 형질전환식물체만이 mannose를 fructose로 분해하여 탄소원으로 사용할 수 있다는 원리를 이용한 것이다. 발아하여5일된 배추의 자엽을 내서성 유전자인 HSP101이 연결된벡터 pNWB-HSP101을 포함하는 Agrobacterium tumefaciens LBA4404를 접종하였다. 배양 후 3 mg/L BAP, 1 mg/L NAA,0.6% mannose 그리고 2.0% sucrose가 첨가된 MS배지에서선발하였다. PCR분석과 Southern blot 분석 및 Northern blot 분석을 통하여 형질전환식물체내에 HSP101 유전자가 삽입되었음을 확인하였다. 형질전환식물체는 순화과정을 거쳐 온실에서 채종하였다.

Mannose 선발체계를 이용한 HSP101 유전자의 배추형질전환

허설혜,민병환,Hur, Suel-Hye,Min, Byung-Whan 한국식물생명공학회 2010 식물생명공학회지 Vol.37 No.2

새로운 선발마커체계를 이용하여 배추의 자엽에 형질전환을 수행하였다. 이러한 선발체계는 mannose-6-phosphate를 fructose-6-phosphate로 전환시키는 효소인 phosphomannose-isomerase를 인지하는 유전자인 pmi를 사용하여 오직 형질전환식물체만이 mannose를 fructose로 분해하여 탄소원으로 사용할 수 있다는 원리를 이용한 것이다. 발아하여 5일된 배추의 자엽을 내서성 유전자인 HSP101이 연결된 벡터 pNWB-HSP101을 포함하는 Agrobacterium tumefaciens LBA4404를 접종하였다. 배양 후 3 mg/L BAP, 1 mg/L NAA, 0.6% mannose 그리고 2.0% sucrose가 첨가된 MS배지에서 선발하였다. PCR분석과 Southern blot 분석 및 Northern blot 분석을 통하여 형질전환식물체내에 HSP101 유전자가 삽입되었음을 확인하였다. 형질전환식물체는 순화과정을 거쳐 온실에서 채종하였다. A new selectable marker system has been adapted for use in Agrobacterium mediated transformation of Chinese cabbage. This selection system utilizes the pmi gene encoding for phosphomannose-isomerase that converts mannose-6-phosphate to fructose-6-phosphate. Only transgenic plants were able to metabolize the selection agent, mannose, into a usable source of carbon, fructose. Cotyledon explants from 5-day-old seedlings with 2 days pre-culture were infected with Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 harboring a new constructed vector pNWBHSP101 containing the heat tolerance responsible heat shock protein 101 (HSP101) gene with full codon modification. After culture and selection on MS medium supplemented with 3 mg/L BAP, 1 mg/L NAA, 0.6% mannose, 2.0% sucrose. Polymerase chain reaction, Southern blot analysis and Northern blot analysis were used to identify and characterize the transgenic plants with the integrated HSP101 gene. Transgenic plants have been established in soil and flowered in the greenhouse.

FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 고단백질 인도 옥수수계통 신속선발체계 확립 및 라이신과 트립토판 분석

허설혜,남석현,양승균,김석원,민병환 경상대학교 농업생명과학연구원 2016 농업생명과학연구 Vol.50 No.1

This study aims to develop of high throughput screening system for high-protein corn inbredlines from Indian using FT-IR spectroscopy and lysine, tryptophan analysis. Total 48 corninbred lines and cultivars were subjected to FT-IR spectroscopy. 24 lines out of total cornsamples were randomly selected and examined the total protein contents in seed powder usingBradford assay. The inbred line H4 showed the highest total protein content (10.26 ± 0.1mg/L-1)and the content of total protein from Gwangpyeongok maternal line (GPO1) which is domestically evaluated as superior silage corn was 9.34 ± 0.1mg/g. The PLS prediction of totalprotein contents was performed from FT-IR spectra and conducted the cross-validation test forPLS prediction of total protein content. Regression coefficient (R2) was 0.77 indicating thatprediction accuracy was reached to be about 80% after linear regression analysis betweenpredicted and estimated value from 24 inbred lines. Using this PLS prediction modeling, inbredline H4, H6, H11 and H12 were selected for the highest protein content line. The results shownin this study could be applied for screening and selection system of high proteins lines inbreeding of silage corn cultivar. Furthermore, this spectroscopic screening system successfullyapplied for quality evaluation and elite line breeding of corn cultivars. 본 연구에서는 FT-IR 스펙트럼데이터의 다변량 통계분석 기법을 활용하여 인도수집 옥수수 계통 및품종으로부터 단백질 함량이 높은 옥수수를 신속하게 선발할 수 있는 선발체계를 확립함과 동시에lysine과 tryptophan의 함량분석을 목적으로 연구를 수행하였다. 총 48시료의 인도수집 옥수수 계통및 품종과 국내산 품종을 이용하여 종자로부터 FT-IR 스펙트럼을 조사하였으며, 무작위로 선발된 24시료를 대상으로 총 단백질 함량을 조사하였다. 대조구로 사용한 광평옥 모계(GPO1)의 경우 단백질 함량이 9.34 ± 0.3mg/g dw인데 비하여 H4 계통의 경우 단백질 함량이 10.26 ± 0.5mg/g dw로 48개 옥수수 시료 중에서 가장 높게 나타났다. 특히 옥수수 H4, H6, H11, 그리고 H12 계통의 경우 총 단백질함량이 각각 10mg/g dw 이상으로 측정되어 광평옥 모계(9.34mg/g dw)와 부계(9.36mg/g dw) 및 이들의 F1(9.14mg/g dw)보다 총 단백질 함량이 높은 계통으로 판명되었다. Cross-validation test에서옥수수 종자 내 총 단백질 함량예측 PLS regression model의 regression coefficient(R2) 는 0.77로비교적 정확하게 총 단백질 함량예측이 가능한 것으로 나타났다. 따라서 본 PLS regression model을이용하여 단백질 함량이 높은 사일리지 옥수수 계통의 선발이 가능할 것으로 기대되며, 더 나아가 다양한 옥수수 계통의 신속한 대사체 수준 평가가 가능할 것으로 예상된다.

카네이션 (Dianthus caryophillus)의 색소 발현체계 분석

허설혜,안병준,정향영,형남인,민병환 한국식물생명공학회 2009 식물생명공학회지 Vol.36 No.4

본 연구에서는 색소유전자의 전이를 통하여 새로운 색소 발현체계를 가진 품종을 육종하기 위한 기초연구로 카네 이션 (Dianthus caryophyllus)의 꽃봉오리로부터 cDNA-library 를 합성하였고 페튜니아의 CHS, FHT, DFR, ANS 유전자 를 probe로 사용하여 anthocyanin 합성경로의 중요 유전자 들인 카네이션의 CHS, FHT, DFR, 그리고ANS 유전자를 분리하였다. 수집한 카네이션 품종 및 계통으로부터 돌 연변이체를 선발하기 위해 분리한 유전자들를 probe로 사용하여 Northern blot 분석을 수행하여 DFR 돌연변이체 로는 금별, 은별, Ballatyne, Crystal, Eugenia, Koreno, Imp. white sim., W-crystal, W-alpine 및 White charotte등 10개 계 통이 선발되었고 이 중 Eugenia, Imp. white sim. 및 W-alpine 은 DFR과 ANS의 이중돌연변이체로 밝혀졌고 Koreno는 DFR과 CHS의 이중돌연변이로 사려되며, 금별, Ballatyne 은 DFR, CHI의 이중 돌연변이체로 판명되어 목적식물에 서 제외되고 최종적으로 은별, Crystal, West crystal, White charotte 그리고 이미 유전적으로 DFR 돌연변이체로 선발 된 Verginie를 포함하여 총 5계통의 카네이션이 목적식물 로 선발되었다. 선발된 DFR 돌연변이체의 확인을 위하 여 유전자의 효소활성을 측정해 본 결과 5품종의 카네이 션 모두 DFR 활성을 가지고 있지 않음을 확인하였다 This study aimed to develop carnation cultivars with new coloring system. We used four genes of Petunia hybrida - chalcone synthase (CHS), flavanone 3-hydroxylase (FHT), dihydroflavonol 4-reductase (DFR), and anthocyanidin synthase (ANS) - as probes, in order to isolate four genes from carnations (Dianthus Caryophyllus). The isolated genes were used as probes in order to select mutants out of collected carnations, using Northern blot analysis. The Northern blot analysis revealed 10 DFR mutants - Gumbyul, Eunbyul, Ballatyne, Crystal, Eugenia, Koreno, Imp. White Sim, West Crystal, White Alpine, and White Charotte. Six among the selected 10 cultivarswere excluded from the target cultivars, because Eugenia, Imp. White Sim, and White Alpine were proved to be double mutants of DFR and ANS, Koreno was considered to be a double mutant of DFR and CHS, and Gumbyul and Ballatyne were proved to be double mutants of DFR and CHI (Chalcone isomerase). Consequently, we selected five DFR mutants, including Virginie, which was already selected as a DFR mutant. Finally, we measured DFR activities in order to confirm the selection, and the results showed that all of the five cultivars - Eunbyul, Crystal, West Crystal, White Charotte, and Virginie - had got no DFR activity.

Rapid Discrimination of F1Hybrid Seeds from Their Parental Lines and Selection of Protein-Rich Corn Lines forSilage Corn Breeding Using FT-IR Spectroscopy Combined by Multivariate Analysis

허설혜,남석현,양승균,김석원,민병환 한국작물학회 2015 Journal of crop science and biotechnology Vol.18 No.3

This study aims to establish the discrimination of F1 hybrid seeds from their parental lines and rapid selection of proteinrich lines from inbreeding lines of corn using FT-IR spectroscopy combined by multivariate analysis. Eight individual seeds from the maternal and paternal lines of Gwangpyeongok and their F1 progeny seeds were subjected to FT-IR spectroscopy. A total of 176 corn inbreeding lines including commercial corn cultivars were subjected to FT-IR spectroscopy. To establish the prediction model for total protein content from corn seed, 33 corn inbreeding lines out of 176 were randomly selected and total seed protein contents using Bradford assay were examined. PLS-DA (partial least square regression discriminant analysis) could clearly discriminate F1 hybrid seeds from their parental lines. PC (principal component) loading values show that 1,700 1,500 cm-1 and 1,200 - 900 cm-1 regions of FT-IR spectra are significantly important for discrimination of corn lines. The prediction model for total protein contents was established by PLS (partial least square regression) algorithm, and its accuracy was confirmed by cross-validation test (R2 = 0.94). After external validation fromexternal 25 corn inbreeding lines, regression coefficient (R2) was 0.78 which indicated that the prediction model had relatively good accuracy. Thus, considering these results we suggest that FT-IR combined with multivariate analysis could be applied as a novel tool for high-throughput screening of F1 hybrid seeds from their parental lines and protein-rich lines for breeding of silage corn cultivar.

플라보노이드생합성 관련 유전자의 분리 및 발현체계 구축

허설혜,서민지,민병환 한국육종학회 2010 한국육종학회 학술발표회 발표요지 Vol.42 No.1

FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 곶감의 원산지 및 품종 식별

허설혜(Suel Hye Hur),김석원(Suk Weon Kim),민병환(Byung Whan Min) 한국식품과학회 2015 한국식품과학회지 Vol.47 No.1

본 연구에서는 상업용 곶감의 꽃받침과 종자를 이용하여 대사체 수준에서의 원산지와 품종 식별 체계를 확립하였다. 실험에 이용된 곶감 시료는 국내산 곶감 함안수시(Hamansusi), 예천고종시(Yecheongojongsi), 산청단성시(Sancheongdanseongsi), 그리고 논산월하시(Nonsanwalhasi) 4개 품종과 국내에서 판매되고 있는 중국산 곶감 2개 종류의 꽃받침과 종자를 사용하였으며, 꽃받침과 종자 시료의 전세포 추출물로부터 FT-IR 스펙트럼 데이터를 기반으로 다변량 통계분석(PCA, PLS-DA)을 실시하였다. 이 결과 국내산 곶감 4품종과 중국산 곶감 2종류가 두 그룹으로 확연히 나뉘어지는 것을 확인할 수 있었다. 상업용 곶감의 꽃받침을 PLS regression을 실시한 결과 국내산과 중국산 곶감을 100% 예측할 수 있었다. 또한 곶감 종자를 이용하여 품종 식별한 결과 각 4개의 그룹으로 나뉘어지는 것을 확인할 수 있었으며, PLS regression을 실시한 결과 약 86%의 정확도로 품종 식별이 가능함을 알 수 있었다. FT-IR 스펙트럼 분석의 간편성과 신속성을 고려할때, 본 연구 결과는 상업용 곶감에 대한 원산지나 품종 식별의 신속한 수단으로 활용할 수 있을 것으로 예상된다. 더 나아가 본 기술을 이용하여 다른 농산물의 원산지 또는 품종 식별 수단으로 활용이 가능할 것으로 기대된다. This study aimed to establish a rapid system for discriminating the cultivation origins and cultivars of dry persimmons, using metabolite fingerprinting by Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy combined with multivariate analysis. Whole-cell extracts from the sepals of four Korean cultivars and two different Chinese dry persimmons were subjected to FT-IR spectroscopy. Principle component analysis (PCA) and partial least squares discriminant analysis (PLSDA) of the FT-IR spectral data successfully discriminated six dry persimmons into two groups depending on their cultivation origins. Principal component loading values showed that the 1750-1420 and 1190-950 cm<SUP>?1</SUP> regions of the FTIR spectra were significantly important for the discrimination of cultivation origins. The accuracy of prediction of the cultivation origins and cultivars by PLS regression was 100% (p<0.01) and 85.9% (p<0.05), respectively. These results clearly show that metabolic fingerprinting of FT-IR spectra can be applied for rapid discrimination of the cultivation origins and cultivars of commercial dry persimmons.

FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 옥수수의 선발 및 예측 모델링

허설혜(Suel-Hye Hur),김석원(Suk-Weon Kim),양승균(Seung-Gyun Yang),민병환(Byung-Whan Min) 한국원예학회 2012 한국원예학회 학술발표요지 Vol.2012 No.10

FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 고단백질 인도 옥수수계통 신속선발체계 확립 및 라이신과 트립토판 분석

허설혜,남석현,양승균,김석원,민병환 경상대학교 농업생명과학연구원 2016 농업생명과학연구 Vol.50 No.1

본 연구에서는 FT-IR 스펙트럼데이터의 다변량 통계분석 기법을 활용하여 인도수집 옥수수 계통 및 품종으로부터 단백질 함량이 높은 옥수수를 신속하게 선발할 수 있는 선발체계를 확립함과 동시에 lysine과 tryptophan의 함량분석을 목적으로 연구를 수행하였다. 총 48시료의 인도수집 옥수수 계통 및 품종과 국내산 품종을 이용하여 종자로부터 FT-IR 스펙트럼을 조사하였으며, 무작위로 선발된 24시 료를 대상으로 총 단백질 함량을 조사하였다. 대조구로 사용한 광평옥 모계(GPO1)의 경우 단백질 함량 이 9.34 ± 0.3mg/g dw인데 비하여 H4 계통의 경우 단백질 함량이 10.26 ± 0.5mg/g dw로 48개 옥 수수 시료 중에서 가장 높게 나타났다. 특히 옥수수 H4, H6, H11, 그리고 H12 계통의 경우 총 단백질 함량이 각각 10mg/g dw 이상으로 측정되어 광평옥 모계(9.34mg/g dw)와 부계(9.36mg/g dw) 및 이 들의 F1(9.14mg/g dw)보다 총 단백질 함량이 높은 계통으로 판명되었다. Cross-validation test에서 옥수수 종자 내 총 단백질 함량예측 PLS regression model의 regression coefficient(R2) 는 0.77로 비교적 정확하게 총 단백질 함량예측이 가능한 것으로 나타났다. 따라서 본 PLS regression model을 이용하여 단백질 함량이 높은 사일리지 옥수수 계통의 선발이 가능할 것으로 기대되며, 더 나아가 다양 한 옥수수 계통의 신속한 대사체 수준 평가가 가능할 것으로 예상된다. This study aims to develop of high throughput screening system for high-protein corn inbred lines from Indian using FT-IR spectroscopy and lysine, tryptophan analysis. Total 48 corn inbred lines and cultivars were subjected to FT-IR spectroscopy. 24 lines out of total corn samples were randomly selected and examined the total protein contents in seed powder using Bradford assay. The inbred line H4 showed the highest total protein content (10.26 ± 0.1mg/L-1) and the content of total protein from Gwangpyeongok maternal line (GPO1) which isdomestically evaluated as superior silage corn was 9.34 ± 0.1mg/g. The PLS prediction of total protein contents was performed from FT-IR spectra and conducted the cross-validation test for PLS prediction of total protein content. Regression coefficient (R2) was 0.77 indicating that prediction accuracy was reached to be about 80% after linear regression analysis between predicted and estimated value from 24 inbred lines. Using this PLS prediction modeling, inbred line H4, H6, H11 and H12 were selected for the highest protein content line. The results shown in this study could be applied for screening and selection system of high proteins lines in breeding of silage corn cultivar. Furthermore, this spectroscopic screening system successfully applied for quality evaluation and elite line breeding of corn cultivars.

양파의 인경조직으로부터 체세포 배발생 및 식물체 재생에 미치는 생장조절제의 영향

허설혜,민병환 경상대학교 농업생명과학연구원 2015 농업생명과학연구 Vol.49 No.4

양파는 Allium에 속하는 조미채소로 한국을 포함한 동아시아 지역에서 경제적으로 중요한 작물이다. 본 연구에서는 슈퍼생생과 뉴마르스 양파 2개 품종의 인경 부위를 이용하여 kinetin 농도 별 백색 체세포배 캘러스 형성율을 조사하였다. 양파의 백색 체세포배 캘러스를 얻기 위하여 실시된 배양 조건은 1mg/L 2.4-D를 첨가한 B5배지를 기본으로 25℃ Dark에서 배양하였다. 관찰하고자 한 kinetin의 농도는 0mg/L, 0.1mg/L, 0.3mg/L, 1mg/L, 3mg/L로 정하여 실험하였으며, MSB배지에서 배양된 2개 품종의 양파인경을 얇게 잘라 B5배지에 치상하였다. 양파의 인경 조직 중 가장 안쪽 부분부터 반응이 시작되어 백색 체세포 배 캘러스가 형성되는 것을 kinetin 농도 별로 배양한 2주 후부터 관찰할 수 있었다. 양파 2개 품종의 인경 조직을 B5배지에 배양한 8주 후에 백색 체세포 배 캘러스 형성율을 조사하였다. 그 결과 슈퍼생생과 뉴마르스의 인경 조직에서 1mg/L 2,4-D와 0.3mg/L 그리고 1mg/L kinetin이 혼용처리 된 B5배지에서 73%와 66.7%로가장 높게 나타나는 것을 알 수 있었다. 본 연구에서 확립된 슈퍼생생과 뉴마르스의 인경 조직을 이용한 백색 체세포배 캘러스 형성 조사 결과는 추후 양파의 식물체 재분화 유도 및 대량증식 연구분야에 활용이 가능할 것으로 기대된다. The study was undertaken to develop an efficient protocol for in vitro regeneration of Oinion(Allium cepa L.). Two local onion varieties(Supersengseng and Newmars) were used as experimental materials where basal discs were used as explants. To obtain regeneration system of onion, we analyzed the effect of kinetin concentration on the embryogenic callus induction from bulb tissue. The highest embryogenic callus induction ratio was shown on MS B5 medium(Murashige and Skoog Including Gamborg B5 Vitamins) containing 1mg/L 2.4-D and 0.3mg/L kinetin after mature embryos were placed on B5 medium. When induced callus were cultured on MS medium containing 2mg/L BA and 0.1mg/L NAA, the shoot formation ratio was observed. The suspension cultured cell clumps could be mass propagated. Embryogenic callus were friable, but non-embryogenic callus included a lot of moisture, hence the identification between embryogenic and non-embryogenic callus as easily achieved. Tissue culture is a fascinating tool which allows the rapid production of genetically identical, high yield disease resistance, long shelf life plants using relatively smaal amounts of water, space, supplies and time.