Molecular Cloning and Analysis of Phosphate Specific Transport (pst) Operon from Serratia marcescens KCTC 2172

Seung-Jin Lee(이승진),Yong-Seok Lee(이용석),Sang-Cheol Lee(이상철),In-Hye Park(박인혜),Soon-Cheol Ahn(안순철),Yong-Lark Choi(최용락) 한국생명과학회 2009 생명과학회지 Vol.19 No.5

S. marcescens KCTC 2172로부터 유전자 은행을 작성하여 재조합 클론 pDH3를 얻었으며, pDH3 유래의 서브클론을 작성하였다. 플라스미드 pPH4의 전염기서열 5,137 bp 영역을 결정한 결과 3개의 ORF가 있음을 확인하였다. 이들은 pst 오페론의 pstC, pstA, 및 pstB, 세 유전자를 동일 전사방향으로 코드하고 있었다. 타 세균의 유전자와 비교한 결과 S. marcescens의 pst 오페론은 pstS와 phoU가 결손되어 있다. 조절영역에는 CRP 결합영역과 pho box 서열이 존재하였다. 보고된 유전자와 상동성 조사결과, PstC 단백질은 Yersinia sp., Vibrio sp. 및 Pseudomonas sp.와는 49, 37, 33%의 상동성을, PstA 단백질은 Yersinia sp., Vibrio sp. 및 Pseudomonas sp.와 64, 51, 47%의 상동성을, PstB 단백질은 Methanocaldococcus sp., E. coli 및 Mycoplasma sp.와 60, 50, 48%의 상동성을 나타내었다. Pst 유전자들은 조절영역의 cAMP-CRP 복합체에 의해 in vivo에서 양성적으로 발현됨을 확인하였다. Pst 오페론을 포함하는 플라스미드를 도입한 대장균은 인산운송에 관여하는 능력을 확인하였다. A recombinant plasmid, pDH3, was obtained from the genomic library of Serattia marcescens KCTC 2172, and several recombinant subclones constructed from pDH3. The nucleotide sequence of a 5,137 bp segment, pPH4, was determined and three open reading frames were detected. The three ORFs encoded the phosphate specific transport (pst) operon, which was pstC, pstA, and pstB, with the same direction of transcription. Comparison of the pst operon of S. marcescens with that of other organisms revealed that the genes for pstS and phoU were missing. A potential CRP bonding site and pho box sequence was found in the upstream of the putative promoter at the regulatory region. Analysis of the nucleotide sequence showed that homology in amino acid sequences between the PstC protein and Yersinia sp., Vibrio sp., and Pseudomonas sp. were 49, 37 and 33%, respectively. The PstA protein and Yersinia sp., Vibrio sp., and Pseudomonas sp. showed homologies of 64, 51, and 47%, respectively. PstB protein and Methanocaldococcus sp., E. coli, and Mycoplasma sp. showed homologies of 60, 50, and 48%, respectively. The pst genes could be expressed in vivo and positively regulated by cAMP-CRP. The E. coli strain harboring plasmid pPH7, with pst genes, increased with the transport of phosphate.

유전자 조작 , 균주분리 / Serratia marcescens 에서 maltose 대사를 촉진하는 유전자의 클로닝 및 해석

이승진(Seung Jin Lee),유주순(Ju Soon Yoo),김혜선(Hae Sun Kim),이상철(Sang Cheol Lee),정수열(Soo Yeol Chung),최용락(Yong Lark Choi) 한국미생물생명공학회 2000 Korean Journal of Applied Microbiology and Biotech Vol.28 No.1

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sfs1 유전자의 cAMP - cAMP receptor protein 에 의한 발현 조절

최용락(Yong Lark Choi),유주순(Ju Soon Yoo),이승진(Seung Jin Lee),이희영(Hee Young Lee),정수열(Soo Yeol Chung) 한국응용생명화학회 1996 Applied Biological Chemistry (Appl Biol Chem) Vol.39 No.3

We have cloned several E. coli sfs genes which stimulate mal gene expression with crp^(*1). One the sfs genes (pPVC2) was sequenced and potential CRP binding site is located in the upstream of the putative promoter in the regulatry region. In order to investigate the regulation of the sfs1 gene by the cAMP-CRP complex, we have constructed the sfs-lacZ fusion gene in this research. The overall transcriptional stimulations of sfs1 gene in the presence CAMP were confirmed by β-galactosidase activity and Western blot analysis of sfs1-lacZ fusion gene. Transcriptional regulation by AMP-CRP was also confirmed by Northern blot analysis. End-labelled DNA of the DNA fragment in sfs1 regulatory region were used for gel retardation assay to examine the CRP-DNA complex in the presence of cAMP. Results here indicate that CRP binding site in the regulatory region of sfs1 gene is positive regulator for the expression of sfs1 gene.

sfs1 유전자의 cAMP-cAMP receptor protein에 의한 발현 조절

유주순,이승진,이희영,정수열,최용락,Yoo, Ju-Soon,Lee, Seung-Jin,Lee, Hee-Young,Chung, Soo-Yeol,Choi, Yong-Lark 한국응용생명화학회 1996 Applied Biological Chemistry (Appl Biol Chem) Vol.44 No.1

We have cloned several E. coli sfs genes which stimulate mal gene expression with $crp^{{\ast}1}$). One the genes (pPVC2) was sequenced and potential CRP binding site is located in the upstream of the putative promoter in the regulatory region. In order to investigate the regulation of the sfs1 gene by the cAMP-CRP complex, we have constructed the sfs-lacZ fusion gene in this research. The overall transcriptional stimulations of sfs1 gene in the presence cAMP were confirmed by ${\beta}-galactosidase$ activity and Western blot analysis of sfs1-lacZ fusion gene. Transcriptional regulation by cAMP-CRP was also confirmed by Northern blot analysis. End-labelled DNA of the DNA fragment in sfs1 regulation region were used for gel retardation assay to examine the CRP-DNA complex in the presence of cAMP. Results here indicate that CRP binding site in the regulatory region of sfs1 gene is positive regulator for the expression of sfs1 gene. $crp^{\ast}$ 유전자가 도입된 대장균 MK2001($crp^{{\ast}1}$}, cya::km)을 숙주로 사용하여 mal 유전자 발현을 촉진시키는 유전자의 하나인 sfs1(sugar fermentation stimulation)의 구조해석 결과에 의하면, 잠정적인 sfs1의 promoter 영역에는 CRP 단백질과의 결합영역으로 보이는 염기배열이 존재하였다. 본 실험에서는 sfs1 유전자의 cAMP-CRP에 의한 발현 조절을 확인하고자, lacZ 와의 융합 유전자를 작성하였다. 작성된 융합 유전자는 cya 결손주인 Tp2010에서 cAMP의 첨가에 의해 ${\beta}-galactosidase$ 활성이 크게 증가하였으며, Western blotting의 실험에서도 같은 결과를 나타냈다. in vivo에서 발현이 확인된 전사산물은 cAMP에 의해 전사 촉진이 일어났으며, CRP의 결합부위로 예상되는 DNA 영역은 cAMP가 존재하면 CRP 단백질과 결합하는 특성을 나타내었다. 이상의 결과로 보아, sfs1 유전자의 발현은 UMP-CRP에 의한 전사촉진 현상을 받는 것으로 나타났다.

Cellulose 생합성 세균의 분리 및 특성

이승진,유주순,정수열,최용락 ( Seung Jin Lee,Ju Soon Yoo,Soo Yeol Chung,Yong Lark Choi ) 한국응용생명화학회 1997 Applied Biological Chemistry (Appl Biol Chem) Vol.40 No.2

A screening was performed to isolate the cellulose-producing microorganisms from vinegar in Korea. The isolated strain was identified as Acetobacter sp. with respect to physiological and biochemical characteristics and designated as Acetobacter CBI-2. Cellulose production of Acetobacter CBI-2 was equal with the well known cellulose-producing bacteria, A. xylinum. The result of separation on thin layer chromatography(TLC) was consistent with the degradation product of native cellulose. The presence of genes required for the cellulose biosynthesis in Acetobacter CBI-2 was confirmed by Southern hybridization.

Cellulose 생합성균주 Acetobacter sp. CBⅡ의 분리 및 특성

이승진,유주순,최용락 동아대학교 환경문제연구소 2000 硏究報告 Vol.23 No.1

The strain of cellulose-producing CBⅡ was isolated from the traditionally fermented persimmon vinegar, and identified as Acetobacter sp. CBⅡ with respect to physiological and biochemical characteristics. The isolated strain was cultivated statically in broth culture, a thick cellulose pellicle was formed. It was found that the strain was fluorecenced with UV light when the strain was cultivated agar medium contained Tinopal. The strain produced acetic acid from ethanol, and then decomposed acetate to CO₂ and H₂O. Capacity of cellulose biosynthesis from isolated strain was compared with Acetobacter xylinum ATCC 53582. The cellulose produced by the isolated strain was purified and cegraded by HCl. The released sugar was separated on thin layer chromatograpy(TLC) consistent with the degradation product of native cellulose.

sfs1 유전자의 cAMP-cAMP receptor protein에 의한 발현 조절

이희영,이승진,유주순,최용락,정수열 東亞大學校附設遺傳工學硏究所 1997 遺傳工學硏究 Vol.- No.4

crp* 유전자가 도입된 대장균 MK2001(crp, cya::km)을 숙주로 사용하여 mal 유전자 발현을 촉진시키는 유전자의 하나인 sfs1(sugar fermentation stimulation)의 구조해석 결과에 의하면, 잠정적인 sfs1의 promoter영역에는 CRP단백질과의 결합영역으로 보이는 염기배열이 존재하였다. 본 실험에서는 sfs1 유전자의 cAMP-CRP에 의한 발현 조절을 확인하고자, lacZ와의 융합 유전자를 작성하였다. 작성된 융합 유전자는 cya결손주인 TP2010에서 cAMP의 첨가에 의해 B-galactosidase 활성이 크게 증가하였으며, Western blotting의 실험에서도 같은 결과를 나타냈다. in vivo에서 발현이 확인된 전사산물은 cAMP에 의해 전사 촉진이 일어났으며, CRP의 결합부위로 예상되는 DNA영역은 cAMP가 존재하면 CRP단백질과 결합하는 특성을 나타내었다. 이상의 결과로 보아, sfs1 유전자의 발현은 cAMP-CRP에 의한 전사촉진 현상을 받는 것으로 나타났다. We have cloned several E. coli sfs genes which stimulate mal gene expression with ??. One the sfs genes(pPVC2) was sequenced and potential CRP binding site is located in the upstream of the putative promoter in the regulatry region. In order to investigate the regulation of the sfs1 gene by the cAMP-CRP complex, we have constructed the sfs-lacZ fusion gene in this research. The overall transcriptional stimulations of sfs1 gene in the presence cAMP were confirmed by B-galactosidase activity and Western blot analysis of sfs1-lacZ fusion gene. Transcriptional regulation by cAMP-CRP was also confirmed by Northern blot analysis. End-labelled DNA of the DNA fragement in sfs1 regulatory region were used for gel retardation assay to examine the CRP-DNA complex in the presence of cAMP. Results here indicate that CRP binding site in the regulatory region of sfs1 gene is positive regulator for the expression of sfs1 gene.

대장균 sfs 유전자의 전사조절

이희영,유주순,정수열,이승진,최용락 東亞大學校附設遺傳工學硏究所 1996 遺傳工學硏究 Vol.- No.3

sfs(sugar fermentation stimulation) 유전자는 crp*¹이 도입된 MK2001 균주에서 mal 유전자의 발현을 촉진시키는 특성으로서 클로닝 되어졌다. sfs4 유전자의 발현은 두 개의 promoter에 의하여 조절되어진다. 본 연구는 이들 두 promoter (P₁과 P₂)의 cAMP-CRP에 의한 발현조절을 보고자 조절영역과 CRP 결합영역에 변이가 도입된 DNA가 in vitro transcription 방법에 의해 확인되어졌다. 두 개의 promoter가 공존시에는 cAMP에 의한 P₂의 전사는 촉진되어졌으며, P₁의 전사는 억제되어졌다. P₂만이 존재할 때에도 전사는 cAMP에 의하여 촉진되어졌다. CRP 결합부위에서의 변이는 cAMP에 의한 전사촉진이 크게 감소하였다. sfs7 (nlp) 유전자의 전사산물을 확인하였으며, 이는 cAMP에 의한 발현조절을 받지 않았다. sfs(sugar fermentation stimulation) genes are involved in regulation of mal gene expression with the altered crp*¹ gene. Expression of the sfs4 gene appeared to be regulated by a two promoters. In this research, the cAMP-CRP dependent regulation of P₁ and P₂ promoter of sfs4 was examined by in vitro transcription using the regulatory region and mutated DNA of the CRP binding region. The transcription of sfs4 from P₂ is stimulated, but P₁ was totally repressed by in vitro transcription. In mutant in the CRP binding region, the effect of activation by cAMP was severely reduced. The transcript of sfs7(nlp) was identified and regulation by cAMP was not observed at the mRNA level.

Cellulose 생합성 세균의 분리 및 특성

이승진,유주순,정수열,최용락 東亞大學校附設遺傳工學硏究所 1998 遺傳工學硏究 Vol.- No.5

발효시켜서 만드는 감식초에서 시료를 채취하여 배양하고, pellicle을 형성하는 single colony를 cellulose생합성균으로 분리하였다. 분리된 균주는 형태적 특성, 알콜의 재산화 등의 생리, 생화학적 특성 등에 의하여 Acetobacter속으로 분류되었으며, Acetobacter CBI-2라고 명명하였다. Acetobacter CBI-2는 정지배양 시에 기존의 생합성 균주로 알려진 Acetobacter xylinum과 대등한 cellulose생합성 능력을 나타내었다. Acetobacter CBI-2이 생성한 고분자물질의 분해산물을 TLC법으로 확인한 결과 기존 cellulose의 것과 일치하였다. Acetobacter CBI-2에서 genomic DNA를 분리 정제하여 cel A 영역을 probe로 하여 hybridization시킨 결과, 상동성을 나타내어 분리 균주에는 cellulose 생합성 관련 유전자가 존재함을 나타내었다.(1997년 1월 7일 접수, 1997년 2월 24일 수리). A screening was performed to isolate the cellulose-producing microorganisms from vinegar in Korea. The isolated strain was identified as Acetobacter sp. with respect to physiological and biochemical characteristics and designated as Acetobacter CBI-2. Cellulose production of Acetobacter CBI-2 was equal with the well known cellulose-producing bacteria, A.xylinum. The result of separation on thin layer chromatography (TLC) was consistent with the degradation product of native cellulose. The presence of genes required for the cellulose biosynthesis in Acetobacter CBI-2 was confirmed by Southern hybrization.

Serratia marcescens 에서 maltose 대사를 촉진하는 유전자의 클로닝 및 해석

이승진,유주순,김혜선,이상철,정수열,최용락 한국산업미생물학회 2000 한국미생물·생명공학회지 Vol.28 No.1

Serratia 균주에서 crp 유전자의 분자적 특성 및 cAMP에 의한 발현조절을 받는 분자기구를 보고자, MacConkey 배지에서 maltose를 탄소원으로 충분히 이용하지 못하는 대장균 TP2139 (Δcrp, Δlac)를 이용하여 염색체 DNA를 library로 작성하여 얻은 형질전환체 약 일만 개의 콜로니에서 red colony를 나타내는 5종류의 양성 클론을 얻었다. 이들 클론을 확인한 결과 pCKB12 클론은 crp 유전자, pCKB13은 CoA transferase 유전자를 coding하고 있음을 확인하였다. 본 연구는 미해석된 클론인 pCKB17에 대하여 해석하였다. MacConkey 배지에서 maltose를 탄소원으로 이용하는 것을 기준으로 몇몇 subclone을 얻었으며, 이들은 다복제 조건하에서의 maltose 이용능이 증가하였다. 따라서 이 유전자를 mms(maltose metabolism stimulation)이라명하였다. 유전자산물의 확인을 위하여 SDS-PAGE로 확인한 결과 대량생산된 29 kDa의 발현산물을 얻어냈다. mms 유전자의 대량발현이 유도되는 조건하에서는 malE 유전자의 산물인 MBP 단백질의 발현이 증대됨을 확인하였다. Southern blot으로 확인한 결과 얻어진 클론은 Serratia sp. 염색체 유래임을 확인하였다. We have got several clones from Serratia marcescens which stimulated the cells to use maltose as a carbon source in Escherichia. coli TP2139(Δlac, Δcrp). One of the cloned genes, pCKB17, was further analyzed. In order to find whether the increased expression of the gene was under the direction of maltose metabolism, we constructed several recombinant subclones. We have found that the clone, pCKB17AV, codes maltose metabolism stimulation(mms) gene. E. coli transformed with the cloned gene showed increase in the activity of maltose utilzation. The recombinant proteins expressed by multicopy and induction with IPTG, one polypeptide of 29-kDa, was confirmed by SDS-PAGE. The overexpression of maltose-binding proter protein in the presence of mms gene was confirmed by Western blot analysis. Southern hybridization analysis confirmed that the cloned DNA fragment was originated from S. marcescens chromosomal DNA.