Serratia marcescens에서 cAMP receptor protein(CRP)유전자의 클로닝 및 해석

유주순,문종환,정수열,김혜선,최용락 東亞大學校附設遺傳工學硏究所 1999 遺傳工學硏究 Vol.- No.6

전사조절인자로서 잘 알려져 있는 cAMP receptor protein(CRP)은 cAMP와 DNA에 결합하는 특별한 활성을 가지고 있으며, cAMP-CRP complex를 형성하여 수많은 유전자의 발현조절에 관여한다. 이러한 측면에서 cAMP-CRP의 조절은 어떤 면에서 총체적 조절체계라고까지 한다. 본 연구는 Serratia 균주에서 crp유전자의 분자적 특성 및 cAMP에 의한 발현조절을 받는 분자기구를 해석하고자 유전자를 클로닝하고 발현을 확인하였다. MacConkey배지에서 maltose를 탄소원으로 충분히 이용하지 못하는 대장균 TP2139(△crp,△lac)를 숙주로 이용하고, 염색체DNA를 library로 작성하여 얻은 형질전환체 약 일만개의 콜로니에서 red colony를 나타내는 5종류 의 양성 클론을 얻었다. 이들 클론을 Southern방법으로 확인한 결과 3kb의 단편을 가진 pCKB12클론이 crp유전자를 coding하고 있음을 확인하였다. glpD-lacZ 융합 plasmid인 pLDC6 의 BamHI부위에 pCKB12의 3kb 단편을 삽입시킨 재조합 plasmid pLDC 6-Scrp를 작성하여, 클로닝된 Serratia 의 crp 유전자가 대장균에서 유전자 전사조절에 미치는 영향을 확인한 결과 cAMP-CRP 복합체 형성에 의한 전사조절 기능이 확인되어졌다. One of the better-characterized transcription factor of E. coli is the cAMP receptor protein(CRP) and the CRP binds cAMP and DNA. The cAMP-CRP complex is involved in regulation of many genes at bacteria. The cAMP-CRP regulatory element represents, in some respects, a global regulatory network. The aim of this work was to study the structure and the mechanisms controlling the expression of CRP in Serratia marcescens. We have been get 5 different clones from Serratia which stimulated the cells to use maltose as a sole carbon source in E. coli TP2139. The crp gene clone, pCKB12, was confirmed by Southern hybridization with E. coli crp gene. The location of the crp gene was determined by constructing subclones carrying various portions of pCKB12. To investigate the potential role of CRP in E. cloi, lacZ fused plasmids were constructed and investigated the β-galactosidase activity of the fused plasmid. The Serratia marcescens cAMP receptor protein can substitute the E. coli CRP in transcriptional activation at the lacZ gene. These results suggest that Serratia marcescens cAMP receptor protein complex functions to regulate several promoters in E. coli.

sfs유전자의 malE유전자 발현 촉진

정수열,이희영,최용락 東亞大學校附設遺傳工學硏究所 1995 遺傳工學硏究 Vol.- No.2

CRP에 변이가 도입된 crp*¹ 유전자를 통하여 cloning된 sfs(sugar fermentation stimulation)유전자 중 nlp와 sfs4 유전자가 maltose 및 maltodextrin의 운반에 관여하는 유전자들 중에서 MalE 단백질을 증가시킴을 immunoblotling을 통하여 확인했다. 즉 MalE 단백질은 periplasmic에 존재하면서 cytoplasmic membrane에 존재하는 MalFGK 단백질과 반응하여 cytoplasm내로 maltose, maltodextrin을 운반하는 MBP(maltose binding protein)로 밝혀져 있다. Most crp* mutants isolated so far were capable of fermenting lactose despite the absence of cAMP, however, they could ferment other sugar such as maltose in the presence of cAMP. nlp and sfs4 genes, which stimulated the maltose metabolism in a crp*¹, cya::km(MK2001) host system. Especially, MalE protein(malE gene: MBP: maltose binding protein), that is transport protein with maltose and maltodextrin in periplasmic, were increased in the cloned with nlp and sfs4 genes.

Evaluation of Preparation Methods for Scanning Electron Microscopic Observation of Plant Protoplasts

MAEDA,Eizo,SATO,Tadahiko,Oh,Chang Kwon,TANIGUCHI,Takeshi,MIYAKE,Hiroshi 東亞大學校附設遺傳工學硏究所 1996 遺傳工學硏究 Vol.- No.3

佐藤忠彦·權 五昌**·三宅 博·谷口 武·前田英三 (名古屋大學農學部·**韓國東亞大學校農科大學) 要 旨:ペチュニアとイネのプロトプラストを用いて, 走査電子顯微鏡の試料調製法の檢討を行つた. アルコ-ル脫水處理中に生じるプロトプラストの形狀變化を??減するための固定條件を調査した. その結果, 固定條件の違いにより, 脫水處理により生じゐプロトプラストの體積の減少にかなりの差が認められ, グルタルアルデヒド固定, グルタルアルデヒド·オスミウム固定, グルタルアルデヒド·タンニン酸·オスミウム固定の順に, 體積の減少が少なくなつた, グルタルアルデヒド單獨固定の場合に, ペチュニア葉由來プロトプラストの葉綠體の綠色は, アルコ-ル脫水により脫色した. グルタルアルデヒド·タンニン酸·オスミウムで固定すゐと, ペチュニアとイネのプロトプラストの良く保存された走査電子顯微鏡像が得られた. Preparation methods for scanning electron microscopy (SEM) were studied with petunia and rice protoplasts. Fixation schedules to sustain protoplast size during alcohol dehydration were examined. When the different fixations were compared, the decrease in protoplast volume was observed to a variable extent during the dehydration process. The extent of volume decrease was reduced in order of glutaraldehyde, glutaraldehyde-osmium tetroxide, and glutaraldehyde-tannic acid-osmium tetroxide schedules. When fixed only with glutaraldehyde, the green color of the chloroplast in petunia leaf protoplasts was lost during alcohol dehydration. Well-defined scanning electron micrographs of petunia and rice protoplasts were obtained using a glutaraldehyde-tannic acid-osmium tetroxide schedule.

누에의 親子集團에 있어서 量的形質의 遺傳分析

鄭元福,金承烈 東亞大學校附設遺傳工學硏究所 1994 遺傳工學硏究 Vol.- No.1

누에의 品種育成을 위한 遺傳的 基礎情報를 얻기 위해 8개 品種을 二面交雜하여 얻은 F1世代에 대한 遺傳子의 分布狀態와 分散成分등을 分析한 結果를 要約하면 다음과 같다. 각 形質에 대한 分散分析의 결과는 相加的效果, 優性效果, 母本效果, 正逆間效果에서 全齡經過, 5齡經過, 雌雄繭層重, 1ℓ顆數, 1ℓ重量등이 有意하였다. Vr-Wr graph에서 雌單繭重이 超優性을 나타내고, 나머지 形質은 모두 不完全優性으로 나타내고, 나머지 形質은 모두 不完全優性으로 遺傳되었다. 遺傳 分散成分에서 5齡經過, 雌雄單繭量, 雌雄繭層重, 雌雄繭層比率, 1ℓ顆數, 1ℓ重量, 雌雄繭長, 雌雄繭幅등은 遺傳子의 相加的效果가 優性效果보다 크게 평가되었다. 峽義의 遺傳力은 모든 形質에서 0.67이상으로 높았다. 優性의 方向은 全齡經過, 雌繭層比率, 1ℓ顆數가 負이고, 다른 形質은 正으로 表現되었다. In this experiment, gene actions were analyzed for eight silkworm parents in order to obtain basic information on their genetic improvement by diallel crosses. The results obtained were summarized as follows. In analysis of variance, significantly additive, dominant, maternal and reciprocal effects were observed in instar period, cocoon layer weight, number of cocoons per liter and weight of cocoon per liter. Based on the Vr-Wr graphical analysis, the characters, total instar period, fifth instar period, male of cocoon weight, female of cocoon layer weight, male of cocoon layer weight, female of cocoon layer ratio, male of cocoon layer ratio, number of cocoons per liter, weight of cocoon per liter, female of cocoon length, male co cocoon length, female of cocoon width and male of cocoon width were found to inherit incomplete dominance. The component of genetic variance analysis for fifth instar period, cocoon weight, cocoon layer weight, cocoon layer ratio, number of cocoons per liter, weight of cocoon per liter, cocoon length and cocoon width showed that additive effects were higher than dominant effects. Heritability of narrow sense was higher more than 0.67 in all characters. The directions of dominance of dominance were negative for total instar period, female of cocoon layer ratio and number of cocoons per liter.

대장균 sfs 유전자의 전사조절

이희영,유주순,정수열,이승진,최용락 東亞大學校附設遺傳工學硏究所 1996 遺傳工學硏究 Vol.- No.3

sfs(sugar fermentation stimulation) 유전자는 crp*¹이 도입된 MK2001 균주에서 mal 유전자의 발현을 촉진시키는 특성으로서 클로닝 되어졌다. sfs4 유전자의 발현은 두 개의 promoter에 의하여 조절되어진다. 본 연구는 이들 두 promoter (P₁과 P₂)의 cAMP-CRP에 의한 발현조절을 보고자 조절영역과 CRP 결합영역에 변이가 도입된 DNA가 in vitro transcription 방법에 의해 확인되어졌다. 두 개의 promoter가 공존시에는 cAMP에 의한 P₂의 전사는 촉진되어졌으며, P₁의 전사는 억제되어졌다. P₂만이 존재할 때에도 전사는 cAMP에 의하여 촉진되어졌다. CRP 결합부위에서의 변이는 cAMP에 의한 전사촉진이 크게 감소하였다. sfs7 (nlp) 유전자의 전사산물을 확인하였으며, 이는 cAMP에 의한 발현조절을 받지 않았다. sfs(sugar fermentation stimulation) genes are involved in regulation of mal gene expression with the altered crp*¹ gene. Expression of the sfs4 gene appeared to be regulated by a two promoters. In this research, the cAMP-CRP dependent regulation of P₁ and P₂ promoter of sfs4 was examined by in vitro transcription using the regulatory region and mutated DNA of the CRP binding region. The transcription of sfs4 from P₂ is stimulated, but P₁ was totally repressed by in vitro transcription. In mutant in the CRP binding region, the effect of activation by cAMP was severely reduced. The transcript of sfs7(nlp) was identified and regulation by cAMP was not observed at the mRNA level.

대장균의 전사조절 유전자 nlp의 분자기구 해석

최용락,정수열,정영기,정정한 東亞大學校附設遺傳工學硏究所 1994 遺傳工學硏究 Vol.- No.1

대장균의 nlp(Ner like protein) 유전자를 클로닝하여 구조해석을 한 결과 전사조절 단백질인 Ner와는 61%의 높은 상동성을 가지고 있음을 이미 보고한 바 있다. 본 연구는 당 대사 관련 유전자의 발현 조절을 보고자 nlp 유전자를 도입시켜 tac promoter에 의해 대량 발현시킴으로서 lactose대사 관련 유전자 lacZ와 maltose 대사 관련 유전자인 malQ, malP의 유전자 발현이 2.5배에서 최고 8.3배 정도까지 증가됨을 확인하였다. 이는 nlp유전자가 cAMP비존재하에 crp*1와 상호작용하여 maltose및 lactose대사를 촉진시킴을 시사한다. nlp-lacZ 융합 유전자 산물을 Immunoblotting하여 분석한 결과 nlp의 promoter가 in vivo 상태에서 발현되어짐을 확인하였다. tac promoter와 IPTG에 의하여 nlp유전자 산물을 대량 발현시킨 결과 약 10,000Da의 산물을 SDS-poly-acrylamide gel 전기영동으로서 확인하였으며, 부분 정제된 Nlp단백질을 조절 영역의 DNA단편에 결합함으로서 전사조절에 관여하는 것으로 사료되어졌다. An nlp (Ner like protein) gene from E. coli was previously cloned and sequenced. Here we show that expression of the sugar metabolism related genes, lacZ, malQ and malP, increased 2.5- to 8.3-fold in the presence of a plasmid containing the nlp gene. This suggested that the nlp gene could induce maltose-and lactose-metabolism coordinately with crp*1 in the absence of CAMP. Using the nlp-lacZ fusion gene, it was possible to show the promoter of nlp was active in vivo. The overexpressed nlp gene product, a polypeptide of 10,000 daltons, was confirmed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The band shift assay revealed that the partially purified NIp protein bound a specific DNA of the regulatory region of the nlp gene.

sfs1 유전자의 cAMP-cAMP receptor protein에 의한 발현 조절

이희영,이승진,유주순,최용락,정수열 東亞大學校附設遺傳工學硏究所 1997 遺傳工學硏究 Vol.- No.4

crp* 유전자가 도입된 대장균 MK2001(crp, cya::km)을 숙주로 사용하여 mal 유전자 발현을 촉진시키는 유전자의 하나인 sfs1(sugar fermentation stimulation)의 구조해석 결과에 의하면, 잠정적인 sfs1의 promoter영역에는 CRP단백질과의 결합영역으로 보이는 염기배열이 존재하였다. 본 실험에서는 sfs1 유전자의 cAMP-CRP에 의한 발현 조절을 확인하고자, lacZ와의 융합 유전자를 작성하였다. 작성된 융합 유전자는 cya결손주인 TP2010에서 cAMP의 첨가에 의해 B-galactosidase 활성이 크게 증가하였으며, Western blotting의 실험에서도 같은 결과를 나타냈다. in vivo에서 발현이 확인된 전사산물은 cAMP에 의해 전사 촉진이 일어났으며, CRP의 결합부위로 예상되는 DNA영역은 cAMP가 존재하면 CRP단백질과 결합하는 특성을 나타내었다. 이상의 결과로 보아, sfs1 유전자의 발현은 cAMP-CRP에 의한 전사촉진 현상을 받는 것으로 나타났다. We have cloned several E. coli sfs genes which stimulate mal gene expression with ??. One the sfs genes(pPVC2) was sequenced and potential CRP binding site is located in the upstream of the putative promoter in the regulatry region. In order to investigate the regulation of the sfs1 gene by the cAMP-CRP complex, we have constructed the sfs-lacZ fusion gene in this research. The overall transcriptional stimulations of sfs1 gene in the presence cAMP were confirmed by B-galactosidase activity and Western blot analysis of sfs1-lacZ fusion gene. Transcriptional regulation by cAMP-CRP was also confirmed by Northern blot analysis. End-labelled DNA of the DNA fragement in sfs1 regulatory region were used for gel retardation assay to examine the CRP-DNA complex in the presence of cAMP. Results here indicate that CRP binding site in the regulatory region of sfs1 gene is positive regulator for the expression of sfs1 gene.

건조 혈액 여과지에서의 β-Globin DNA와 RNA의 추출 및 그 안전성에 관한 검토

김덕인,김인후,김정만,한진영,오성용,최용천 東亞大學校附設遺傳工學硏究所 1996 遺傳工學硏究 Vol.- No.3

연구배경: Guthrie spot는 1963년부터 신생아 유전 질환의 선별검사에 사용되기 시작한 이후로 최근에는 DNA와 RNA를 이용한 분석에도 응용이 시도되고 있다. 저자들은 일반 여과지에 채취된 건조 혈액으로부터 β-globin 유전자의 DNA와 RNA를 추출하는 데에 있어서 여과지의 전처리 조건이 미치는 영향과 특히 장기 보관에 따른 RNA의 안정성을 살펴보고자 하였다. 방법: 전처리를 하지 않은 경우, 5% HCI로 전처리를 한 경우, 고압 멸균을 한 경우, 그리고 5% HCI 전처리 후 고압 멸균을 한 경우의 네가지로 나누어서 정상인의 혈액을 떨어뜨린 후 상온에서 2주 동안 보관하였다가 각각 DNA와 RNA를 추출하여 PCR과 RT-PCR을 실시하였다. 그리고 2년간 보관하였던 전처리를 하지 않은 건조 혈액 여과지에서 RNA를 추출하여 RT-PCR을 시행하고 염기서열 분석을 하여 β-globin 유전자인지를 확인하였다. 결과: 여과지의 전처리 여부에 관계없이 DNA와 RNA는 PCR에 의해 기대된 크기의 증폭 산물을 나타내었고, 2년간 장기 보관하였던 여과지에서도 RNA가 안정하게 보존되어 있어서 RT-PCR 생성물을 염기서열 분석한 결과, β-globin 유전자의 일부임을 확인할 수 있었다. 결론: 건조 혈액 여과지를 이용한 β-globin 유전자의 DNA와 RNA 분석은 검체의 채취와 보관이 용이하고 안정성이 높아서 혈색소 이상증을 포함한 유전 질환의 대규모 연구나 선별 검사에 매우 유용할 것으로 사료된다. Background: Since newborn screening efforts were facilitated by the use of Guthrie spots in 1963, the development of a routine procedure for microextraction of DNA and recently even RNA from these specimens would allow direct screening at the molecular level. The purpose of the current investigation was to optimize pretreatment condition of filter paper for improvement of microextraction and stability of β-globin DNA and RNA from dried blood specimens on Whatman filter papers. Methods: Normal whole blood was spotted on filter papers pretreated by four different ways, respectively ; untreated, 5% HCI treated, autoclaved, and 5% HCI treated and autoclaved. The samples were then stored at room temperature for two weeks until processed. DNA and RNA were extracted from each filter paper and amplified by PCR(polymerase chain reaction) and RT(reverse transcriptase)-PCR. We also extracted RNA from untreated dried blood spot stored at room temperature for two years for cDNA synthesis and did nucleotide sequencing to identify that the PCR products were part of β-globin gene. Results: DNA and RNA were stable in filter papers, and could be microextracted for PCR and RT-PCR regardless of pretreatment conditions. It also has been demonstrated that RNA could be obtained from dried blood spots stored for two years in sufficient quality and quantity for amplification and sequencing. Conclusion: The prolonged stability of β-globin DNA and RNA in these specimens will be very helpful for conducting a mass screening and research in genetic diseases including hemoglobinopathies principally because of the ease of sample collection, storage, handling, and shipment.

glpD and glpE 유전자의 조절영역 결손변이주기가 전사조절에 미치는 영향

정희태,정수열,최용락 東亞大學校附設遺傳工學硏究所 1996 遺傳工學硏究 Vol.- No.3

glpD와 glpE는 같은 조절 영역 하에서 121 bp 간격을 두고 역방향으로 전사되어지며, 이들 유전자 상류영역에 존재하는 하나의 CRP binding site가 두 유전자의 전사 조절에 관여함을 이미 여러 연구를 통하여 확인되어졌다. 본 연구에서는 glpD와 glpE의 조절영역이 다양한 크기로 결손된 변이주를 작성하였다. 각 변이된 promoter의 발현조절 영향을 보고자 LacZ와의 융합 plasmid를 작성하였고, β-galactosidase 활성을 측정하여 cAMP에 의한 발현조절을 검토하였다. 발현조절 특성을 확인한 결과 CRP binding site 전까지 결손이 된 변이주는 wild와 비슷한 활성이지만 CRP bin-ding site가 없어진 변이주의 경우는 promoter 활성이 크게 감소했고 cAMP에 의한 발현조절은 나타내지 않았다. 한편 CRP의 공통배열을 삽입시키면 회복이 가능하였다. glpE의 조절영역도 glpD와 마찬가지로 다양하게 결손시킨 변이주를 작성하여 promoter 조절활성을 확인한 결과 CRP binding site가 없어진 변이주의 경우는 promoter 활성이 크게 감소하였으며, 결손된 CRP 결합영역을 삽입시키니 cAMP에 의한 전사촉진이 거의 회복되어졌다. The glpD gene encoding gly-3-p dehydrogenase is essential for the aerobic growth of E. coli on glycerol or gly-3-p. The glpE gene, the function of which is unknown, is transcribed divergently with respect to glpD gene. Expression of the adjacent but divergently transcribed glpD and glpE genes is positively regulated by the cAMP-CRP complex. In this study, for a precise investigation of the functional elements in the regulatory region for transcription activation by cAMP-CRP, deletion mutation have been introducted into the regulatory region. The effect of the deletion mutant on transcriptional regulation was tested in vivo by β-galctosidase activity. Deletion mutants in the regulatory region of glpD demonstrated that the presence of the CRP-binding site resulted in an sixfold increase in promoter activity. And also deletion mutants of glpE gene demonstrated that the presence of the CRP-binding site resulted in an eightfold increase in promoter activity. Insertion of 22 bp oligomer in the deletion mutants has shown that the CRP binding site is need for maximal expression of glpD and glpE genes.

CRP* 의존성 maltose 대사 촉진 유전자 sfs4의 클로닝 및 염기배열 결정

최용락,정희태,조무제,정수열 東亞大學校附設遺傳工學硏究所 1996 遺傳工學硏究 Vol.- No.3

CRP (cAMP receptor protein)은 cAMP와 결합하여 cAMP-CRP 복합체를 형성하여 전사조절의 조절인자로서 작용한다. crp 유전자에 변이를 도입하여 cAMP의 비존재 상태에서 cAMP-CRP와 비슷한 기능을 가진 crp* 유전자가 도입된 대장균 MK2001 (crp*¹, cya::km)을 숙주로 사용하여 cAMP 혹은 cGMP의 비존재하에서도 mal 유전자의 발현을 촉진시키는 유전자 sfs (sugar fermentation stimulation) 수 종을 클로닝하였다. 본 실험에서는 이미 밝혀진 nlp (Ner like protein) 유전자와 같이, sfs의 새로운 유전자를 탐색하여, 그 중 sfs4의 2126bp 전 염기배열을 결정하고, 잠정적인 sfs4의 promoter 영역에는 CRP 단백질과의 결합 DNA 공통 염기배열(5' AAT TGTGA ACACCA TCACC CGT 3')이 존재함을 확인했다. lacZ 융합 유전자를 작성하여 TP2010R1과 MK2001의 균주에서 cAMP를 첨가할 경우 각각 2.3배, 1.8배의 β-galactosidase 활성이 증가 하는 것으로 보아 sfs4는 cAMP-CRP에 의해 발현 조절을 받는 것으로 나타났다 In Escherichia coli, CRP forms a complex with cAMP and acts as a transcriptional regulator of many genes, including sugar metabolism operons. The E. coli MK2001, which is introduced the altered crp*¹, is functional in the expression of lac, ara and man, in the absence of cAMP. However, the expression of mal gene is fully activated by the addition of cAMP or cGMP. The object of the study is cloning of the sfs (sugar fermentation stimulation) genes, which was involved in regulation of mal gene expression with the altered crp*¹gene, and structural analysis and characterization of the genes at the molecular level. We have cloned 5 different E. coli genes which stimulate the maltose metabolism in a crp*¹, cya::km (MK2001) background. Newly identified genes were designated as sfs. One of the sfs genes (pPC1), located at the 53.2 min map position in the E. coli chromosome, was further analyzed. Expression of the genes, which is involved in maltose metabolism, malQ (amylomaltase), was increased to 5.8-fold in the presence of a plasmid, pAP5, containing the subcloned sfs4 gene. The nucleotide sequence of a common 2,126bp segment of the pPCM1 was determined and two open reading frames (ORF1 and ORF2) were detected. The ORF1 encodes the sfs4 gene and ORF2 encodes a truncated protein. Potential CRP binding site is located in the upstream of the putative promoter in the regulatory region. Expression of the cloned sfs4 gene was positively regulated by the cAMP-CRP complex.