Zinc 대사와 관련된 Paneth 세포활성의 변화에 관한 조직화학적 연구

조승묵,김성준,박승국,강태천,원무호,Jo, Seung-Mook,Kim, Sung-Jun,Park, Seung-Kook,Kang, Tae-Cheon,Won, Moo-Ho 한국현미경학회 2000 Applied microscopy Vol.30 No.4

포유류 장생 상피세포의 하나인 파네스세포(Paneth cell)는 여러 가지 금속류를 함유하고 있으며, 생체가 과잉의 이들 금속류에 노출되거나 부족할 때에 장 내강을 통해 제거하거나 흡수함으로써 금속류의 항상성에 기여한다고 알려져 있다. 이번 연구는 이러한 연구보고에 근거하여 금속류중에서 zinc를 실험적으로 과량투여한 후 파네스세포내 zinc의 분포에 어떤 변화가 초래되는 지를 광학 및 전자현미경적 autometallography(AMG)로 관찰함으로써 파네스세포의 zinc와 관련된 세포생물학적 기능을 규명하고자 하였다. Wistar 랫드에 체중 당 20mg의 zinc chloride를 생리식염수 5ml에 녹여 복강주사한 후 2시간에 이르러 0.1 M phosphate buffer(PB)에 녹인 0.5% sodium sulphide-3% glutaraldehyde 흔합액으로 관류고정하였다. 회장(ileum)의 일부를 Dry Ice나 $CO_2$ gas로 얼린 후 cryostat을 이용하여 $20{\mu}m$ 두께의 조직절편을 만들어 및 단계의 AMG법을 시행하였다. 이와는 별도로 EM용으로 선택된 회장절편은 일련의 전자현미경 표본제작과정을 거쳐, 100nm두께의 thin section을 만들어 uranyl-lead 이중염 색 추 전자현미경으로 관찰하였다. Zinc를 투여한 동물에서 관찰된 소견은 생리식염수만을 투여한 대조군의 것과 비교할 때 큰 차이를 보였다. 우선 대조군에서는 파네스세포의 꼭대기(apex)부위에서 낱알모양을 띤 AMG양성반응 구조물(AMG grain)들이 분비과립과 사이토졸(cytosol)에서 관찰되었고, 세포사이공간에서도 적은 양의 grain이 분포하고 있었다. 반면 zinc를 투여한 랫드의 파네스세포에서는 AMG 입자가 이상의 부위에서 훨씬 많은 양의 grain이 분포해 있었으며, 특히 분비과립에서는 가장 높은 농도로 관찰되었다. 더욱이 대조군에서 관찰되지 많았던 장샘의 분비관(Lieberkuhn crypt)및 고유판 혈관의 내에서도 많은 grain이 관찰되었다. 이상의 결과를 요약하면 과량의 zinc에 노출된 생체는 혈관을 경유하여, 파네스세포의 분비과립을 매개로 하여, 장관의 내강쪽으로 과잉의 zinc 를 피내고 있는 모습을 보인다. 따라서 연구자는 파네스세포가 생체내 zinc의 양을 조절하는데 중요한 역할이 있을 것으로 본다. Paneth cells have been suggested to contribute to the elimination of excess metals into the intestinal lumen. The purpose of this study wat to investigate the changes of the zinc pools in rats subjected to functional loading with zinc salt by mean of both light and electron microscopical autometallography (AMG). Wistar rats 4 were administrated with zinc chloride (20 mg/kg body weight) intraperitoneally dissolved in 1 ml distilled water. The control group received 1 ml saline IP. After further one hour the animals were transcardially perfused with 0.4% sodium sulphide dissolved in 0.1 M PB fellowed by 3% glutaraldehyde solution for 10 minutes. Pieces of ileum were frozen with solid $CO_2$ and sectioned on a cryostat. The sections $(20{\mu}m)$ were autometallographically developed. Sections selected for EM were reembedded on top of a blank Epon block, from which ultrathin sections (100 nm) were cut. The ultrathin sections were double stained with uranyl acetate (30 min) and lead citrate (5 min), then examined under electron microscope. Studies of comparable sections from control and zinc loaded animals with the AMG selenium method gave quite different results. The control animals demonstrated a weakly positive staining in the cytoplasm of the Paneth cells. In the electron microscope the AMG silver grains were found to be located in the cytoplasm, while the electron dense secretary granules and other cell organelles were void of staining. Few AMG grains were located at the apical surface of the Paneth cells. In sections from zinc loaded rats, the AMG grains were seen in abundance in the lumen of the Lieberkuhn crypts at light microscopic levels. At EM levels the zinc revealing silver grains were located in the cytoplasm as in the controls, but much more AMG grains were shifted into the secretary granules. Furthermore, profound AMG grains were found in the lumen of the crypts and surrounding vessels. And a few grains were seen in the endothelium. The AMG technique demonstrated a pattern of AMG grains in the Paneth cells that strongly suggests a transport of zinc ions through these cells.

Autometallography for Zinc Detection in the Central Nervous System

조승묵,김성준,박승국,강태천,원무호,Jo, Seung-Mook,Gorm, Danscher,Kim, Sung-Jun,Park, Seung-Kook,Kang, Tae-Cheon,Won, Moo-Ho Korean Society of Electron Microscopy 2000 Applied microscopy Vol.30 No.4

Zinc는 인체 내에 철$(Fe^{2+})$다음으로 많은 trace element로서 200여개 효소의 기능에 필수적일 뿐만 아니라 신경계통내에서는 신경조절물질로 작용한다. 뿐만 아니라 허혈, 간질 및 퇴행성 뇌질환의 주요 병리기전에도 관여되어 있다. 그러나 대부분의 Zinc는 단백질에 결합되어 (bound form)신경세포의 세포질 및 핵질내에 존재하고, 10% 이하의 Zinc는 이온상태(free form, $Zn^{2+}$)로 신경종말 (Zinc enriched terminal)에 있는데 , 후자만이 조직화학법으로 가시화된다. 최근까지 새로 개발된 조직화학법으로 Zinc enriched(ZEN)neurons의 분포에 관한 연구가 각광받고 있으나, 국내에서는 이에 대한 연구가 전무한 실정이다. 이에 본 연구자는 고전적인 조직화학법의 기본 원리를 소개하고, 렛드 중추신경계통내 Zinc의 분포를 광학 및 전자현미경으로 관찰하고자 하였다. 본 연구에서 사용된 실험동물은 Wistar 계통의 랫드(10주령)와 BALB/c 마우스이며, 마취제로는 Pentobarbital(50mg/kg)을 이용하였다. 생체 뇌조직내 이온상태의 $Zinc(Zn^{2+})$를 침전시키기 위하여 selenium(10mg/kg, i.p.)을 처리하였고, 1시간 후 3% Glutaraldehyde액으로 관류고정하여 동물을 희생시켰다. 뇌와 척수를 꺼내어 sucrose에 가라앉을때 까지 담가두었다가 Dry Ice를 이용하여 얼리고, Freezing microtome위에서 $30{\mu}m$두께의 절편을 작성하였다. 조직절편내 $Zn^{2+}$을 동정하기 위한 조직화학법으로는 autometallography (AMG) (Danscher, 1985)를 이용하였다. 광학현미경하에서 밝혀진 Zinc의 분포는 해마복합체를 비롯한 종뇌의 여러부위에 고농도로 분포하였고, 척수에는 중간정도, 그리고 소뇌 및 뇌간에는 매우 낮은 농도로 분포하였다. 전자현미경에서 관찰된 AMG염색과립(silver grains)은 신경종말에 있는 연접소포에 국한되었으며, 이러한 ZEN terminals은 주위 여러 신경세포의 돌기(dendrites)및 세포체 (soma)에 특이한 연접을 이루고 있었다. 즉 후각망울을 포함한 종뇌에서는 주로 비대칭연접 (asymmetrical synapses)이 관찰되었던 반면에, 척수에서는 대칭연접(symmetrical synapses)을 이루고 있었다. 이상의 결과를 종합하면, 신경종말내 연접소포에 Zinc를 함유하고 있는 소위 ZEN terminals은 중추신경계통에 광범위하게 분포하고 있으며 또한 신경부위에 따라 다양한 분포와 미세구조의 차이를 보였다. 이러한 사실은 중추신경계통내에서 Zinc가 영위하는 신경생물학적 기능이 신경부위에 따라 다양할 것임을 시사한다. Zinc is one of the most abundant oligoelements in the living cell. It appears tightly bound to some metalloproteins and nucleic acids, loosely bound to some metallothioneins or even as free ion. Small amounts of zinc ions (in the nanomolar range) regulate a plentitude of enzymatic proteins, receptors and transcription factors, thus rolls need accurate homeostasis of zinc ions. Zinc is an essential catalytic or structural element of many proteins, and a signaling messenger that is released by neural activity at many central excitatory synapses. Growing evidences suggest that zinc may also be a key mediator and modulator of the neuronal death associated with transient global ischemia and sustained seizures, as well as perhaps other neurological disease stoles. Some neurons have developed mechanisms to accumulate zinc in specific membrane compartment ('vesicular zinc') which can be evidenced using histochemical techniques. Substances giving a bright colour or emitting fluorescence when in contact with divalent metal ions are currently used to detect them inside cells; their use leads to the so called 'direct' methods. The fixation and precipitation of metal ions as insoluble salt precipitates, their maintenance along the histological process and, finally, their demonstration after autometallographic development are essential steps for other methods, the so called 'indirect methods'. This study is a short report on the autometallograhical approaches for zinc detection in the central nervous system (CNS) by means of a modified selenium method.

Histochemically-reactive Zinc in the Rat Dorsal Root Ganglion (DRG) Neurons: Zinc Selenium Autometallography

김이석,조승묵,Kim, Yi-Suk,Jo, Seung-Mook Korean Society of Electron Microscopy 2010 Applied microscopy Vol.40 No.1

이번 연구에서는 성체 랫드(Sprague-Dawley)의 척수신경절내 분포하는 zinc의 분포 관찰하기 위하여 zinc selenium autometallograpy(AMG)로 염색하였다. H-E염색표본에서 척수신경절 속에는 신경절세포들이 무리지어 분포하고 있었고, 세포체는 둥글거나 타원형이었으며, 작은 신경절세포, 큰 신경절세포로 대별되었다. 모든 신경절세포의 세포체는 한 층의 납작한 위성세포(satellite cell)에 의하여 둘러싸여 있었다. AMG 염색표본에서는 작은 신경절세포의 경우 강한 양성반응이 핵 주변부에서 관찰되었으나, 큰 신경절세포의 경우 전반적으로 미약한 AMG 양성반응을 보였고, 염색양상도 서로 달랐다. 그러나 큰 신경절세포를 둘러싸는 위성세포에서는 뚜렷한 AMG 양성반응이 관찰되었다. 이러한 조직화학적 본 연구의 결과는 zinc가 감각신경절인 랫드 척수신경절에서 통증을 포함한 감각의 전달과정에 의미있는 기능을 영위할 수 있음을 시사한다. The present study was designed to demonstrate ionic zinc in the rat DRG by means of zinc selenium autometallography($ZnSe^{AMG}$). Ganglion cells varied in size from 15 to 100 ${\mu}m$. The smaller neurons were strongly stained with AMG, whereas the larger cells were weakly stained. Each large ganglion cell was surrounded by perineuronal satellite cells, showing apparent AMG staining. We demonstrated for the first time the existence of zinc-containing satellite cells in the rodent DRG. Using electron microscopy, fine AMG grains were observed scattered in the somata of the DRG neurons, especially small cells. However, much lower concentrations of the AMG grains occupied in the large cells, and these were mostly localized in lysosome-like organelles. These results indicate that zinc may be involved in sensory transmission in the DRG level.

랫드 척수신경 결찰에 따른 척수신경절세포의 퇴행성변화

김이석,조승묵,Kim, Yi-Suk,Jo, Seung-Mook 한국현미경학회 2009 Applied microscopy Vol.39 No.3

본 연구는 잘 알려진 통증모델을 대상으로 척수신경절세포의 변성과정을 경시적으로 관찰하고자 하였다. 10주령된 Sprague-Dawley 계통의 랫드를 실험동물로 사용하였고, pentobarbital (50mg/kg)로 마취상태에서 다섯째 허리신경(L5)의 앞가지를 결찰한 후 1일, 3일, 7일 실험군으로 구분하였다. 실험 1일과 3일군에서 작은 신경절세포에서 퇴행성변화가 먼저 관찰되었고, 중간 및 큰 신경절세포에서는 그 변화가 미약했다. 7일 실험군에서는 작은 신경절세포의 수가 크게 감소하였던 반면, 중간 및 큰 신경절세포에서는 큰 변화가 없었다. 전자현미경 소견으로는 작은 신경절세포의 경우 초기 1일 및 3일군에서 미토콘드리아의 능선의 변형과 부종이 관찰되었으며, 세포질은 검게 변성되었다. 반면 큰 신경절세포의 경우 모든 실험군에서 변형된 세포가 관찰되지 않았으며, 소기관들도 잘 보존되었다. 이상의 결과를 요약하면, 척수신경 결찰에 의한 통증자극으로 랫드 척수신경절 내 작은 신경절세포는 다른 신경절세포에 비해 퇴행성변화가 빠르게 나타났으며, 미토콘드리아 등 세포질소기관의 부종을 동반한 암적화변성(dark degeneration)을 통해 사멸되었다. This study aim to disclose a possible mechanism for the neuronal cell death induced by peripheral nerve injury following a spinal nerve ligation (SNL) as a neuropathic pain model. Male Sprague-Dawley rats (270~290 g) were used for this study. Pain threshold was evaluated for their response to mechanical (von Frey hairs) stimuli 1, 3, and 7 days after a tight ligation of L5 ventral ramus. In control group, the small ganglion cells were strongly stained with routine toluidine blue (TB), whereas the large ganglion cells showed a little bit weak stainity. Each large ganglion cell is surrounded by perineuronal satellite cells. In experimental groups, small ganglion cells showing apparent degenerative changes increased on 1 day, and showed a peak in degenerative cell number at 3 days group, and decreased gradually at 7 days group. We also found a small number of large-sized ganglion cells showing mild degenerative changes. However their satellite cells ware relatively intact with no typical findings throughout this experiment. Under the electron microscope, small ganglion cells showed various stage and typical features of the dark degeneration including mitochondrial swelling.

The Oxytocinergic Neurons in Hypothamo-hypophysial Tract Contributes to CNS Pathway Innervating Ovary in Rat

변경희,오지현,조승묵,이봉희,Byun, Kyung-Hee,Oh, Jee-Hyun,Jo, Seung-Mook,Lee, Bong-Hee Korean Society of Electron Microscopy 2010 Applied microscopy Vol.40 No.4

포유동물의 난소는 호르몬과 감각신경 및 교감신경의 지배를 받아 난소 내 혈류의 조절, 스테로이드 호르몬 생성 및 난포의 발달과 관계된 난소의 고유기능이 조절되고 있다. 본 실험에서는 통상적인 추적자인 CT-HRP와 Pseudorabies바이러스(PRV)의 Bartha strain을 신경추적자로 이용하여 뇌하수체 후엽 및 난소와 연결된 중추신경부위를 밝히고자 하였다. 또 oxytocin을 난소 지배 신경축속에서 동정함으로써 신경축내 oxytocinergic neuron들의 존재를 확인하고, 이들이 배란을 중심으로 한 난소생식주기에 따라 보이는 중추 내 oxytocin신경세포의 변화를 조사하고자 하였다. Sprague-Dawley 흰쥐를 대상으로 난소 내에 PRV를 주사하고 48시간 후 실험동물들은 4% paraformaldehyde-lysine periodae로 고정하였으며, 뇌를 적출하여 $30{\mu}m$ 두께의 관상연속 절편을 만들어 CTHRP, PRV 및 oxytocin에 대한 삼중염색을 시행하였다. 본 실험 결과 후뇌에서부터 전뇌에 이르기까지 PRV에 양성반응을 보인 신경핵들이 관찰되어 난소를 지배하는 신경축을 구성할 수 있었다. 또 시상하부의 뇌실옆핵에서 oxytocin, PRV와 CT-HRP에 삼중으로 염색된 세포가 관찰됨으로써 신경내분비축과 자율신경축이 공동으로 기원하고 있다는 것을 형태학적으로 보여주었다. 따라서 oxytocin은 이 두 계통 내에서 호르몬의 역할과 신경전달물질의 역할을 겸할 것이라는 것을 추측할 수 있었다. The mammalian ovary is innervated by sympathetic and sensory neurons which contribute to regulating several aspects of ovarian function, including blood flow, steroidogenesis and follicular development. The existence of a neural connection between central neurons and the ovary has been rarely reported, but the mechanism underlying integration of ovarian activity to broader neuroendocrine responses has not been reported. We have now used a viral transneuronal tracing technique combined with a conventional retrograde labeling procedure of CT-HRP to demonstrate that oxytocin-producing neurons of the hypothalamus are synaptically connected to the ovary. Since ovarian activity is suppressed but the activity of oxytocin neurons is increased during breast feeding. Our finding that the oxytocinergic neural connection is likely to provide a direct transsynaptic mechanism by which the central nervous system maintains the state of infertility that accompanies lactation in mammals.

5,7-Dihydroxytryptamine의 세포독성에 의한 고양이 망막내 미세아교세포의 반응양상

주우현,남성안,조승묵,조현후,신민철,원무호,최창도,Joo, Woo-Hyun,Nam, Seong-Ahn,Jo, Seung-Mook,Cho, Hyon-Hoo,Shin, Min-Cheol,Won, Moo-Ho,Choi, Chang-Do 한국현미경학회 1998 Applied microscopy Vol.28 No.4

This study was designed to investigate the microglial reactions to the neurodegenerative changes in the cat retina. All experiments were performed using adult cats of both sex, weighing $2,500g\sim3,500g$. 5,7-DHT $(100{\mu}g)$ dissolved in 0.1% ascorbic acid was injected into the vitreous body. All injections were performed in one-side eye; the other side served as the control, which was injected only with 0.1% ascorbic acid. Cats were sacrificed at 1, 3, 7, 14 and 21 days after intravitreal injection of 5,7-DHT For light microscopy, retinae were fixed with 4% paraformaldehyde and processed using NDPase histochemistry. Same retinae were fixed with 1% para(formaldehyde-2.5% glutaraldehyde and processed for electron microscopy. NDPase-positive microglial cells were mainly distributed in the inner plexiform layer of the retina, and characterized by a small somata with a few slender processes, which were also extended in the ganglion cell layer (GCL) and inner nuclear layer (INL). The intensity of the microglia stained for NDPase was abruptly increased at 7 day as compared with that of the control, and thereafter continuously sustained until 21 day, the last experimental group in this study. Under the electron microscopical observation, microglial cells in the control group exhibited elongate nucleus with perinuclear chromatin condensation, and the perikaryon was scanty. However, a few hypertrophic glial cells were frequently found at 3 days after the drug injection. By 7 day, most microglial cells directed toward the degenerated neurons in the GCL, and the number of microglial cells was slightly increased as compared with the former group. At the 14 day, most microglial cells wrapped the degenerated cells in the GCL, and a few cells showed phagocytotic features. By 21 day, most microglial cells were engaged in phagocytotic activity, and their cytoplasm was filled with the phagorytosed material. Based on the results, 5,7-DHT may act as a specific neurotoxin to the cat retina, and microglial reactions to the neuronal death are already induced in early experimental stage. These results indicate that the microglial cells in the cat retina show characteristic features as a protective effect of neural tissue.

모래쥐 흑색질의 도파민성 신경세포의 분포와 미세구조

최월봉,윤상선,고병문,조승묵,남성안,최창도,Choi, Wol-Bong,Yoon, Sang-Seon,Ko, Byoung-Moon,Jo, Seung-Mook,Nam, Seong-Ahn,Choi, Chang-Do 한국현미경학회 1997 Applied microscopy Vol.27 No.4

The substantia nigra of the Mongolian gerbil was studies by tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and immunoelectron microscopy with preembedding method. The purpose was to obtain information on the distribution and ultrastructure of the Tyrosine hydroxylase immunoreactive and dopaminergic neurons in the substantia nigra, in order to provide the necessary background for the gerbil. Large number of tyrosine hydroxylase immunoreactive neurons were located in the compact part of substantia nigra. Findings in the gerbil, compared to observations in the other species, included the presence of prominent bundles of tyrosine hydroxylase immunoreactive cytoplasmic processes passing in the dorsoventral direction from pars compacta into pars reticulata at middle and caudal levels of the substantia nigra, and the presence of a distinct tyrosine hydroxylase immunoreactive substantia nigra pars lateralis. Tyrosine hydroxylase immunoreactive neurons had well-developed cell organelles, especially rough endoplasmic reticulum, free ribosome and poly-ribosome, and showed the infoldings of the nuclear envelope. We anticipate that the present description of the cellular organization of the tyrosine hydroxylase immunoreactive dopaminergic area in the substantia nigra of gerbil will be useful for the animal experimental model of Parkinson's disease.

5, 7-DHT가 흰쥐 등쪽솔기핵내 신경아교세포에 미치는 영향

채제명(Je Myung Chae),조승묵(Seung Mook Jo),남성안(Seong Ahn Nam),윤상선(Sang Seon Yoon),고병문(Byung Moon Ko),최창도(Chang Do Choi),최월봉(Wol Bong Choi) 대한해부학회 1998 Anatomy & Cell Biology Vol.31 No.1

신경독성물질인 5, 7-dihydroxytryptamine (5, 7-DHT)이 중추신경계통내 serotonin 신경세포에 미치는 영향과 이에 따른 신경아교세포들의 반응을 형태학적으로 규명하고자 본 연구를 시행하였다. 흰쥐의 가쪽뇌실에 5, 7-DHT(200μg)를 투여한 후면역세포화학적 염색을 시행한 후 광학 및 전자현미경하에서 등쪽솔기핵내 serotonin 신경세포에 초래되는 퇴행성변화와 주위 신경아교세포들의 반응양상 등을 경시적으로 (1, 3, 5, 10 및 20일) 관찰하였던 바 아래와 같은 결과를 얻었다. 흰쥐 등쪽솔기핵내 5, 7-DHT의 세포독성에 반응을 보인 신경아교세포로는 미세아교세포와 별아교세포였으며, 이들 세포 들의 반응양상은 매우 특징적이었으며, 상당한 차이를 보였으며, 전반적으로 미세아교세포가 별아교세포에 비해 빠른 변화소견을 보였다. 즉, 미세아교세포의 경우 실험 3일군 및 5일군에서 이미 그 수의 증가와 함께 활발한 포식작용을 보였던 반면, 별아교세포는 후기 실험군인 10일군 및 20일군에 이르러서야 세포질의 비대 및 수적 증식을 통하여 손상된 신경조직을 보상할 뿐 아니라 밀집된 미세아교세포들을 분산시키는 소견이 관찰되었다. 그러나 희소돌기아교세포는 본 연구의 전 실험군을 통하여 특별한 변화소견이 관찰되지 않았다. 이상의 결과로 부터 5, 7-DHT가 흰쥐 등쪽솔기핵내 신경세포에 강한 세포독성을 유발하며, 이에 따른 주위 신경아교세 포들 특히 미세아교세포와 별아교세포는 시간경과에 따라 매우 다양한 반응양상을 보인다는 사실을 알게 되었다 This study was designed to clarify the cytotoxic effects of 5, 7-dihydroxytryptamine (5, 7-DHT) on the serotonergic neurons in the dorsal raphe nucleus, and to investigate the glial reaction during the neurodegenerative changes by light and electron microscopy. Adult male rats (Sprague-Dawley strain) weighing from 250 g to 350 g each were used as experimental animal. 5, 7-DHT(200 μg dissolved in 0.9% NaCl) was injected into the lateral ventricle of the rat brain with the Hamiton syringe fixed on stereotaxic apparatus. The control rats were given with the similar volume of 0.9% NaCl. The rats were sacrified on the 1st, 3rd, 5th, 10th and 20th day after the injection of 5, 7-DHT. The results were as follows : Glial reactions induced by 5, 7-DHT were also observed in DRN. In early experimental stage, microglial reactions prevailed, whereas astroglial reactions were prevailing in later stage. In addition, microglial cells phagocytosed and removed the degenerated cells. However, astrocytes in DRN did not show phagocytotic activities such as microglial cells. Based on the results, author thought that 5, 7-DHT act as a specific neurotoxin to serotonergic neurons in DRN, and induces severe neurodegenerative changes. The glial reactions in DRN are activated during the neurodegerative changes, and show characteristic patterns of glial reactions.

Zinc-enriched (ZEN) Terminals in Onuf's Nucleus Innervating External Urethral Sphincter: HRP Tracing Method and Zinc Selenium Autometallography

이보예,김이석,이법이,이현숙,탁계래,이영일,이정열,조승묵,Lee, Bo-Ye,Kim, Yi-Suk,Lee, Boeb-Y.,Lee, Hyun-Sook,Tak, Gye-Rae,Lee, Young-Il,Lee, Jeoug-Yeol,Jo, Seung-Mook Korean Society of Electron Microscopy 2006 Applied microscopy Vol.36 No.4

Onuf 핵이란 척수 앞회색질뿔에 위치하는 운동핵으로 음부신경을 통해 방광과 항문괄약근을 조절하는 운동핵의 하나이다. Onuf핵은 앞회색질뿔내 다른 운동신경핵과는 달리 회색질척수염과 같은 병적인 상황에서도 상당기간 손상되지 않고 기능을 유지하며, 퇴행성변화의 정도가 미약한데 정확한 원인에 관해서는 논란의 여지가 많다. 본 연구는 흰쥐 척수회색질내 바깥요도조임근을 신경지배하는 Onuf핵의 위치를 HRP 추적법으로 확인하였으며, 이들 신경핵내 운동신경세포와 연접해 있는 zinc함유(ZEN)신경종말의 미세구조를 zinc selenium조직화학법(AMG)으로 염색하여 관찰하였다. HRP 추적법의 결과로는, Onuf핵은 랫드 척수회색질앞뿔의 내측에서 가지돌기의 무리와 거의 맞닿고 있었으며, 모양은 대개 구형 또는 난원형을 띠었다. 이들 신경핵내 운동신경세포의 세포체의 크기는 다른 운동핵의 신경세포보다 다소 작았다. 한편 AMG로 염색한 표본에서는 Onuf핵에 분포하는 ZEN신경종말은 다른 운동핵의 ZEN 신경종말과 비교하여 매우 높은 밀집도를 보였으나, 크기 면에서도 상대적으로 작았다. 미세구조 관찰로는 Onuf 핵내 ZEN신경종말은 운동핵의 세포체 및 가지돌기와 신경연접은 이루고 있었다. 이들 ZEN 신경종말은 주로 납작한 연접소포를 함유하였으며, 대칭적인 신경연접구조를 이루고 있었다. Onuf's nucleus, which is located in the ventral horn, has been known to innervate the striated muscles of the urethral and anal sphincter muscles via the pudendal nerve Onuf's nuclei are resistant to pathologic condition such as poliovirus. The reason why the motor neurons in Onuf's nucleus are less degenerated is not certain until now. The present study aims at updating the microscopical characteristics including its location the Onuf's nucleus innervating the external urethral sphincter, and ultrastructures of the zinc-enriched (ZEN) terminals synaptically-contacting with Onuf's motor neurons in the rat spinal gray matter by using HRP tracing method and zinc selenium autometallography, respectively. Based on HRP tracing method, Onuf's nuclei were located adjacent lateral dendritic projections of the ventral horn. Their shape was almost round at lumbar level, but oval at sacral segment of spinal cord. In size, their somata were smaller than that of other motor nuclei. In AMG stained sections, Onuf's nuclei were innervated by highly concentrated ZEN terminals, and contained small and middle-sized ZEN, but totally void of large ZEN terminals. AMG silver grains were confined to presynaptic ZEN terminals against dendritic elements and somata of the Onuf's motor neurons. A majority of the ZEN terminals contained flattened synaptic vesicles and made symmetrical synaptic specializations.

랫드 후각점막내 Zinc 이온의 조직화학적 동정

남동우,손원재,김성주,김용국,김수진,유윤조,정영길,조승묵,Nam, Dong-Woo,Sun, Yuan-Jie,Kim, Sung-Joo,Kim, Yong-Kuk,Kim, Soo-Jin,Yu, Yun-Cho,Jeong, Young-Gil,Jo, Seung-Mook 한국현미경학회 2003 Applied microscopy Vol.33 No.2

본 연구는 후각점막에 내재하는 zinc의 분포를 형태학적으로 뚜렷이 보여준 예가 없기에 조직화학적으로 염색한 후 광학 및 전자현미경으로 이들의 분포를 기술하고자 하였다. 실험동물로는 성숙한 수컷 랫드(SD 계통)를 사용하였다. 우선 동물은 전신마취시킨 후 만들어진 selenium 용액 $100{\mu}l$를 복강에 주사하였고(i.p 실험군), 다른 방법으로는 selenium 용액 $100{\mu}l$를 비강 깁숙히 플라스틱관을 삽입한 후 Hamilton 주사기로 한 방울씩 떨어뜨렸다(i.n 실험군). 후각점막내 zinc를 조직화학법으로 동정하기 위해서 zinc 특이성이 높은 AMG법(Danscher, 1985)을 이용하였다. 각 실험군의 동물은 주사 후 2시간에 이르러 3% Glutaraldehyde 고정액으로 관류함으로써 희생시켰다. 고정후 비중격을 포함하여 후각부위를 떼어낸 수 $30{\mu}l$ 두께의 관상절편을 만들었다. AMG 반응이 끝나면 toluene blue (TB)로 대조염색하고, 알코올과 자일렌 등을 이용한 탈수과정 및 청명과정을 거쳐 광학현미경하에서 관찰하였다. 전자현미경적 절편을 만들기 위해 전자현미경 관찰을 위한 실험으로 vibratome을 사용하여, $100{\mu}m$ 두께의 가로절편을 만들었고, AMG염색이 끝나면 일반적인 전자현미경적 관찰을 위한 일련의 과정을 거쳐 투과전자현미경하에서 관찰하였다. Selenium 용액을 복강에 투여한 i.p 실험군에서는 $30{\mu}m$ 두께의 후각점막의 상층부와 기저부에서 강한 AMG 반응산물(silver grains)이 관찰되었으나 기저막아래 고유판에서는 전혀 관찰되지 않았다. 반면 selenium 용액을 비강점막에 직접 도포한 i.n 실험군에서는 i.p 실험군과 같이 후각점막에서 강한 AMG 반응이 관찰되었을 뿐만 아니라 이러한 반응이 기저막내 후각실의 주행을 따라 관찰되었다. 투과전자현미경으로 관찰된 후각상피에서는 AMG 과립이 지지세포의 세포 상층부에서 관찰되는 분비과립에 국한되는 소견이며, 이곳에서 관찰된 AMG은 과립(silver grains)은 원형 또는 난원형으로 그 크기는 다양하였다. 반면 세포체 하부에서 관찰된 AMG grains은 주로 용해소체위에서 밀집되어 관찰되었으며, 핵주변부 및 세포사이공간(intercellular space)에서는 AMG grains이 낱개로 구분, 관찰되었다. 한편 i.n 실험군에서 관찰된 후각점막의 전반적인 구조가 손상된 소견을 보였으며, 지지세포의 위쪽에서는 전자밀도가 높고 간상의 crystalloid structure가 다수 관찰되었고, 이들 구조에 다수의 AMG 과립이 붙어 있었다. 본 연구의 결과를 요약하면 랫드 후각점막에 존재하는 zinc는 지지세포의 분비과립과 후각세포의 축삭다발인 후각실에서 관찰되었는데 이는 zinc가 후각기능과 매우 밀접한 관련있음을 시사하며, 이는 향후 후각기능과 zinc의 연관성을 연구하는데 소중한 자료가 될 것으로 믿는다. 또한 본 연구의 결과는 후각점막의 이상으로 나타나는 여러 가지 질환의 병리에서 zinc가 영위하는 신경생물학적 기능을 밝히는데 유용한 기초자료가 될 수 있을 것으로 기대한다. The present study was designed to demonstrate ionic zinc in the rat nasal mucosa by means of zinc selenium autometallography ($ZnSe^{AMG}$). Rats were given sodium selenide either intraperitoneally (i.p) or intranasally (i.n). Prior to the i.n. administration the rats were anesthetized with pentobarbital sodium (30 mg/kg, i.p.). A thin plastic tube coupled to a Hamilton syringe was then inserted into the right nostril and $10{\mu}l$ of the solution was instilled. For the i.p. administration non-anesthetized rats were given $100{\mu}l$ of the sodium selenide solution (10 mg/kg). Control rats were instilled with saline. After 2 hrs survival, the rats were anaesthetized and transcardially perfused with 3% glutaraldehyde. The olfactory area was removed and put into same fixative. The nose was then sectioned ($30{\mu}m$) horizontally, autometallography (AMG) was performed according to Danscher et al. (1997). After silver enhancement, fine AMG grains were scattered in the whole length of the olfactory epithelium containing olfactory receptor neurons, sustentacular and basal cells. However, much higher concentration of the AMG grains occupied near the surface and in the basal region of the olfactory epithelium. Both groups of i.p. and i.n. administration showed almost same level in the concentration of the AMG grains. In i.n. group, few AMG grains were also found in olfactory nerves of the lamina propria, suggesting zinc transport into the olfactory bulb via olfactory axons. At the electron microscopic level, the AMG grains were most entirely found in the supporting cells of the olfactory epithelium, and they were mostly localized in lysosome-like organelles. The i.n. group showed various signs of tissue damage of the olfactory mucosa, where dense concentration of AMG grains were localized at crystalloid structures. The present study demonstrated dense population of ionic zinc in the rat olfactory epithelium. zinc may play a role in the olfactory functioin and in the pathogenesis of the neurodegerative disorders affecting nose.