한국산 단삼(Salviae Miltiorrhizae Radix)의 지표성분 분석과 생리활성 검정

성기운 경북대학교 대학원 2020 국내박사

본 연구에서는 한국산 단삼을 건강기능성 식품 소재로 활용하기 위해 형태학적 차이에 따른 주근 및 지근의 지표성분을 동시분석법을 개발하여 정량하였으며, 건강기능성 관련 생리활성을 조사하였다. 한국산 단삼의 주근 및 지근의 직경은 주근 7.90 mm 및 지근 1.92 mm로 나타났다. 한국산 단삼의 건조감량 10.63%, 회분 3.63%, 산불용성회분 0.86% 및 묽은에탄올엑스 63.10%로 나타났다. 박층크로마토그래프법의 결과 tanshinone ⅡA는 Rf값 0.6에서 확인하였다. 색도 중 적색도(a*)값은 봉화에서 재배된 한국산 단삼 K-1이 16.22로 가장 높은 값을 나타내었다. 한국산 단삼은 납 0.20 ppm, 비소 0.20 ppm 및 카드뮴 0.02 ppm이 미량 검출되었으며 수은은 검출되지 않았다. 아플라톡신 G1 0.01 ppb 및 오크라톡신 0.36 ppb이 미량 검출되었으며 아플라톡신 G2, B2 및 B1은 검출되지 않았다. 이산화황은 한국산 단삼에서 13.36 ppm으로 나타났다. 잔류농약 총디디티, 디엘드린, 총 비에이치씨, 알드린 및 엔드린은 모든 시료에서 검출되지 않았다. 지표성분의 동시분석법을 이용하였을 때 지표성분들이 명확히 검출되어 특이성을 만족하였다. 직선성은 0.999 이상으로 나타내었고, 반복성 0.01-0.52%, 검출한계 2.56-7.83 μg/mL 및 정량한계 7.76-23.71 μg/mL로 양호한 값을 나타내었다. 또한 일내 및 일간 정밀성 0.15-3.30%와 정확성 97.85-104.11%의 값을 나타내었다. 한국산 단삼의 지표성분은 salvianic acid A (0.02%), rosmarinic acid (0.41%), salvianolic acid B (5.72%), salvianolic acid A (0.08%), cryptotanshinone (0.15%), tanshinone Ⅰ (0.04%) 및 tanshinone ⅡA (0.47%)로 나타내었고, 한국산 단삼 K-1의 salvianolic acid B는 7.15%로 다른 지역 보다 높은 값을 나타내었다. 주근 및 지근의 함량을 비교하였을 때 지표성분 salvianolic acid B는 주근이 5.76%로 지근 4.97%보다 높게 나타났고, 지근의 지표성분 cryptotanshinone (0.13%), tanshinone Ⅰ (0.05%) 및 tanshinone ⅡA (0.43%)는 주근의 지표성분 cryptotanshinone (0.11%), tanshinone Ⅰ (0.02%) 및 tanshinone ⅡA (0.28%)보다 높게 나타났다. 또한 통계학적으로 지표성분함량을 주성분분석을 이용하여 비교하였을 때 형태학적인 차이에 따라 구분되었다. 항산화 활성 중 FRAP 활성은 주근(7.73 mM TE)이 지근(6.68 mM TE)보다 높은 활성을 나타내었다. 주근의 총페놀함량(83.40 mg GAE/g) 및 총플라보노이드함량(69.33 mg QE/g)은 지근의 총페놀함량(76.34 mg GAE/g) 및 총플라보노이드함량(59.90 mg QE/g)보다 높은 값을 나타내었고, 한국산 단삼 K-1이 높은 값을 나타내었다. 주근의 항산화성분 중 총페놀함량은 salvianolic acid B와 가장 높은 정의 상관관계(0.748)를 나타냈으며, tanshinone Ⅰ 함량(0.703) 및 tanshinone ⅡA 함량(0.640)의 순으로 높은 정의 상관성을 나타내었다. 지근의 항산화 활성 중 ABTS 라디칼 소거활성은 salvianolic acid B함량과 높은 정의 상관관계(0.847)를 나타내었다. 지근의 항산화성분 중 총플라보노이드함량은 tanshinone Ⅰ 함량과 높은 정의 상관관계(0.814)를 나타냈으며, tanshinone ⅡA 함량(0.810)의 순으로 높은 정의 상관성을 나타내었다. 단삼의 pancreatic lipase 저해활성은 지근(59.30%)이 주근(56.31%)보다 높게 나타났고, 모든 시료가 50% 이상으로 저해활성을 나타내 지방 축적을 억제할 수 있을 것으로 판단된다. 항균활성은 그람 양성균인 Bacillus cereus와 Staphylococcus aureus, 그람 음성균인 Escherichia coli O157:H7로 원시료에서 가장 높은 inhibition zone을 나타냈으며 그람 양성균에 대하여 우수한 항균효과를 나타내었다. 항염증 활성의 PGE2 및 cytokines (TNF-α, IL-1β 및 IL-6)의 결과 PGE2의 발현정도가 농도 의존적으로 감소함을 확인하였고, 원시료(61.5%)와 주근(60.7%)이 높은 발현 저해 활성을 나타내었고 지근은 TNF-α (46%), IL-1β (44.1%) 및 IL-6 (37.7%)에서 가장 높은 발현 저해 활성을 나타내었다. 또한 주근에서 iNOS 단백질 발현이 현저하게 감소한 것을 볼 수 있었으며, COX-2 단백질과 mRNA 단백질 발현의 경우 지근을 처리하였을 때 양성대조군 보다도 낮은 발현도를 보였다. 에스트로겐 수용체 ERα는 단삼추출물 10-500 μg/mL 농도에서 양성대조군보다 높은 발현율을 나타냈고, ERβ는 단삼추출물 100-500 μg/mL에서 양성대조군 보다 높은 발현율을 나타내었다. 이상의 결과로 한국산 단삼의 위해물질에 대한 안정성이 확보되었으며, 지표성분의 동시분석법을 개선 및 검증함으로써 단삼의 품질 표준화 확립이 가능해졌다. 또한 건강기능 관련 생리활성으로 pancreatic lipase 저해활성, 항균활성, 항염증 활성과 에스트로겐 수용체 활성이 검정되어 한국산 단삼의 고품질화와 고부가가치화에 크게 기여할 수 있을 것으로 판단된다. To the marker compound and physicochemical activities of the taproot and lateral root of Korean Danshen (Salviae miltiorrhizae Radix), which is cultivated in Korea, were investigated. Korean Danshen was collected from four regions (Bonghwa, Gochang, Jangheung, and Yeongyang) in Korea. A Chinese-origin sample was purchased from a traditional medicine local market in Daegu. The roots were separated into two portions (the taproot and lateral root). The diameter of the taproot (6.77–10.02 mm) was thicker than that of the lateral root (1.34–2.31 mm), and the color of the surface was darker. I developed and validated a quantitative analysis method for Korean Danshen using high-performance liquid chromatography (HPLC). Identification was performed using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Seven marker compounds of the taproot and lateral root were detected and quantified in all the samples. The marker compound contents were analyzed through principal component analysis (PCA) to provide further information. Both the taproot and lateral roots were investigated to estimate antioxidant capacities. Correlation analysis between antioxidant capacities and marker compound contents of the taproot and lateral root was performed using Pearson’s correlation test (p<0.05). In addition, their pancreatic lipase inhibitory activities, antimicrobial activities, anti-inflammatory activities, and estrogen receptor activities were investigated. This study could provide useful information for the classification and utilization of Korean Danshen as a herbal medicinal product. Korean Danshen is acceptable as per the Korean Pharmacopoeia (KP) with respect to the following quality control standards: loss on drying (10.63%), ash (3.63%), acid-insoluble ash (0.86%), and 50% ethanol-soluble extract (63.10%). The quality control standards as per KP are: loss on drying (not more than 12.0%), ash (not more than 10.00%), and 50% ethanol soluble extract (63.10%). All samples changed color from red to yellow before the quality control testing as per KP. In addition, the tanshinone ⅡA compound was detected at the Rf value of 0.6 using high-performance thin-layer chromatography. The K-1 (16.22) sample collected from Bonghwa in Korea showed the highest redness of color value (a*) in comparison with the other samples. The Korean Danshen samples were analyzed for heavy metals, mycotoxins, sulfur dioxide, and residual pesticides for safety assessment. The heavy metal content was as follows: lead (0.20 ppm), arsenic (0.20 ppm), cadmium (0.86%), and mercury was undetected. The mycotoxins present were G1 (0.01 ppb) and ochratoxin A (0.36 ppb), while aflatoxin G2, B2, and B1 were not detected. The sulfur dioxide content was found to be 13.36 ppm. Residual pesticides of total BHC (sum of α, β, г, and δ-BHC), total DDT (sum of p,p΄-DDD, p,p΄-DDE, o,p΄-DDT and p,p΄-DDT), aldrin, endrin, and dieldrin were not detected in any of the samples. The results of this purity analysis confirmed the safety of Korean Danshen. The marker compound contents of Korean Danshen from the various cultivation regions were analyzed using a validated HPLC method. The contents of salvianic aicd A, rosmarinic acid, salvianolic acid B, salvianolic acid A, cryptotanshinone, tanshinone I, and tanshinone IIA were 0.00-0.05, 0.24-0.55, 5.08-7.15, 0.03-0.13, 0.12-0.18, 0.01-0.09, and 0.37-0.68%, respectively. The salvianolic acid B content was the highest in comparison with the other marker compounds in the taproot (5.76%) as well as the lateral root (4.97%). The cryptotanshinone, tanshinone I, and tanshinone IIA contents were higher in the lateral root (0.13%, 0.05%, and 0.43%) than in the taproot (0.11%, 0.02%, and 0.28%). PCA, a multivariate analysis method, was used to simplify the complexity of the high-dimensional data. It achieves this by transforming the data into fewer dimensions, which acts as summaries of the features. The marker compound contents of the taproot and lateral root were set as measurement variables. The components of the PCA may be used to explain variance within the variables. Regarding the position on the graph, the taproot was clustered at the top, whereas the lateral root was at the bottom; thus, Korean Danshen can be distinguished with respect to the root portion (taproot and lateral root). These results revealed the different marker compound contents of the taproot and lateral root, which could be used for the classification of Korean Danshen. The DPPH radical scavenging activity, FRAP, and ABTS radical scavenging activity assays were performed, and the total phenolic content (TPC) and total flavonoid content (TFC) were determined to evaluate the antioxidant capacities of the taproot and lateral root. The FRAP activity was significantly higher in the taproot (7.73 mM TE) than in the lateral root (6.68 mM TE). The results demonstrated higher TPC and TFC values in the taproot (83.40 and 69.33 mg QE/g, respectively) in comparison with the values of the lateral root (76.34 and 59.90 mg QE/g, respectively). The TPC of the taproot had the highest positive correlation with salvianolic acid B content (r = 0.748), followed by tanshinone I content (r = 0.703), and then tanshinone IIA content (r = 0.640). The marker compounds (rosmarinic acid, salvianolic acid B, cryptotanshinone, tanshinone I, and tanshinone IIA) of the lateral root showed a significant positive correlation with the TPC, TFC, FRAP, and ABTS activities. The salvianolic acid B content of the lateral root had the highest positive correlation with ABTS activity (r = 0.847), followed by FRAP activity (r = 0.703) (p < 0.01). Specifically, the tanshinone I content of the lateral root showed the high positive correlation with TFC (r = 0.814), and TPC (r = 0.807) (p < 0.01). Moreover, tanshinone IIA content was significantly positively correlated with TFC (r = 0.810) and TPC (r = 0.764) (p < 0.01). Therefore, the antioxidant capacities of the taproot and lateral root are highly correlated to the contents of salvianolic acid B and tanshinone IIA. The pancreatic lipase inhibitory activity of the lateral root (59.30%) was higher than that of the taproot (56.31%). Additionally, all samples showed more than 50% inhibitory activity. Antimicrobial activities were determined against three strains using the disc diffusion method. The Korean Danshen extracts exhibited potent antimicrobial activities against Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, and Escherichia coli O157:H7. The measurement of cell toxicity in RAW 264.7 cells confirmed that the cell survival rate was greater than 80% at the concentration of 50 μg/mL. The anti-inflammatory activity was measured in terms of nitric oxide production-suppressing activity. High anti-inflammatory activity was observed with the taproot extract showing an inhibitory rate of 49.9% (50 μg/mL). The expression of prostaglandin E2 (PGE2) and cytokines (TNF-α, IL-1β, IL-6) was measured. The expression rate of PGE2 was reduced in an extract concentration-dependent manner. The results showed that raw roots (61.5%) and taproots (60.7%) showed high PGE2-expression inhibiting activity, and taproot also showed high inhibitory activity against TNF-α (46%), IL-1β (44.1%), and IL-6 (37.7%) expression. The inhibitory effects of the taproot extracts on the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) were higher than that of the lateral root extracts. However, the inhibitory effects of the lateral root extracts on the expression of COX-2 and mRNA were higher than that of the taproot extracts. Therefore, Korean Danshen extract shows an anti-inflammatory effect by inhibiting the protein and mRNA expression of iNOS and COX-2, which increases due to the presence of lipopolysaccharide (LPS). Moreover, the extracts inhibit the expression of NF-κB-related proteins induced by LPS and inflammatory gene transcription factors. Cell viability was measured for MCF-7 and MDA-MB-231 cells for the study of estrogen receptor activities. It was confirmed that cell viability was increased in a concentration-dependent manner in MCF-7 cells. Treatment with the extract (100-500 μg/mL) resulted in a higher rate of expression of ERα and ERβ in MCF-7 cells, estrogen receptor-positive cells, than in the positive control (17β-estradiol). Thus, Korean Danshen could be useful for women's health during menopause as it promotes estrogen receptor activity. Taken together, the present study revealed that the analytical method developed in this study could be used as a rapid and simultaneous analysis method for quality standardization of Korean Danshen. Moreover, the Korean Danshen may be useful as a health functionality in the development of pancreatic lipase inhibitory activity, antimicrobial activities, anti-inflammatory activities and estrogen receptor activities.

단삼(Saliva miltiorrhiza Bunge)추출물의 항생제 내성균주 (MRSA)에 대한 항균활성 및 내성 유전자조절 효과

지영주 계명대학교 대학원 2006 국내석사

This study was performed to evalutate antimicrobial activity of extracts from Saliva miltiorrhiza Bunge on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and resistant genes regulation and will ensure safety to MRSA. 1. Screening of 122 extracts from medicinal plants for antimicrobial activity using disc diffusion method against S. aureus ATCC 25923 indicated that Asiasarum heterotropoides var. mandshuricum and Salvia miltiorrhiza Bunge were most active by showing of inhibition zone 19 mm and 18 mm, respectively, at 2.5 mg/disc. Moreover, the extracts of these plants showed inhibition zone against MRSA KCCM 11812 as 18 mm at 5 mg/disc. However, Asiasarum heterotropoides var. mandshuricum is inedible because of its strong toxicity. From the results, Salvia miltiorrhiza Bunge was selected for further tests. 2. Salvia miltiorrhiza Bunge methanol extract showed the highest antimicrobial activity against S. aureus. Also, the extract exhibited strong antimicrobial against various MRSA, such as KCCM 11812. The MICs of Salvia miltiorrhiza Bunge methanol extract against various MRSA were 1.25 < MICs ≤ 2.15 mg/mL. MRSA KCCM 40510 was killed at 2 mg/mL by the extract after 24 hr of cultivation. The antimicrobial effect of Salvia miltiorrhiza Bunge methanol extract was observed at the same concentration corresponding to MICs. 3. Various solvent fractions of Salvia miltiorrhiza Bunge methanol extract were tested antimicrobial activities against S. aureus and MRSA. The results showed inhibition zones of hexane (16 mm) and chloroform (14 mm) fractions against MRSA KCCM 40511 at 1,000 μg/disc. The hexane fraction showed greater inhibitory effect than the chloroform fraction. 4. To observe the morphological change of MRSA according to the hexane fraction (from Salvia miltiorrhiza Bunge methanol extract) 25 μg/mL treatment, SEM and TEM of MRSA KCCM 40511 were measured. The results from SEM and TEM showed decreased number of bacteria, lysis and damaged cell wall. 5. The hexane and chloroform fractions inhibited the expression of resistant genes MecA, MecI, MecR1 and FemA using RT-PCR method. Moreover, western blotting assays showed that the hexane and chloroform fractions inhibited the expression level of resistant protein MecA, PBP2a. 6. MRSA was isolated from raw chicken and the resistant genes were detected by RT-PCR method. The expressions of resistant genes from MRSA were inhibited by the hexane fraction as detected by RT-PCR and Western blot assay. In conclusion, we found that the hexane and chloroform fractions of Salvia miltiorrhiza Bunge showed strong antimicrobial activity against S. aureus and MRSA. It also inhibited expression level of resistant genes. Therefore, with more researches on identification, action mechanism and toxicity test of active compounds, the hexane and chloroform fractions from Salvia miltiorrhiza Bunge are expected to be natural sources for the developments of functional foods and will ensure safety to MRSA. 본 연구에서는 최근 전 세계적으로 문제가 되고 있는 항생제 내성균 (MRSA)에 대해 항균 활성 및 내성유전자 조절 물질을 찾아 MRSA에 대해 안전성을 확보하고자 하였다. 이에 122종의 천연약용식물로부터 항균 물질을 검색하고 선별된 단삼 추출물을 분획하고, MRSA에 대한 항균 활성 및 내성 유전자 조절 효과를 조사하였다. 1. 122종의 천연약용식물 추출물을 disc diffusion method로 S. aureus ATCC 25923에 대한 항균 활성을 검색한 결과 세신이 19 mm로 가장 우수한 항균 활성을 보였고, 단삼이 18 mm로 측정 되었고, 황련, 가자, 감초, 호장근, 강향, 고삼 등에서도 항균 활성을 보였다. 122종의 천연약용식물 추출물 중 항균활성이 우수하였던 추출물 6종을 농도별로 MRSA KCCM 11812에 대한 항균 활성을 검색한 결과 세신, 단삼, 황련, 가자, 호장근, 감초 순으로 항균 활성을 나타냈다. 고 농도인 5 mg/disc 농도에서 세신과 단삼이 18 mm로 같은 항균 활성을 보였지만, 2.5 mg/disc 농도에서는 세신이 15 mm, 단삼이 13 mm로 낮은 농도에서는 세신이 단삼 보다 더 우수한 항균 활성을 보였다. 하지만 세신은 독성이 강하고 식용이 불가능함으로 식용 가능하고 식품 주원료로 쓸 수 있는 단삼을 최종적으로 선별하였다. 2. 최종적으로 선별된 단삼 메탄올 추출물의 S. aureus 및 MRSA에 대한 항균 활성을 측정한 결과 S. aureus에서 MRSA보다 항균 활성이 더 우수 하였으며, 다음으로 penicillin에 내성을 보이는 MRSA KCCM 11812, methicillin의 내성을 보이는 MRSA KCCM 40510, gentamicin에 내성을 보이는 MRSA KCCM 40512, 그리고 methicillin과 gentamicin에 다제 내성을 보이는 MRSA KCCM 40511순으로 항균 활성을 나타냈다. 또한, 단삼 메탄올 추출물의 S. aureus 및 MRSA에 대한 최소저해농도 (MIC)를 측정한 결과 항균 활성의 결과와 유사한 경향을 나타냈으며, 생육곡선을 24시간 동안 측정한 결과 5균주 모두에서 control의 경우 유도기, 대수기, 정상기를 거치면서 빠르게 성장 하지만 MIC농도로 단삼 메탄올 추출물을 처리 하였을 때는 균이 성장하지 못하는 것을 알 수 있었다. 3. 단삼 메탄올 추출물을 순차적으로 분획하여 항균 활성을 측정한 결과 hexane, chloroform 분획물 에서 S. aureus 및 MRSA에 증식을 억제하여 항균 활성을 나타냈고 특히 MRSA KCCM 40511의 경우 hexane 분획물의 1,000 μg/disc 농도에서 16 mm의 항균 활성을 보였지만 250 μg/disc 농도에서는 항균 활성을 나타내지 않았고, chloroform 분획물은 1,000 μg/disc 농도에서 14 mm의 항균 활성을 보였으며 낮은 농도에서는 항균 활성이 나타나지 않았다. 이러한 결과로 보아 단삼 hexane 분획물이 chloroform 분획물 보다 고농도에서 더 우수한 항균 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 4. MRSA의 형태학적 변화 관찰을 위해 고도 내성균주인 MRSA KCCM 40511에 단삼 hexane 분획물을 처리하여 주사전자 현미경을 관찰한 결과 대조구에 비해 단삼 hexane 분획물을 25 μg/mL 처리한 균의 경우 균수가 줄어들고 용균되어 손상되었음을 확인할 수 있었다. 또한 투과전자현미경을 관찰한 결과, 대조구는 세포벽의 형태가 두껍고, 뚜렷한 형태를 나타내고 있지만 단삼 hexane 분획물을 25 μg/mL 처리한 균의 경우 균수가 줄어들고 균의 세포벽이 용해되고, 얇아진 것을 관찰할 수 있었다. 5. 단삼 추출물의 내성 유전자 억제 효과 측정을 위해 RT-PCR법을 수행한 결과 MecA유전자의 경우 단삼 hexane 분획물 10 μg/mL의 낮은 농도에서 발현이 억제되는 것을 알 수 있었고, MecR1, FemA유전자 또한 농도 의존적으로 발현이 억제되는 것을 볼 수 있었다. 그리고 Western blot법에 의한 내성 단백질 발현 변화를 조사 한 결과 RT-PCR법에 의한 결과와 유사하게 단삼 추출물이 MecA의 발현을 억제으며 또한, MecA의 의해 합성되는 PBP2a의 발현도 억제시키는 것을 알 수 있었다. 6. 두부, 상추, 생닭, 쇠고기 (국산), 쇠고기 (수입), 돼지고기에서 MRSA를 분리 및 확인 한 결과 생닭에서 MRSA가 분리 되었다. RT-PCR법에 의해 생닭에서 분리한 균의 내성 유전자 발현 조사를 한 결과 단삼 hexane 분획물이 농도 의존적으로 내성 유전자 (MecA, MecI, MecR1, FemA) 발현을 억제 하는 것을 알 수 있었다. Western blot을 수행한 결과 또한 내성 단백질 발현 (MecA, PBP2a)을 억제 하는 것을 알 수 있었다. 본 연구의 결과들로 볼 때, 단삼 hexane, chloroform 분획물이 항균성 물질을 함유하고 있으며 이 중 특히, 단삼 hexane 분획물에 높은 효과를 나타내는 항균성 물질이 함유되어 있어 MRSA에 대한 항균 활성뿐만 아니라 내성 유전자 조절에 우수한 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다. 앞으로 이들 활성성분들의 규명과 단삼 hexane, chloroform 분획물에 대한 독성평가가 병행된 후 식품에 소재 혹은, 포장재 등으로 활용한다면 MRSA로부터의 안전성이 확보될 것이라고 사료된다.

丹蔘의 抗癌活性과 apoptosis에 미치는 影響

최선미 경희대학교 대학원 2000 국내박사

본 논문은 腫瘍의 瘀血證에 활용할 수 있는 活血化瘀之劑인 丹蔘 추출물의 抗癌 및 apoptosis 효과를 비교평가하였다. 丹蔘의 물추출물, methanol추출물, diethyl ether 추출물, 주요 활성성분인 tanshinoneⅡA를 가지고 암세포 세포독성, DNA topoisomeraseⅠ저해, 암세포의 apoptosis, 생존율 등의 실험을 통해 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 단삼의 암세포 세포독성 실험에서는 물추출물, methanol 추출물, diethyl ether 추출물, tanshinoneⅡA의 IC50이 AGS 암세포주에 대해서 각각 577㎍/㎖, 483㎍/㎖, 19.4㎍/㎖, 1.8㎍/㎖로 나타났고, K562 암세포주에 대해서 각각 36.1㎍/㎖, 29.6㎍/㎖, 1.05㎍/㎖, 0.89㎍/㎖로 나타났다. 2. 단삼 물추출물의 HepG2, AGS, K562 암세포주에 대한 IC50은 각각 746.3㎍/㎖, 577㎍/㎖, 36.1㎍/㎖로 간암과 위암보다는 혈액암세포주에서 세포독성이 높게 나타났다. 3. HL-60 암세포에 농도별로 4시간 처리한 결과, 단삼 물추출물은 1000㎍/㎖에서 단삼 methanol 추출물은 250㎍/㎖에서, 단삼 diethyl ether 추출물은 10㎍/㎖에서, tanshinone ⅡA는 1㎍/㎖에서 apoptosis의 특징인 internucleo- somal DNA fragmentation 현상이 관찰되었다. 4. K562 암세포에 농도별로 24시간 동안 처리한 결과, 단삼의 물추출물, methanol 추출물, diethyl ether 추출물, tanshinone ⅡA 모두에서 농도 의존적으로 2n 이하의 DNA 함량을 지닌 hypodiploid의 apoptosis의 특징을 지니는 세포의 percentage를 뚜렷하게 증가시켰다. 5. 단삼의 물추출물, methanol 추출물, diethyl ether 추출물, 지표물질인 tanshinoneⅡA는 HL-60 암세포를 이용한 caspase-1 활성도 측정에서는 그 변화가 없었으며, caspase-3 활성도 측정에서는 각각 1000㎍/㎖, 250㎍/㎖, 6.2㎍/㎖, 0.3㎍/㎖의 농도에서 활성도가 나타나기 시작하였다. 6. 단삼 물추출물은 P388을 처치한 CDF1계 생쥐 대조군에 대한 생존율을 115%로 증가시켰다. 이상의 결과로 보아 단삼의 물추출물, methanol 추출물, diethyl ether 추출물, 단삼의 주요성분인 tanshinoneⅡA는 모두 암세포에 대한 세포독성이 있으며, apoptosis를 유발함으로써 항암효과가 있음이 인정되며, 특히 tanshinoneⅡA는 단삼의 주요성분임과 동시에 주요 항암활성물질으로 볼 수 있는 바 단삼은 암치료에 널리 활용될 수 있을 것으로 사료된다. Salviae miltiorrhizae Radix is an oriental medicinal herb which has been traditionally used for improving blood function and removing pathological blood component, 'Eo-Hyeol'. In this study, anticancer effects of Salviae miltiorrhizae Radix was investigated. In cytotoxicity test using AGS human gastric carcinoma cell line, IC50 values were 1.8 ㎍/㎖(tanshinone IIA), 19.4 ㎍/㎖(diethyl ether extract), 484 ㎍/㎖(methanol extract), and 577 ㎍/㎖(water extract). When K562 human leukemia cell line was used for cytotoxicity test, IC50 values were much lower ; 0.89 ㎍/㎖(tanshinone IIA), 1.05 ㎍/㎖(tanshinone IIA), 29.6 ㎍/㎖ (methanol extract) and 36.1 ㎍/㎖(water extract). In apoptosis experiment using HL-60 and K562 human leukemia cell line, DNA fragmentation was induced at the concentration of 1 ㎍/㎖(tanshinone IIA), 10 ㎍/㎖(diethyl ether extract), 250 ㎍/㎖(methanol extract), and 1000 ㎍/㎖(water extract). Caspase-1 activity was not changed after Salviae miltiorrhizae Radix extract treatment, but caspase-3 activity was significantly increased at the concentration of 0.3 ㎍/㎖(tanshinone IIA), 6.2 ㎍/㎖(diethyl ether extract), 250 ㎍/㎖(methanol extract), and 1000 ㎍/㎖(water extract). All Salviae miltiorrhizae Radix extracts dose-dependently induced apoptotic cells with hypodiploid DNA contents in flow cytometry analysis. In this study, water extract, methanol extract, diethyl ether extract and tanshinone IIA of Salviae miltiorrhizae Radix was shown to have anti-cancer effects through cytotoxicity and apoptosis induction in human cancer cells.

단삼과 울금으로부터의 항산화능 검색 및 약과에의 첨가효과

김윤화 숙명여자대학교 대학원 2002 국내석사

전통 천연물로 한약재로도 사용되어 온 단삼(Salvia miltiorrhiza)과, 울금(Curcuma longa)을 ethanol로 추출하여 추출물을 얻었고, methanol로 추출하여, 용매별로 순차분획하여 농축시켜 분획별 추출물을 얻었다. 항산화효과를 실험하기 위해 DPPH 방법으로 전자공여능을 측정하였으며, 식품에의 첨가에 대한 항산화효과를 실험하기 위해 단삼 및 울금 에탄올 추출물을 약과에 0.0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0%별로 첨가하여 제조 한 후 5일간 60℃ Drying oven에 넣어 24시간 단위로 AV, POV, TBA가를 측정하여 상대적 항산화효과(RAE : relative antioxidant effectiveness)를 산출하였다. 항산화 효과에 대한 실험으로 전자공여능을 측정한 결과 단삼과 울금 에탄올 추출물은 IC50이 8.27과 12.59㎍/㎖이었으며, 각 분획별 전자공여능은 단삼은 Ethyl Acetate층> Chloroform 층> Buthanol층> Water층> Hexane층이었고, 울금은 Chloroform 층> Ethyl Acetate층> Hexane층> Water층> Buthanol층 순으로 나타났다. 실제식품에의 이용성을 살펴보고자 단삼 및 울금의 에탄올 추출물을 약과에 첨가하여 제조 후 이화학적 특성 중 수분함량은 차이가 없었고, 저장기간에 따라 감소하는 경향을 보였으며, 울금 추출물을 첨가한 경우는 단삼 첨가군보다는 약간 높은 5.5∼6.3%의 수분함량을 보였다. 첨가량이 증가할수록 수분함량의 변화는 적게 나타났으며, 0.75%첨가군이 가장 낮은 수분 감소 변화를 보였다. 색도에 있어서는 외부색 중 명도 L값은 추출물을 첨가할수록 감소하는 경향을 보였으며 저장기간이 지날수록 감소하는 경향을 보였다(p<0.05). 적색도 a값은 단삼의 경우 첨가량이 증가할수록 증가하는 경향을 보였고, 저장기간이 길어질수록 증가하는 경향을 보였다(p<0.05). 울금의 경우 첨가량이 증가할수록 증가하였고, 저장기간이 길어질수록 감소하였다(p<0.05). 황색도 b값은 단삼과 울금의 경우 모두 첨가량이 증가할수록 증가하였으며, 저장기간에 따라 단삼의 경우 그 값이 감소하였으며, 울금은 차이는 없었으나 다소의 감소경향을 보였다(p<0.05). 내부의 색도 중 명도 L값은 외부색과 마찬가지로 추출물을 첨가할수록 감소하는 경향을 보였으며 저장기간이 지날수록 감소하는 경향을 보였다(p<0.05). 적색도 a값은 단삼의 경우 첨가량이 증가할수록 증가하는 경향을 보였고, 저장기간에 따라서는 차이가 없었다(p<0.05). 울금의 경우 첨가량이 증가할수록 감소하였고, 저장기간이 차이는 없었다(p<0.05). 황색도 b값은 단삼의 경우 첨가량이 증가할수록 감소하였으며, 울금의 경우 첨가량의 다소에 관계없이 무첨가군보다 매우 높은 값을 나타냈다. 저장기간에 따라 단삼의 경우 그 값이 감소하였으며, 울금의 경우 차이는 없었으나 다소의 감소경향을 보였다(p<0.05). 지질산패도 실험결과, 단삼 및 울금 추출물을 첨가한 약과는 무첨가군에 비해 지질산화가 적게 일어났으며 그 효과는 첨가농도가 증가할수록 항산화효과도 크게 나타났다. 60℃에서 5일 동안 저장할 때, 산가의 RAE는 무첨가군을 100으로 보았을 때, 단삼의 경우 첨가량별로 130, 217, 269, 282로 증가하였으며, 울금 또한 139, 227, 253, 363으로 증가하였다. POV의 RAE도 단삼의 경우 122, 187, 218, 267, 울금은 108, 222, 373, 612로 급격한 증가를 보였다. TBA value의 RAE는 단삼은 137, 286, 419, 555이고, 울금은 122, 265, 495, 557로 뚜렷한 항산화 효과를 보였다. 따라서 단삼 및 울금 추출물 첨가 약과가 무첨가군에 비하여 저장효과가 우수한 것으로 나타났다. 관능검사특성을 보면, 맛에 있어서 첨가군이 무첨가군에 비해 차이는 보이지 않았으나, 저장기간이 지날수록 값이 감소하였다. 색, 향, 씹힘성에 있어서도 첨가량에 의해서는 차이가 없었으나, 저장기간이 길어질수록 값이 감소하였다. 단삼 및 울금 추출물을 첨가한 약과 모두 0.5% 첨가군이 전반적인 선호도가 높게 나타났다.(p<0.05) 기계적 특성 중 경도의 경우 추출물 첨가량에 따라서는 차이가 없었으나, 저장기간이 지날수록 그 값이 증가하였다.(p<0.05) 이상의 결과로 보아 단삼 및 울금추출물의 첨가는 지질 산패를 더디게 하여 유지식품의 저장기간을 연장시킬 수 있을 것으로 생각된다. 따라서 유지의 종류나 식품에서의 이용에 대한 폭 넓은 연구가 요구되어 진다. This study was carried out to investigate the antioxidant activities of Dansam (S. miltiorrhiza) and Ulgum (C. longa). Dansam (S. miltiorrhiza) and Ulgum (C. longa) were extracted with ethanol and methanol extracts were fractionated with hexane, chloroform, ethyl acetate, buthanol extract and water in order. The antioxidant activities of Dansam (S. miltiorrhiza) and Ulgum(C. longa) were determined by measuring the radical scavenging effect using 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH) method. The electron donating ability showed about 50%(IC50) at concentration of L-ascorbic acid, Dansam and Ulgum that reflected eliminatory effect by 50% were 9.48㎍/㎖, 8.28㎍/㎖ and 12.59㎍/㎖ respectively. In order to review their usability to the actual food, a Yakgwa was manufactured by adding the ethanol extract of Dansam(S. miltiorrhiza) or Ulgum(C. longa). Its physicochemical, physical, and taste characteristics were studied. The moisture content of the group with the added was shown to be not significantly. In the measurement of colors, we divided in and out. In case of outer color, the luminosity to be L was shown to be to be decreased as amount of the extract added was increased, and there was decreased according to the periods of storage (p<0.05). The red color a value increased as the amount of extracted Dansam Yakgwa was increased, and was shown to increased as the time of storage was increased(p<0.05). That for Ulgum Yakgwa was increased as the amount of the extract added was increased, but was decreased as the time of storage was increased. The yellow color b value was increased as the amount of the extract added was increased, but Dansam Yakgwa was decreased as the time of storage was increased. In case of inner color, the luminosity to be L was shown to be to be decreased as amount of the extract added was increased, and there was decreased according to the length of storage (p<0.05). The red color a value increased as the amount of extracted Dansam Yakgwa was increased, and was not significantly as the time of storage was increased(p<0.05). That for Ulgum Yakgwa was decreased as the amount of the extract added was increased, but was not significantly as the time of storage was increased. The yellow color b value Dansam Yakgwa was decreased as the amount of the extract added was increased, but was decreased as the time of storage was increased. All group of Ulgum Yakgwa were shown to be significantly high (p<0.05). According to the results of the above antioxidation experiments, those for the group with extract of Dansam or Ulgum added were decreased oxidation, and were increased antioxidation as the time was increased. At the storage temperature of 60 ℃ for 5 days, acid value for the relative antioxidant activity showed higher than Control group.(Dansam or Ulgum) Peroxide value for the relative antioxidant activity showed higher than Control group.(Dansam or Ulgum) TBA value the relative antioxidant activity showed higher than Control group.(Dansam or Ulgum) According to the result of the taste test, the taste of group with the extract added was evaluated to be better compared to that of the group with no extract added. And there was no significant difference according to the concentration, but was significant as the time went by. The overall preference for the group with 0.5% extract added was shown to be higher(p<0.05). Therefore, we could see its usability as a natural antioxidants.

골막유래세포와 천연물을 이용한 새로운 골이식법에 관한 연구

심경미 전남대학교 대학원 2009 국내박사

Bone graft is the second most common transplantation tissue with blood being by far the commonest in order to repair bone defects in various clinical circumstance of orthopedics and dentistry. Several methods of reconstructing bone defects are used such as autograft, allograft, xenograft, and alloplast. Autograft is most widely used by surgeons for the reconstruction of bone defects, since these grafts contain viable cells such as osteoprogenitor cells, collagenous and noncollagenous extracellular matrices, and growth factors. Autograft is still considered as the Gold Standard for bone graft, because it induces osteogenesis, osteoinduction, and osteoconduction. Also, there is no immune reaction and the microscopic architecture is perfectly matched. The only disadvantage of the autograft is that it has to be harvested from a secondary site of the body, so autograft harvesting is associated with a 10-30% of complications including infection, hematoma, and chronic pain at the donor site. Bone replacement material (such as allograft, xenograft and alloplast) is the most frequently chosen bone substitute in order to replace of autologous bone. Although allograft and xenograft products have been used for many years, the risk of disease transmission can never be completely eliminated and yield more variable clinical results than autograft. Therefore, there is a critical need for the development of bone substitute materials that will eventually be reabsorbed, leaving space for new bone formation. Further study needs to be performed the fusion technology with natural extracts, peptides, and scaffolds using of the combination of tissue engineering. The periosteum contains multipotent cells that can differentiate into osteoblasts and chondrocytes, so cultured periosteum-derived cells (PDCs) have osteogenic capacity. And aucubin is the iridoid glycoside isolated from Aucuba japonica and has promotion of osteoblast activity. Salvianolic acid B (Sal B) is the main hydrophilic constituent of Danshen. Previous studies have demonstrated that it has potentiality to improve angiogenesis, osteoblast activity and new bone formation. The purpose of this study was to evaluate the cell-biomaterial interaction and the osteogenic capacity of aucubin and Sal B. First step, after cell isolation from calvarial periosteum of aged Sprague-Dawley rats, cultured periosteal-derived cells were placed in rat critical-sized calvarial defects with beta-tricalcium phosphate. All rats were sacrificed at 8 weeks after bone graft surgery, and the bone regenerative ability of bone grafting sides was evaluated by plain radiography, micro-CT, and histological examination. Second step, I examined the effect of aucubin and Sal B on osteogenesis of mesenchymal stem cells in vitro. The cell proliferation was analyzed using MTT assay. Alizarin red staining was done for mineralization. Alkaline phosphatase (ALP) activity for cell metabolism and calcium concentration for calcium availability were analyzed using a commercial ELISA kit. The change of cell morphology was observed using scanning electron microscope (SEM). The in vivo osteogenesis effect of water extract of Danshen was further investigated using rats with critical-sized calvarial defects. In results, cultured enhanced calcification in the defect site, density of regenerated bone, presence or absence of new bone formation and cell within the defect and its boundaries. In addition, radiographic, histological and micro-CT analyses revealed that β-TCP graft with periosteum-derived cells was more efficient to regenerate the new bone than graft β-TCP only. Aucubin, a natural substance from Aucuba japonica, does not increase ALP activity of MG 63 and MC3T3E1 cells and was confirmed that there is no effect in osteoblast activity. However, Sal B showed osteogenic differentiation as evidenced by new bone formation as well as high ALP activity. The Alizarin red staining had increased with the ODM+Sal B culture. I demonstrated that Sal B, at different concentrations, especially at optimal concentration of 50 ㎍/㎖ could stimulate bone marrow stromal cells (BMSCs) to express alkaline phosphatase, and to form calcified nodules in vitro. To confirm the osteogenic activity in vivo, I have established in rat critical-sized calvarial defect model using the combination with collagen scaffold and SM hydrophilic extract. All rats were extinguished at 8 weeks after bone graft surgery, and the bone regeneration ability of bone grafting sides was evaluated by plain radiography, micro-CT, and histological examination. These results revealed Sal B had the potential to promote osteogenesis in vitro and vivo especially continuous oral administration compared to local treatment. This compound may provide a new alterative agent for growth factors to promote bone healing and bone regeneration. In conclusion, these results suggest that cultured periosteal-derived cells and SM hydrophilic extract have the potential to promote osteogenesis in bone defects. Further studies about fusion technology with Sal B, peptides, growth factors, and scaffolds using of the combination of tissue engineering, cell engineering and mechanical engineering are needed. 골이식은 정형외과 및 치과의 다양한 임상적 상황에서 골결손부에 새로운 골물질을 이식하여 치유시키는 수술법으로 현재 혈액 다음으로 가장 빈번히 이식되는 조직이다. 골결손 부위의 수복을 위해 사용되는 골이식재는 크게 자가골, 동종골, 이종골, 합성골로 나눌 수 있다. 환자 자신의 다른 부위로부터 채취된 자가골은 면역반응을 유발하지 않고 이식부위로 직접 골형성세포를 제공할 뿐만 아니라, 간질세포를 끌어들이고, 간질세포를 골유도성장인자에 노출시켜 골형성세포로의 분화를 유도한다. 따라서 자가골이 임상적으로 사용 가능한 이식재 중 gold standard로 여겨지고 있다. 그러나 채취량이 제한적이고 공여부에 부가적인 수술 및 이차적인 골결손부를 필요로 하며, 환자의 10-30%에서 공여부에 다양한 합병증이 발생할 수 있다는 점이 문제점으로 지적되고 있다. 이를 대신하여 사용될 수 있는 이식재로 동종의 다른 개체로부터 채취된 동종골, 다른 종으로부터 채취된 이종골 및 공장에서 대량 생산해내는 합성골이 있다. 그러나 합성골은 골이식 부위에서 기대한 만큼의 골재생 효과를 나타내지 않고, 동종골 및 이종골의 경우 면역반응 유발 및 질병 전파의 가능성을 가지고 있다. 따라서 골형성 기간 동안 공간을 유지하면서 신생골 재생을 위하여 골형성능이 높은 생체적합성 물질의 개발이 필요하며, 기본적으로 골전도능을 갖는 지지체(scaffold)에 골형성능을 갖는 세포 또는 골유도능을 갖는 성장인자나 천연물을 처리하여 이식하는 방법이 여러 방향으로 모색되고 있다. 골막은 골모세포 및 연골모세포로 분화할 수 있는 다능성 세포를 다량 함유하며, 따라서 골막유래의 배양된 세포는 골형성 능력을 갖는다. 그리고 식나무(靑木, Aucuba japonica) 잎으로부터 추출된 aucubin은 골모세포 활성을 높이는 약효를 갖으며, 단삼(丹蔘, Danshen, Salvia miltiorrhiza Bunge)의 수용성 성분인 salvianolic acid B 또한 혈관 신생작용, 골모세포 활성 및 신생골 형성 촉진 작용을 갖는다. 본 연구의 목적은 골형성능을 갖는 골막유래세포와 골유도능을 갖는 천연물 추출물의 골재생능 향상 정도를 평가하고, 이의 임상 적용 가능성을 확인하는 것이다. 이를 위해 골전도능을 갖는 합성골 이식재인 β-TCP (β-tricalcium phosphate)와 랫드 골막유래 세포를 랫드 두개골 결손부에 이식하고, 일반방사선, micro CT (micro computed tomography) 및 조직학적 분석을 통해 신생골의 형성 정도를 평가하였다. 그리고 골유도능을 갖는 것으로 보고된 천연물 성분인 aucubin 및 salvianolic acid B를 배양된 골모세포에 처리하여 이들의 골모세포 활성 및 세포독성, 광물질 침착 정도를 평가하였다. 그 후 실험실(in vitro) 연구 결과를 바탕으로 랫드 두개골 결손부에 콜라겐 기질과 천연물 추출물을 이식하여 골막유래세포 평가방법과 동일한 방법으로 신생골 형성 정도를 평가하였다. 그 결과 랫드 골막유래의 세포는 이식부위에서 혈관 및 신생골 형성을 촉진시키나, 그 효과는 자가골 이식에 비해 미미한 것으로 확인되었다. 천연물 성분인 aucubin은 골모세포의 alkaline phosphatase (ALP) 활성을 유의적으로 증가시키지 못하며, 따라서 골모세포 활성에 효과가 미미한 것으로 확인되었다. Salvianolic acid B는 농도 증가에 비례하여 골모세포의 ALP 활성, 칼슘 이용률 및 광물질 침착 정도를 증가시키고, 고농도에서 약간의 세포독성을 나타내었다. 그리고 salvianolic acid B를 함유하는 단삼의 수용성 추출물은 랫드 두개골 결손부에서 신생골 형성을 현저히 증가시키며, 특히 지속적인 경구섭취 시 그 효과가 커지는 것으로 확인되었다. 결론적으로 골막유래세포 및 단삼의 수용성 성분은 골이식 부위에서 골재생을 촉진시키는 효과가 있으며, 따라서 조직재생학적 측면에서 합성골 기질에 골막유래세포 및 단삼 수용성 성분의 적절한 처리가 임상 적용 상황에서도 효과적일 것으로 사료된다. 그리고 단삼 수용성 성분을 지속적으로 경구섭취하게 되면 골이식술을 받은 환자에서 골재생 효과를 극대화할 수 있을 것으로 생각된다.

Oxidant에 誘發된 腎藏 機能障碍에 對한 丹參 抽出物의 效果

김상범 東國大學校 大學院 1997 국내박사

This study was undertaken to determine whether Salviae-radix (SVR) exraction exerts beneficial effect against oxidant-induced renal cell injury. Tetraethylammonium (TEA) uptake, which is actively secreted by renal proximal tubules, by cortical slices was significantly inhibited by H_(2)O_(2). The inhibition was significantly protected by addition of 0.5% SVR extraction. The benefical effect of SVR was dose-dependent over the concentration range of 0.1-1%. H_(2)O_(2) increased LDH release which was accompanied by an increase in lipid peroxidation in renal cortical slices. These changes were prevented by SVR. The protective effect of SVR on LDH release was dose-dependent did over the concentration range of 0.1-0.5%, and that on lipid peroxidation over the concentration ranges of 0.05-2%. SVR significantly prevented Hg-induced lipid peroxidation. When H_(2)O_(2) was infused into renal artery, acute renal failure was induced: increase in urine flow, reduction of GFR, and increase in fraction Na^(+) excretion. Such changes were prevented by 0.5% SVR. SVR extractiuon (0.5%) increased cellular GSH content in normal and H_(2)O_(2)-treated tissues. When slices were treated with 100 mM H_(2)O_(2), catalase activity was decreased, which was prevented by 0.5% SVR extraction. The activity of glutathione peroxidase but not superoxide dismutase was significantly increased by 0.5% SVR extraction in H_(2)O_(2)-treated tissues. SVR decreased oxygen free radical generation in a dose-dependent manner. These results suggest that SVR has an antioxidant action and thereby exerts beneficial effect against impairment of membrane transport function and cell injury. This effect of SVR is attributed to an increase in endogenous antioxidants such as GSH, catalase and glutathion peroxidase. In addition, SVR has a direct scavenging effect.

Effect of Salviae miltiorrhizae radix on rat dopamine release in vitro : 생체외 Rat dopamine 분비에 대한 단삼의 효과

김경옥 The Graduate School of Dongguk University 2004 국내박사

1) 생체 Rat striatal Dopamine 분비에서 약물중독의 처치시 사용되는 단삼의 Amphetamine 작용 모방효과 본 연구는 작용 기전에 관한 과학적인 지지가 미흡한 한약제 중의 하나인 단삼이 endogenous Dopamine release에 미치는 효과에 관한 것으로 Dopamine의 분비와 억제에 관한 기전에 대한 탐구를 목적으로 하였다. 단삼의 물 추출물과 amphetamine의 rat의 striatal slice로부터 K^(+)-자극 dopamine 분비에 관한 효과를 비교하기 위해 endogenous dopamine을 측정할 수 있는 전기화학 검출능이 있는 high performance liquid chromatography를 사용하였다. Amphetamine과 단삼은 K^(+)-자극 상태에서 보다 두드러진 K^(+)-자극 dopamine 분비의 증가를 보였고, 단삼은 amphetamnie 단독 상태보다 K^(+)-자극 dopamine 분비에 대한 amphetamine의 효과를 더 강하게 하였다. 단삼은 amphetamine과 같은 방법으로 dopamine의 분비를 증가시킬 수 있다고 볼 수 있다. 2) Rat의 크롬친화세포종 PC12 세포에서의 도파민 분비에 관한 단삼의 효과 본 연구는 단삼의 처치가 크롬친화종 PC12 세포에서 도파민 분비를 유발시키는 것인가와 단삼의 자극으로 도파민의 분비가 동일한 신호 경로의 활성화를 통하여 유도되는지를 알아보고자 하였다. 크롬친화종 PC12 세포에서 도파민 분비를 실험하기 위해서 Protein kinase - PKC, MAP kinase 및 PCA의 역할을 조사한 바, MAP kinase와 PKC는 단삼의 유도증가시 전달매체에서 도파민의 분비를 늘리는데 관여하며, PKA 역시 단삼의 자극으로 도파민의 분비를 늘리는데 필요하다는 사실로부터 단삼이 도파민 분비 증가를 유도한다는 것을 알 수 있다. 또한 단삼의 처치에 의한 도파민 분비의 유도 기전을 알기 위해 알려진 신경적응의 유도기전에 단삼 자극으로 도파민의 분비를 증가시키는 방법을 이용하였다. 그 결과 PC12 세포에서 단삼 처치 후 도파민 분비의 유도는 PKC와 MAP kinase 의 활성화에 의존하며, cAMP 의존 신호 경로 역시 기여하며, 하부 신호 경로로의 발산을 통하여 신경적응이 일어난다는 것을 확인하였다. Saluiae miltiorrhizae radix (SMR) is herbal medicines used in the treatment of drug addiction without scientific support for their mechanism of action. The present study investigated the effect of SMR on dopaminergic neurotransmission in comparison with amphetamine. The effect of crude water extracts (0.1 g/ml) of SMR on K^(+) (20 mM)-stimulated dopamine(DA) release from rat striatal slices was compared with amphetamine (10^(-4) M) using high-performance liquid chromatography (HLPC) with electrochemical detection to measure endogenous dopamine. Amphetamine and SMR significantly increased K^(+)-stimulated dopamine release (p<0.001) from rat striatal slices when compared with K^(+)-stimulated alone. SMR potentiated the effect of amphetamine on K^(+)-stimulated dopamine release (p<0.001) when compared with amphetamine alone. The results indicate that SMR may stimulate dopamine release in the same manner as amphetamine. It remains to be determined whether the effect of this extract on dopamine function is important in its therapeutic use in the treatment of drug addiction.

단삼 메탄올 추출물의 구강 병원성 세균에 대한 항균 및 항염증작용

이정혁 삼육대학교 대학원 2021 국내석사

This research was conducted to investigate the antibacterial and anti-inflammatory effects of MeOH Ex. of Salvia miltiorrhiza againt oral pathogenic bacteria. Minimuim inhibitory concentration (MIC), radical scavenging acitivity, removal effect of biofoim produced by S. mutans, effect of gene expression of proinflammatory cytikines and effect of production of proinflammatory cytokine of MeOH Ex. of Salvia miltiorrhiza were tested. MeOH Ex. of Salvia miltiorrhiza showed moderated antibacterial activity against oral pathogenic bacteria. 55% of biofilm produced by S. mutans was removed by MeOH Ex. of Salvia miltiorrhiza. Gene expression of IL-1b and TNF-a induced by P. gingivalis were significantly reduced by MeOH Ex. of Salvia miltiorrhiza. Gene expression of IL-6 and IL-8 induced by F. nucelatum were significantly reduced by MeOH Ex. of Salvia miltiorrhiza. Production of TNF-a and IL-8 were significantly seppressed by MeOH Ex. of Salvia miltiorrhiza. Conclusively, MeOH Ex. of Salvia miltiorrhiza. showed potent antibacterial and anti-inflammatory effect against oral pathogenic bacteria. 구강 병원성 세균은 구강 질병이외 세균의 전신순환에 의한 심혈관계 질병, 호흡기계 질병, 인슐린 저항성등 구강 이외 다양한 질병과 연관되어 있다. 따라서 단삼메탄올 추출물의 구강 병원성 세균에 대한 항균 및 항염효과를 확인하였다. 그 결과 치주염 균인 P. gingivalis 에 대한 MIC는 62.5 mg/ml이었고 충치균인 S. mutans 에 의해 생성된 생물막을 약 55% 이상제거함을 확인하였다. P. gingivalis LPS로 유도한 염증성싸이토카인인 IL-1b 와 TNF-a, F. nucleatum으로 유도한 IL-6와 IL-8의 유전자 발현을 효과적으로 억제하였으며 TNF-a와 IL-8단백질 합성도 억제됨음 ELISA분석을 통해 확인하였다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 단삼메탄올 추출물은 구강 병원성 세균에 대한 유의미한 항균효과와 세균에 의해 유도된 염증반응을 효과적으로 억제하는 항염효과가 있음을 확인하였다.

丹蔘이 뇌출혈 흰쥐의 뇌부종과 iNOS 발현에 미치는 영향

송정호 경희대학교 2010 국내석사

丹蔘이 뇌조직출혈에 따른 뇌부종에 미치는 영향을 관찰하기 위해서 흰쥐의 선조체 내에 콜라겐분해효소를 주사하여 뇌조직출혈과 뇌부종을 유발한 다음 丹蔘 물추출물을 3일간 경구투여하고, 뇌부종 비율과 MPO 양성반응의 호중성백혈구 침착의 변화를 관찰하였으며, iNOS 및 TNF-α 발현의 변화를 면역조직화학염색을 통해 관찰한 바 아래와 같은 결과를 얻었다. 1. 丹蔘은 뇌조직출혈에 의한 뇌부종의 증가를 유의하게 억제하였다. 2. 丹蔘은 뇌조직출혈 주변조직에서 MPO 양성반응 호중성백혈구 침착을 유의하게 억제하였다. 3. 丹蔘은 뇌조직출혈 주변조직에서 iNOS 발현 증가를 유의하게 억제하였다. 4. 丹蔘은 뇌조직출혈 주변조직에서 TNF-α 발현 증가를 유의하게 억제하였다. 이상의 결과로 보아, 丹蔘은 호중성백혈구 침착을 억제하고, iNOS 및 TNF-α 발현을 억제하는 기전에 의해 뇌조직 염증반응을 억제하며, 이러한 염증반응 억제효능에 의해 뇌부종을 감소시키는 것으로 판단된다. This study was performed in order to evaluate the effects of Salviae miltiorrhizae radix (SMR) water extract against brain edema formation in the intracerebral hemorrhage (ICH). ICH was induced by the stereotaxic intrastriatal injection of bacterial collagenase type IV (0.23 U/μl, 0.1 μl/min) in Sprague-Dawley rats. SMR was orally given once a day (500 mg/kg) for 3 days after ICH. The percentage of brain edema and myeloperoxidase (MPO)-positive neutrophils infiltration were examined. iNOS and TNF-α expressions were observed with immunohistochemistry. The results are as follows; 1. SMR significantly reduced the percentage of brain edema of the ICH-induced rat brain. 2. SMR significantly reduced MPO positive neutrophils infiltration in the peri-hematoma regions of the ICH-induced rat brain. 3. SMR significantly reduced iNOS positive cells in the peri-hematoma regions of the ICH-induced rat brain. 4. SMR significantly reduced TNF-α positive cells in the peri-hematoma regions of the ICH-induced rat brain. These results suggest that SMR plays a protective role against the brain edema formation in the ICH through suppression of inflammatory response.

단삼의 유효성분 분석 및 HCT-116 대장암 세포 및 AGS 위암 세포에 대한 세포독성 및 세포사멸효과

강보형 가천대학교 대학원 2020 국내석사

대장암 및 위암은 전 세계적으로 가장 흔하게 진단되는 암 중 하나이다. 본 연구의 목적은 단삼(丹蔘, Salviae Miltiorrhizae Radix)의 유효성분을 분석하는 동시에 HCT-116 인간 대장암 세포 및 AGS 세포에 대한 세포 독성 효과를 확인하는 것이었다. 단삼에 포함된 5가지 유효성분(salvianic acid A, caffeic acid, rosmarinic acid, salvianolic acid B, tanshinone IIA)의 동시 분석 방법을 확립했으며, 단삼의 다양한 유효성분 중에서 tanshinone IIA가 농도 의존적인 방식으로 세포 생존력을 현저히 감소시킨다는 것을 알아냈다. Hoechst 염색을 통해 단삼과 tanshinone IIA 모두 핵 응축을 증가시켰으며, 이는 단삼 및 tanshinone IIA 모두 성공적으로 apoptosis 반응을 유도함을 시사한다. western blots을 사용하여 tanshinone IIA가 세포 사멸을 유도하고 Akt 및 Bax를 유의하게 증가시켰으며, Bcl-2를 감소시켜 이를 통해 tanshinone IIA가 Akt를 활성화시키고 따라서 apoptosis 과정에서 Bcl-2를 억제하고 bax 단백질을 증가시킨다는 것을 알아냈다. tanshinone IIA는 cleaved caspases-7, caspases-8의 발현 또한 증가시켰다. 그러므로 tanshinone IIA는 대장암 및 위암환자에게 유용한 화학 요법으로 활용될 수 있는 단삼의 주요 활성 성분임을 알아냈다. Colorectal and gastric cancer is one of the commonly diagnosed cancer worldwide. The aim of the present study was to simultaneously analyze compounds of Salviae Miltiorrhizae Radix, and determine their cytotoxic effects on HCT-116 human colorectal cancer cells and AGS cells. We established a simultaneous analysis method of five compounds (salvianic acid A, caffeic acid, rosmarinic acid, salvianolic acid B, and tanshinone IIA) contained in Salviae Miltiorrhizae Radix (SMR) and found that, among the various compounds in SMR, tanshinone ⅡA significantly decreased cell viability in a dose dependent manner. Hoechst staining also showed that both SMR and tanshinone IIA increased nuclear condensation, suggesting that SMR and tanshinone IIA successfully induced apoptosis. By using Western blots, we found that tanshinone ⅡA induced apoptotic cell death and significantly increased Akt and Bax, and decreased Bcl-2, indicating that tanshinone IIA activate the Akt and thus lead to inhibit Bcl-2 and increase Bax proteins in the course of apoptosis. tanshinone ⅡA increased the expression of cleaved caspases-7 and -8. tanshinone ⅡA is an active ingredient of SMR that may be a useful chemotherapeutic strategy in patients with colorectal and gastric cancer.