Insect Cell Cultures for Recombinant Protein Production

Park, Young-Min,Yang, Jai-Myung,Chung, In-Sik 경희대학교 유전공학연구소 1989 遺傳工學論文集 Vol.1 No.-

실험실 규모의 배양기에서 곤충세포의 배양을 수행하였다. 회분식 배양에서의 곤충세포의 성장은 serum 의 농도, 다른 영양소, 초기 접종농도, 기계적인 교반과 같은 변수에 의해 영향을 받는 것으로 나타났다. Lactate와 ammonrum은 회분식 배양에서의 말기에 관찰되는 농도에서는 세포의 성장을 저해하는 요인은 아닌 것 같았다. 아울러 유전공학적으로 재조합된 baculovirus를 곤충세포에 감염시켜 재조합 단백질의 생산을 시도하였으며 dilution rate 가 0.006hr^(-1)일 때 반응기당 최대 2800units 의 β-galactosidase가 생산되었다. Insect cell cultures were performed in laboratory-scale vessels. The batch growth of insect cells was affected by such parameters as serum content, other nutrients, seeding density, and mechanical agitation. Lactate and ammonium were not likely to be environmental factors that inhibited cell growth at the concentrations observed at the end of batch cultures. Recombinant protein production by cells infected with a genetically-modified baculovirus was also demonstrated. The maximum β-galactosidase synthesis of 2800units per reactor volume was achieved at the dilution rate of 0.006hr^(-1).

RNA polymerase Ⅱ의 구조와 전사기작

백광희 경희대학교 유전공학연구소 1991 遺傳工學論文集 Vol.3 No.-

진핵세포의 핵내에는 원핵세포의 경우와는 달리 DNA를 주형으로 RNA를 합성할 수 있는 세 종류의 효소가 존재하여 서로 다른 종류의 RNA를 만들어 낸다. RNA Polymerase Ⅱ(or B)은 mRNA의 전구물질인 hn-RNA와 U1, U2, U4, U5 snRNA의 합성을 담당하고 있는 효소이다^1 여러 종으로부터 RNA Polymerase Ⅱ가 정제되어 그 subunits의 구조가 밝혀져 있으며, 진화하는 동안에 각 종간에 매우 보존이 잘 이루어져 saccharomyces cerevisiae의 RNA Polymerase Ⅱ와 같이 10개의 subunits로 구성되어 있다. 따라서 비교적 유전학적, 생화학적으로 다루기 쉬운 효모를 이용하여 집중적으로 연구가 진행되어 현재는 10개의 subunits에 대한 모든 유전자가 클로닝되어 각 subunits의 아미노산의 서열이 알려져 있다.^2-7. 가장 큰 세 개의 RNA Polymerase Ⅱ subunits인 RPB1. RPB2, RPB3는 procaryotic RNA Polymerase인 β', β, a subunit에 각각 해당하는 것으로 mRNA합성에 필수적인 요소이다^2^4^8^9 이들보다 작은 subunit중에 RPB5, RPB6, RPB8는 핵내의 세 RNA Polymerase가 공유하고 있다.^5

하천에서 분리한 비소 내성세균의 유전적 특성

정미경,이호자 경희대학교 유전공학연구소 1991 遺傳工學論文集 Vol.3 No.-

Arsenite, arsenate에 대해 내성을 가지는 균들을 분리하여 D-3, D-12, D-14로 명명하였고 생리생화학적 검사를 통해 각각 Serratia Iiquefaciens, Klebsiella oxytoca, Klebsiella Pneumonrae로 동정되었다. 내성기작에 관여하는 유전자의 위치 및 분리된 플라스미드의 전이능을 조사한 결과 내성유전자는 플라스미드에 존재하며 내성기작은 전적으로 플라스미드에 의해 조절됨을 알 수 있었고, 또한 conjugative 플라스미드임이 확인되었다. 이에 Klebsiella oxytoca D-12에 존재하는 67 kilobase의 conjugative 플라스미드를 pMH12로 명명하였다. Mitomycin C처리에의해 arsenite 감수성 균주를 선발한 결과 pMH12가 없음이 확인되었다. 분리균주들의 유전적 특성을 규명하기위한 실험에 사용될 marker를 찾아내기 위하여 몇가지 항생물질과 중금속에 대한 내성을 조사하였는데, 특히 D-12의 경우 고농도의 Cd^(2+), Zn^(2+), Hg^(2+)에 대해 내성을 나타내었다. Several arsenic compound-resistant bacteria were isolated from Jung-Rang stream. The isolates, D-3, D-12, and D-14 were characterized phenotypically and genetically, and identified as Serratia liquefaciens, Klebsiella oxytoca, and Klebsiella pneumoniae, respectively. A plasmid of 67 kb was found in Klebsiellu oxytoca D-12 and designated as pMH12. Transfer of this plasmid from D-12 to E. coli HB101 was occurred, and the resulting transconjugant strains expressed the same level of heavy metal resistance as the donor strain. The physical presence of this plasmid in transconjugant was detected with agarose gel electrophoresis. Arsenite-sensitive derivatives of isolate D-12 were obtained with Mitomycin C treatment which cured pMH12. Antibiotics and heavy metal resistances were also examined to be used as a proper marker for the isolates in gene cloning. Isolate D-12 has resistance to several heavy metal ions such as Cd^(2+), Zn^(2+), and Hg^(2+). Also, all the other arsenite resistant isolates showed resistance to several heavy metal ions and antibiotics.

배양된 쥐 인슐린종 세포에서 성장인자들에 대한 인슐린 유전자의 발현

김성운,양인명,김진우,김영설,김광원,최영길 경희대학교 유전공학연구소 1989 遺傳工學論文集 Vol.1 No.-

인슐린 유전자 발현의 실험실적 모델로서 쥐 인슐린종 세포(RINm5F cell;rat insulinorraceil)를 이용하여 몇 개의 성장인자에 대한 반응을 조사하고 인슐린 유전자의 활성에 관여하는 상황을 이해하고자 인슐린 유전자의 mRNA를 조사하였다. RINm5F 세포는 glucose 와 EGF 등의 성장인자에 대해 세포분화 및 성장에 자극을 받으며 인슐린, IGF-Ⅰ IGF-Ⅱ등에는 영향을 받지 않았다. 따라서 RINm5F TPVHSMS 생체내 췌도 베타세포의 기능을 대변하기는 어려웠으나 각종 성장인자의 세포내 활성양상을 간접적으로 알 수 있었다. Insulin secretion of RINm5F cells can be stimulated by some of the growth factors, however, not in the same manner compared to pancreatic islet beta cells. We observed that insulin superfamily (insulin IGF-Ⅰ, IGF-Ⅱ) were not affected to insulin mRNA of RINm5F cells, but EGF (50ng/㎖) increased insulin mRNA levels, and dexamethasone (300ng/㎖) decreased insulin mRNA levels in RIAm5F cells. So some of growth factors regulated insulin gene at transcription level in RINm5F cells line.

Craves병 환자에서 백혈구와 갑상선 조직의 HLA-DR β 유전자 부위의 비교

양인명,우정택,팽정령,서광식,김성운,김영설,김광원,최영길 경희대학교 유전공학연구소 1989 遺傳工學論文集 Vol.1 No.-

정상 갑상선세포에서는 HLA-DR 항원이 발현되지 않았으나, 그레이브스병 환자의 갑상선세포 표면에는 HLA-DR 항원이 발현됨이 보고되어, 이러한 현상은 이 질환의 자가면역 기전에 중요한 역할을 하고 있을 것으로 생각되고 있다. 한편 최근 DR이나 DQ 유전자의 상부 159kb 이내에는 이들의 발현을 조절하는 유전자가 존재함이 알려져 있고, 이 부위의 구조적인 변화로 인하여 DR DQ 유전자의 발현을 유도하는 여러 가지 핵내 인자들과 interferon-r 와 같은 외부인 자들이 보고되고 있다. 그러나 그레이브스병에서 이들 유전자 부위의 구조적인 변화에 관해서는 아직 보고가 없다. 이에 본 연구자 등은 이러한 가능성 여부를 규명하고자 2명의 전형적인 그레이브스병 환자의 수술 우 얻어낸 갑상선 조직에서 RNA를 분리한 우 DR β유전자를 소식자로 northem blotting을 하여 mRNA의 발현을 관찰하였으며, 말초혈액 백혈구와 갑상선 조직으로부터 분리된 DNA를 EcoRI BamHI. HindⅢ PvuⅡ TaqI, PstI등의 6가지 제한효소로 소화한 후 DR β유전자를 소식자로 하여 RFLP 양상을 비교한 결과, 환자 모두에서 mRNA의 발현이 관찰되었으나, 환자 모두에서 6가지 제한효소에 의한 RFLP 양상이 동일하였다. 이러한 결과는 Graves병 환자의 DR 유전자의 발현에 있어서 이 유전자 부위의 구조적인 변화가 관여할 가능성이 적음을 시사하는 사실이라고 사료되나 향후 더 많은 예와 더 많은 제한효소를 이용한 주시가 필요할 것이다. The requirement for major histocompatibility antigen class Ⅱ molecules in the recognition of antigen by helper T cells suggests that the expression of class Ⅱ antigen may be important in the initiation and prolongation of immunopathology. HLA class Ⅱ antigenes are expressed on the surface of thyrocytes of the patients with graves disease. The increased expression of class Ⅱgene can be induced by trans acting factor such as interferon However the possibility of rearrangement of their regulatory genes has not been explored so far. We studied the mRNA expression in the thyrocytes of 2 patients with Graves' disease and compared the restriction fragment length polymorphism (RFLP) between thyroid and peripheral leukocyte DNA. The prominent expression of mRNA was observed in the thyroid tissues of all the two patients. But we did not find any difference in RFLP pattern in both patients. These results suggest the possibility that the rearrangement of the regulatory gene located in the upstream of DR- β gene can be a role in expression of DR antigen is less likely.

Construction of a New Transfer Vector for Baculovirus Carrying E. coli Galactokinase Gene

Choi, Yong-Joo,Chung, In-Sik,Yang, Jai-Myung 경희대학교 유전공학연구소 1989 遺傳工學論文集 Vol.1 No.-

Autographa californica californica nuclear polyhedrosis virus의 다각체 유전자 지역에 대장균이 galactokinase 유전자를 가지고 있는 새로운 이동벡터가 만들어졌다. Plasmid pAcI은 AcNPV의 EcoRI-I 단편을 pUC18의 EcoRI 자리에 크로닝한 후 두 개의 BamHI 자리를 제거하여 만들어졌다. 대장균의 glaK 유전자를 가지고 있는 Plasmid pKO100는 제한효소로 절단된 후 1% agarose gel에서 분리 되었고 gaIK 유전자를 포함하고 있던 DNA 단편이 gel 조작으로부터 전기적으로 회수되었다. pAcGKI은 gaIK 유전자를 포함하고 있는 DNA 단편을 pAcI의 polyhednn promoter 지역에 크로닝함으로써 만들어졌다. galk 유전자는 polyhednn promoter의 조절기작을 밝히기 위한 보고 유전자로써 유용할 것이다. A new transfer vector with E. coli galactokinase gene (galK) inserted within Autographa californica, nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) polyhedrin coding region has been constructed. Plasmid pAcI was generated by cloning EcoRI-I fragment of AcNPV into the EcoRI site of pUC18 and deleting two BamHI sites. Plasmid pKOl00 carrying E. coli galK gene was cut with restriction endonuclease, separated on 1% agarose gel, and DNA fragment containing galK gene was electroeluted from the gel piece. pAcGK1 was constructed by inserting DNA fragment containing galK gene into the polyhedrin coding region of pAcI. The galK gene would be useful as a reporter for the elucidation of the regulation mechanism of polyhedrin promoter.

Alteration of the Nucleotide Sequence Preceding the Translation Initiation Codon and the Effects on the Expression of Human Prethrombin 2 in E. coli

Kim, Yong-Joo,Lee, Seung-Cheol,Kim, Jae-Man,Kim, Jong-Myoung,Choi, Eun-Hwa,Kim, Ji-Young 경희대학교 유전공학연구소 1989 遺傳工學論文集 Vol.1 No.-

전에 발표된 논문에서 사람 프리트룸빈 2를 높은 수준으로 생산하는 재조합 플라스미스 pASPT2 제소에 관해 보고한 바 있다(Chot et al., 1989). pASPT2에서 사람 프리트롬빈 2 유전자는 박테리오파지 λP_(L) 프로모터에 의해 발현이 조절되는데 세포내에서 전체 박테리아 단백질의 10% 정도까지 그 유전자산물이 생성된다. 본 연구에서는 pASPT2 cⅡ SD sequence 윗쪽에 있는 대부분의 5'untranslated sequence 가 제거된 pPLc-PT2는 pASPT2와 같은 수준의 사람 프리트롬빈 2를 생산하였다. 반면에 trp과 lac 프로모터로부터 유래된 tac 프로모터를 이용한 재조합 플라스미드들은 낮은 양의 프리트롬빈 2를 생산하는 것이 관찰되었다. SD sequence와 번역개시코돈 ATG 사이가 각각 6, 8, 10, 12는 뉴클리오티드가 떨어져 있고 뉴클리오티드 서열이 다른 tac 프로모타 융합플라스미드들을 제조하였다. SD sequence와 번역개시코돈 ATG 사이의 길이와 뉴크리오티드 서열의 변화는 각기 다른 플라스미드들에 의한 사람 프리트롬빈 2 발현 수준에 있어서 몇배의 차이를 야기시켰다. SD sequence가 번역개시코돈 ATG로부터 8 뉴클리오티드가 떨어진 ptacN_(8)PT2가 이들 플라스미드들 중에서 가장 높은 발현 수준을 나타내었는데, 그러나 pASPT2의 발현수준과 비교해 보면 몇 배가 낮은 수준이었다. 이 실험결과는 번역 조절이 각기 다른 플라스미드들이 의해 유전자 발현수준이 다르게 나타나는데 중요한 역할을 하고 있음을 보여주고 있다. In the previous report we have described the construction of the expression plasmid pASPT2 which produced high-level of human prethrombin 2 under the control of the thermoinducible bacteriophage λP_(L) promoter in E. coli, amounting to about 10% of the total bacterial proteins in the cells (Choi et al., 1989). _(p)PLc-PT2 was constructed in which the DNA region from -415 to -54 from the translation initiation codon ATG in _(p)A-SPT2 was substituted by seven nucleotides, AATTGGC. The recombinant plasmid produced the high-level of human prethrombin 2 comparable to _(p)ASPT2. In contrast to the high-level expression by _(p)ASPT2 and _(p)PLc-PT2 plasmids, we have observed reduced amounts of production by the recombinant plasmid utilizing the tac promoter derived from trp and lac promoters. A eries of tac promoter fusion plasmids were constructed in which the Shine-Dalgarno (SD) sequence were separated from the initiation codon ATG by 6, 8, 10, and 12 nucleotides with different nucleotide sequences. Variations of the distance and the nucleotide sequence between the SD sequence and the ATG codon leads to differences in the expression levels of human prethrombin 2 by the different plasmids. (ptac)_N_(8)-PT2 in which the SD sequence was separated from the ATG codon by 8 nucleotides was the highest producer among them, but produced less amount of the product than _(p)ASPT2 by at least several folds. Our results suggest that translational control plays an important role in the variations in the expression levels by the different plasmids.

당뇨병 백서의 간세포에서 Glucokinase 활성도 및 유전자 발현에 대한 인슐린의 영향

강성이,팽정령,서광식,안규정,우정택,김성운,양인명,김진우,김영설,김광원,최영길 경희대학교 유전공학연구소 1993 遺傳工學論文集 Vol.5 No.-

목적 당대사의 조절 상태에 따른 생체 변화를 분자 수준에서 이해하고자 식이 조건을 달리한 정상 백서와 화학적으로 유도된 당뇨병 백서의 간조직에서 혈당수준과 인슐린치료 정도에 따라 나타나는 글루코키나제 활성도 및 유전자 발현을 분석하였다. 방법 스트렙토조토신 정맥투여 후 당뇨병의 유발을 확인하고, 인슐린을 1일 3회 3일간 복강내로 투여하여 상태를 안정시킨 후, 인슐린 투여군은 인슐린 투여 6시간이내에 그리고 인슐린 비투여군은 24시간 후 단두하여 채혈하고 복강을 열어 간조직을 채취하였다. 채취한 간조직에서 글루코키나제 활성도는 인산화된 포도당에서 NADH의 형성을 형광분광계로 측정하였으며, 글루코키나제 유전자 mRNA발현은 Northern 분석법을 이용하였다. 성적 정상 백서에서 공복상태와 식이를 섭취한 경우에 간조직의 글루코키나제 효소의 활성은 차이가 없었으나, 글루코키나제 유전자 mRNA 발현은 증가되었다. 당뇨병이 유발된 백서의 간조직에서 글루코키나제 효소의 활성 및 글루코키나제 유전자의 mRNA 발현은 정상 백서에 비하여 낮았다. 인슐린 투쳐 후 글루코키나제 효소의 활성 및 글루코키나제 유전자의 mRNA 발현이 증가되었고, 특히 혈당이 정상화된 경우에서 글루코키나제 유전자의 mRNA 발현이 증가도었다. 결론 인슐린에 의한 간조직에서 글루코키나제 효소의 활성 및 글루코키나제 유전자의 mRNA을 증가를 볼수 있었다. 당뇨병 백서에서 인슐린 투여 후에 혈당조절이 안된 경우 간조직의 글루코키나제 유전자의 mRNA 발현이 증가가 없는 것으로 보아 글루코키나제 mRNA의 발현에는 인슐린 이외의 다른 요소가 관여할 것으로 생각된다. The liver-specific hexokinase isoenzyme, referred to as glucokinase, is thought to play a key reglulatory role in hepatic glucose metabolism. The glucokinase gene is, therefore, of interest both because of its tissue-specific expression and because of the several regulatory processes that can be analyzed. The level of hepatic glucokinase activity appears to be determined essentially by regulation of the rate of enzyme synthesis, with insulin playing a leading role as an inducer. We investigated the role of insulin for the induction of glucokinase in the liver of diabetic rats. Experimental diabetes was induced by injection of streptozotocin 7 days before the experiment. Regular insulin was given by three days intraperitoneal injection at 8-h interval. The glucokinase mRNA in the liver was estimated by Nothern blot assay, as well as by fluorometric enzyme activity assay. Glucokinase activity was not reduced in the liver of normal fasting rats as compared to normal fed rats. And glucokinase activity was reduced in the liver of diabetic rats as compared to normal rats. In diabetic rats treated with insulin, glucokinase enzyme activity were increased. But glucokinase mRNA expression was only increased in normoglycemic diabetic rat with treated with insulin as compared to hyperglycemic rat. These data indicate that insulin stimulates hepatic glucokinase enzyme activity and mRNA expression. But other hormonal or metabolic factors may be contribute to regulation of glucokinase mRNA expression.

韓國 在來種 大豆의 Isozyme 變異

權臣漢,朴京淑 경희대학교 유전공학연구소 1993 遺傳工學論文集 Vol.5 No.-

慶熙大學校 農學科 韓國 大豆遣傳資源室에 保存中인 韓半島 中部 以南 地域에서 15年에 걸쳐 蒐集한 在來種 大豆를 供試하여 Trpsin inhibitor, Lectin, Lipoxygenase, Beta-amylase isozyme變異를 中國, 日本 및 Rusia種과 比較하여 韓國 在來種의 特徵을 分析하였다. Ti c/c(1%), ti/ti(2%) 因子는 韓國의 在來種에서만 극히 소수가 發見되었으며, Ti a과 Ti c의 Hetero型 Ti a/c型이 野生種에서 4系統이 發見된 것으로 보아 栽培種에서 誘起된 變異 Ti c 因子가 野生種에 傳播되었으며, ti 因子는 Ti c 調子보다 늦게 出現하여 아직 野生種에 轉移되치 못한 것으로 推定된다. Lectin 生成因子 Le는 韓國, 中國, 日本, Russia 등 4個國 栽培種에서 거의 100% 出現하며 lectin 缺乏 le 因子의 出現頻度는 지극히 낮다. 反面에 野生種에서는 le 因子가 50% 以上의 頻度를 나타내는 것으로 보아 栽培種에서는 强한 selection pressure가 加해고 Le 遺傳子는 有益한 農耕形質과 깊은 關聯이 있는 것으로 推定된다. 大豆의 不快臭의 原因이 되는 lipoxygenase 缺乏因子(lx)를 가진 系統을 screen하였는데 慶南 固城에서 蒐集한 KAS612-3(lx₁/lx₁)과 慶南 固城에서 蒐集한 KAS621-8(lx₁/lx₁) 등 2系統이 發見되었다. Lipoxygenase 缺乏因子는 中國이나 Russia栽培種에서는 아직 報告된 바 없으며 우리 나라 野生種에서도 發見되지 않았다. 이들 lx₁/lx₁型 系統이 慶南의 制限된 地域에서만 發見된 것으로 미루어 lx, 突然變異는 慶南地域의 栽培種에서 最近에 誘起된 것으로 推定된다. β-amy1ase3 2-2 allele의 出現頻度는 韓國 在來種에서 20%인데 반하여 中國과 日本 栽培種에서는 5%정도이고 野生種에서도 韓國系統이 32.7%인데 반하여 中國種은 13.1%로 韓國 在來의 栽培種은 中國種과는 獨立的으로 韓國 野生種과 密接한 關係가 있는 것으로 推定된다. The soybean materials were provided by Soybean Genetic Resource Laboratory. Department of Agronomy, Kyung-Hee University and partly by USDA-ARS, Soybean Laboratory, University of Illinois, Urbana, Illinois, USA. The main purpose of this investigation is evaluation of Korean native soybean land races compared with Chinese, Japanese, and Russian origins. Ti c/c and ti/ti genotypes were observed only in the Korean native soybean population at an extremely low rate. Four lines of hetrozygous genotype, Ti a/c, were found only in the Korean wild soybean population, which indicates that Ti c and ti gene were originated in Korean peninsula. A high frequency of the seed lectin lacking genotype was observed in the wild soybean, whereas most of cultivars collected from Korea, Japan, and China contained high levels of seed lectin. These results imply that old farmers of Korea, Japan, and China put a high selection pressure on seed lectin, and a genetical linkage between seed lectin and some important agronomic characters is presumptive. Among the 1,874 Korean native soybean lines screened, only two lipoxygenase-1 lacking lines(KAS 610-3 and KAS621-8) were selected and both selected lines were collected in Kyungnam Province. Lipoxygenase lacking genotypes were not reported in wild soybean(G. soja) and Chinese and Russian local varieties. These results imply that mutant genotype(lx_(1)/lx_(l)) was induced recently in the cultivar grown in Kyungnam Province. Significantly high frequency of β-amylase3 2-2 was observed in the Korean native cultivar and wild soybean populations as compare to the Japanese and Chinese origins. These results implicate that Korean native land races are unique and have close genetical association with wild soybean.

Cloning of Full-length cDNA Coding for Human Prothrombin and Its Expression in Monkey COS Cells

Kim, Jong-Myoung,Kim, Yong Joo,Choi, Eun-Hwa,Kim, Jae-Man,kim, Jiyoung 경희대학교 유전공학연구소 1990 遺傳工學論文集 Vol.2 No.-

프로트롬민 cDNA 클론이 많이 함유된 partial cDNA clone들로부터 프로트롬빈 신호서열 및 N-말단 부위를 코딩하는 cDNA를 분리하였다. poly(A)+RNA는 사람 간 조직에서 분리하여 sucrose gradient centrifugation에 의해 분획하였다. 1,500에서 4,000 뉴클리오티드 사이의 mRNA를 모아 역전사에 의한 cDNA 합성에 이용하였다. 프라이머로는 프로트롬빈 mRNA에 상보서열을 가지는 올리고뉴클리오티드를 사용하였다. 약 2,000개의 콜로니 중에 8개가 N-말단쪽에 해당하는 올리고뉴클리오티드 프로브와 반응하였다. 이 중 여섯 개의 플라스미드가 예상한 길이의 프로트롬빈 cDNA insert를 함유하고 있었다. 제한효소 및 염기서열 분석 결과 phI13 플라스미드는 프로트롬빈 N-말단쪽 312개 아미노산과 43개의 신호서열을 코딩하는 부위 및 12 뉴클리오티드의 5'-untranslated sequence를 포함하고 있음을 보여주었다. 이 5'-쪽 cDNA와 pHPT2(Chot et al., 1989)의 cDNA를 연결하여 신호서열 및 579 아미노산을 코딩하는 전체 cDNA를 클로닝하였다. 프로트롬빈 cDNA를 SV 40 바이러스 후기 프로모터 아래에 연결하여 포유배양세포발현 플라스미드를 제조하였다. 이 플라스미드를 원숭이 COS 세포에 넣었을 때 프로트롬빈이 발현되었으며 발현된 프로트롬빈은 세포의 배양액에서 발견되었다. cDNA fragments coding for the leader sequence and N-terminal region of human prothrombin was isolated from partial cDNA clones that were enriched for prothrombin cDNA clones. Poly (A)+RNA was isolated from human liver and size-fractionated by sucrose gradient centifugation. Poly(A)+RNAs in the ranges of 1500 to 4000 nucleotides ere pooled and utilized for cDNA synthesis by reverse transcription using a specific o1igodeoxynucleotide as a primer. Among about 2000 colonies, eight positive cDNA clones are obtained by bridization with (32)^P-labeled oligodeoxynucleotide complementary to 5'-terminal region of prothrombin mRNA sequences. Six of the recombinant plasmids contained prothrombin cDNA inserts of expected size. Restriction and sequencing analysis showed that the cDNA insert of phII3 plasmid contained 12 nucleotides of 5'-untranslated region and the DNA sequences conding for the leader and N-terminal 312 residues of human prothrombin. The complete cDNA sequence coding for the leader and 379 amino acid residues of human prothrombin was cloned in pLC18 by combining the two overlapping cDNA inserts of phII3 and pHPT2 (Chor et al., 1989) The full-length prothromibin cDNA was inserted into the multicloning sites don nstream from the SV40 late promoter of pSLS plasmid. Upon transfection with the recombinant plasmid, human prothrombin was expressed in SV40-transformed African green monkey kidney(COS) cells, and was exclusively found in the growth medium.