감염질환에 의한 변사자의 장기조직에서 결핵균의 검출에 관한 연구

이한영,엄용빈,최철호,김영주,권태정 內務部 國立科學搜査硏究所 2001 國立 科學 搜査 硏究所 年報 Vol.33 No.-

국내에서 채집한 진드기에서 중합효소연쇄반응을 이용한 라임병균 및 Ehrlichiosis 원인체의 검출

김종배,엄용빈,박성언,박상욱,김영미,송혜원,안준환 THE KOREAN SOCIETY FOR BIOMEDICAL LABORATORY SCIEN 1998 Journal of biomedical laboratory sciences Vol.4 No.2

국내에서 채집한 진드기의 라임병 및 ehrlichiosis원인체 보균 상태를 조사하기 위하여 총 516마리 (Ixodes spp. 22마리, Haemaphysalis spp. 494마리)의 ixodid 진드기를 봄과 가을에 걸쳐 강원도 고산지대 일원에서 채집하였다. 수집한 진드기에서 DNA를 추출 ·정제한 후 추출한 DNA를 template로 이용하여 , Borrelia burgdorferi sensu lato 및 Ehrlichia spp.에 특이하게 반응하도록 제작한 primer를 이용한 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 실시하였으며, 이 결과를 oligonucleotide probe를 사용한 southern blotting을 통하여 다시 확인하였다. 총 516마리의 진드기중 B.garinii sensu lato DNA 양성 인 진드기는 68(13.2%)마리 (B. burgdorferi sensu stricto,2; B. afzelii,1; B. garinii,33; B.tanukii,8; B.turdae, 4)로 나타났으며 이 중 37 (7.2%)마리의 진드기 는 southern blot analysis에서도 양성으로 확인되었다. 또한 101 (19.2%)마리의 진드기가 Ehrlichia spp.에 대한 PCR에서 양성 이었으나, 이들 중 25 (4.8%)마리 만이 southern blot analysis에서 양성으로 확인되었다. 그러나 사람의 병인체로 추정 되는 human granulocytic ehrlichiosis (HGE) agent DNA를 보균한 진드기는 확인되지 않았다. 한편 라임병균과 ehrlichiosis원인체를 동시에 보균한 것으로 밝혀진 진드기가 3마리에서 (0.6%)확인되어,국내에서도 진드기 교상시 이들 두 가지 열성질환이 동시에 감염될 가능성이 있는 것으로 사료됨으로 진드기 매개성 열성질환에 대한 적절한 진단법 등을 보다 체계적으로 연구하여야 할 것으로 판단된다. To investigate the distribution of Borrelia Burgdorferi and human granulocytic ehrlichiosis(HGE) agent in ticks, adult ixodid ticks of Ixodes spp. and Haemaphysalis spp. were collected from the high mountain areas of Kangwon Province. Using DNAs extracted and purified in the collected ticks, polymerase chain reaction (PCR) was performed to amplify the specific nucleotide sequences of both agents. Of the 516 ticks, a total of 68 (13.2%) ticks was positive for Borrelia burgdorferi sensu lato with PCR analysis (2 for B. burgdorferi sensu stricto; 1 for B. afzelii; 33 for B. garinii; 8 for B.tanukii; 4 for B. turdae). However a little more than half of PCR-positive ticks (37/68) was found to be positive in the southern blot analysis with Bl6S oligonucleotide probe. One hundred and one (19.2%) ticks were positive for Ehrlichia spp. in PCR, and a quarter of them (25/101) was positive in southern blot with E16S oligonucleotide probe. But none of them was found to be the DNA of HGE agent. And 0.6% (3/516) ticks were positive for both of B. burgdorferi sensu lato and Ehrlichia spp. These findings might implicate the possibility of the outbreak of lyme borreliosis and ehrlichiosis in Korea, and more extensive studies may be need for the diagnosis of multiple tick-borne diseases.

Multiplex PCR을 이용한 장출혈성 대장균 0157:H7의 검출

김종배,엄용빈 THE KOREAN SOCIETY FOR BIOMEDICAL LABORATORY SCIEN 1998 Journal of biomedical laboratory sciences Vol.4 No.1

최근 전세계적으로 문제가 되고 있는 장출혈성 대장균 0157:H7을 분리배양 및 동정없이 바로 시료를 분석하여 신속하게 검출하기 위한 다중 중합효소 연쇄반응 (multiplex PCR) 기법을 확립하고, 이 기법을 이용하여 국내 분리 균주 중에서 SLT-I·Ⅱ, eaeA, 60-MDa plasmid gene을 가지고 있는 대장균을 유전자 수준에서 검출하고자 하였다. 장출혈성 대장균 0157:H7이 가진 SLT-I·Ⅱ, eaeA, 60-MDa plasmid 유전자들에 대한 특이 oligonucleotide primers (MK1'-MK2', NAE19-NAE20, MFS1F-MFS1R)를 함께 동시에 반응 완충액에 넣어 다중 중합효소 연쇄반응을 시행한 결과 317bp (eaeA), 228bp (SLT-I·Ⅱ), 167bp (60-MDa plasmid)의 PCR 증폭 DNA 생성물을 표준균주 (E. coli ATCC 35150)에서는 확인할 수 있었지만, 기타 다른 병원성 장내세균 13균주에서는 band를 확인할 수 없었다. 한편 다중 중합효소 연쇄반응의 template DNA 추출 방법에 따른 PCR 결과를 비교하였다. 각각의 DNA 추출 방법 중 boiling lysis 방법이 신속하고 간편하여 장출혈성 대장균 0157:H7에 의한 식중독의 임상진단에 다중 중합효소 연쇄반응 (multiplex PCR) 적용하는 데에는 boiling lysis법을 이용하는 것이 가장 적합한 방법으로 확인되었다. A multiplex PCR method was designed by employing primers specific for the eaeA gene, conserved sequences of Shiga-like toxins (SLT-I·Ⅱ), and the 60-MDa plasmid of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) 0157:H7 strain. A set of six synthetic oligonucleotide primers derived from sequences of the SLT-I·Ⅱ, eaeA, and 60-MDa plasmid genes of E. coli 0157:H7 were used in a multiplex PCR amplification procedure to detect these genes in the same enteric pathogens. In two enterohemorrhagic E. coli 0157:H7 (ATCC 35150, ATCC 43894) reference strains, PCR products of 317bps (eaeA), 228bps (SLT-I·Ⅱ) and 167bps (60-MDa plasmid) were successfully amplified simultaneously in a single reaction. However, the specific PCR products were not amplified in control strains of other enteric bacteria. The sensitivity of the multiplex PCR assay for detection of the SLT-I·Ⅱ, eaeA, and 60-MDa plasmid genes of E. coli 0157:H7 was found to be 2.5×10 of bacteria in diarrheal stool to amplify all three bands. The multiplex PCR technology will allow large-scale screening of many clinical specimens or contaminated foods, and will be a very useful method for the detection of a wide range of microorganisms present in the environment, including EHEC 0157:H7 in various types of specimens. The multiplex PCR assay has the potential to be used as a specific and rapid method for clinical diagnosis of disease caused by EHEC 0157:H7.

다중 중합효소 연쇄반응을 이용한 반코마이신 내성 장구균의 신속 검출

박성언,박수진,엄용빈,김종배,송혜원,박상욱,김양수,김근희 THE KOREAN SOCIETY FOR BIOMEDICAL LABORATORY SCIEN 1999 Journal of biomedical laboratory sciences Vol.5 No.1

일반적으로 임상검사실에서 vancomycin resistant enterococci(VRE)를 검출하는 일은 어렵고, 시간이 많이 들며, 검체처리 비용도 많이 든다. 따라서 본 실험은 임상검체에서 분리된 세균으로부터 VRE를 신속하게 확인하고, 진단하기 위한 방법으로서 다중 중합효소 연쇄반응을 확립하였다. 본 실험에 사용된 primer는 장구균에 특이한 유전자인 vanA, vanB, vanC-1, vanC-2/3각각의 염기서열을 기초로 primer를 제작하고, 다중 중합효소 연쇄반응을 실시하여 임상검체로부터 분리된 VRE 유전자의 type 및 분포율을 조사하고자 하였다. 국내에서 분리된 75주의 장구균을 대상으로 다중 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과 36주의 분리균주에서 vancomycin에 대해 높은 저항성을 보이는 vanA 유전자를 가진 것으로 나타났다. 그리고 18주에서는 vancomycin에 낮은 저항성을 내성을 보이는 vanC-1또는 vanC-2/3유전자를 보유한 것으로 나타났다. 따라서 본 실험에서 확립한 다중 중합효소 연쇄반응 기법은 신속한 VRE 진단 방법으로 이용할 수 있을 것이다. It is generally difficult, time-consuming, and expensive for the clinical laboratory to detect vancomycin resistant enterococci (VRE). The aim of this study was to develop and evaluate the multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay system as a diagnostic tool for the rapid detection of VRE from clinical samples and/or for the identification of VRE from the bacterial strains isolated from clinical specimens. Specific primers, designed from the nucleotide sequences respectively encoding the vanA, vanB, vanC-1, vanC-2/3 genes in enterococci, were coupled in a multiplex PCR assay system. With this multiplex PCR assay system, we investigated the incidence rates and types of VRE isolated from clinical samples. A total of 75 strains of enterococci were isolated in 3 general hospitals in Korea. Of these isolates, 36 strains showed a pattern of highlevel vancomycin resistance which associated with vanA gene, whereas 18 strains showed lowlevel vancomycin resistance associated with vanC-1 or vanC-2/3 gene. Thus, multiplex PCR assay method established in this study could be applied for the rapid detection of VRE.

G+C 함량이 높은 Primer를 사용하는 중합효소 연쇄반응에서 변성제가 미치는 영향

김영미,안준환,김종배,엄용빈 THE KOREAN SOCIETY FOR BIOMEDICAL LABORATORY SCIEN 1996 Journal of biomedical laboratory sciences Vol.2 No.2

G+C 함량이 높은 primer를 이용한 중합효소 연쇄반응을 실시하는 경우 높은 annealing 온도로 인하여 특이 염기서열의 합성정도가 매우 미약하게 나타나는 경우가 많이 있다. 이와 같은 문제점을 보완하기 위하여 glycerol, formamide 및 dimethyl sulfoxide (DMSO) 등의 변성제를 반응용 완충액에 첨가하고 중합효소 연쇄반응을 실시하여 그 결과를 비교 검토하였다. G+C 함량이 낮은 Borrelia burgdorferi의 Ly1 유전자의 primer set인 Bb 679와 Bb 680를 이용한 중합효소 연쇄반응에서는 변성제 첨가에 따른 합성 DNA의 양의 변화가 뚜렷하지 않았다. 그러나 G+C 함량이 높은 primer set인 Mycobacterium paratuberculosis의 IS900 유전자의 IS900/150C와 IS900/921를 이용한 중합효소 연쇄반응을 유도한 경우에는 변성제를 첨가함에 따라 합성된 DNA의 양의 증가가 뚜렷하였으며, 2.5% glycerol과 1.25% formamide를 혼합 첨가한 경우와 또는 2.5% DMSO를 반응용 완충액에 첨가하였을 때 비특이적인 증폭비율이 낮아 특이 염기서열의 합성 결과가 양호한 것으로 나타났다. Poor yields of amplified DNAs could be resulted in polymerase chain reaction(PCR) processes with G+C-rich DNA primers because of their high Tm values. To maximize the yields of amplification in PCR processes with G+C-rich primers, we compared the yields of amplified DNA fragments according to the concentrations of specific denaturants added to the reaction mixture of PCR system. With addition of the mixture of 2.5% glycerol and 1.25% formamide, or 2.5% dimethyl sulfoxide to the reaction cocktail, respectively, remarkable increases in the yields of amplified DNA fragments were not observed in the PCR systems with G+C-low primers of Lyl chromosomal gene from Borrelia burgdorferi but observed in the PCR system with G+C­rich primers of IS900 gene from Mycobacterium paratuberculosis. Although we were not practically able to discriminate the yields of PCR DNAs according to the concentrations used in this study, addition of the mixture of 5% glycerol and 2.5% formamide, or 5% DMSO tended to increase the production of extra bands.

PCR-Restricition Fragment Length Polymorphism 방법에 의한 Borrelia burgdorferi Sensu Lato의 분류

송혜원,김홍,박상욱,엄용빈,김종배,박성언,김근희 THE KOREAN SOCIETY FOR BIOMEDICAL LABORATORY SCINE 1999 Journal of biomedical laboratory sciences Vol.5 No.2

라임병의 원인균인 Borrelia burgdorferi에 대하여 각 균종의 표준균주와 진드기에서 추출한 DNA를 template로 PCR을 실시한 후 그 증폭산물을 Alu I으로 처리한 restriction fragment length polymorphism (RFLP) 방법으로 각 균종의 연관성을 조사하고자 하였다. 표준균주로 RFLP를 실시한 결과 B. burgdorferi sensu stricto와 B. garinii의 RFLP 형태 (50 bp, 70 bp, 150 bp)가 유사하였으며 B.afzelii에서는 다른 RFLP형태 (50bp, 110bp, 150 bp)를 관찰하였다. 그 중 B. afzelii KK-1과 B. garinii HP1은 새로운 RFLP 형태를 보여 B. afzelii와 B. garinii는 각각 2 types의 subgroup으로 분류할 수 있었다. 진드기 DNA에서 는 B. afzelii를 포함한 각 균종에 대하여 모두 유사한 RFLP 형태를 보였는데, 진드기 DNA에서 확인된 B. afzelii는 KK-1과 같은 군에 속하는 것으로 사료되었다. For the classification of B. burgdorferi sensu lato strains, PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis was performed. PCR was carried out with B. burgdorferi sensu lato specific primer set (BB uni set), and amplicons of 470-bp DNA were digested with Alu I. The Alu I restriction polymorphism of the amplicons provided a useful tool for identifying B. burgdorferi sensu lato strains. Both amplicons from B. burgdorferi sensu stricto and B. garinii except HP1 strain showed identical RFLP pattern (50 bp, 70 bp, and 150 bp), but amplicons from B. afzelii and B. garinii showed two types of subgroups, respectively. The result of PCR-RFLP using extracted DNAs from ticks was similar to those patterns of B. burgdorferi species including B. afzelii.