트립토판 중합효소 α 소단위 잔기 치환체 Pro⁹⁶→Leu의 구조 변화에 영향을 미치는 139 및 258 잔기의 치환 효과

이주연,정재갑,신혜자,임운기,Lee, Joo-Youn,Jeong, Jae-Kap,Shin, Hae-Ja,Lim, Woon-Ki 한국생명과학회 2002 생명과학회지 Vol.12 No.4

대장균 트립토판 중합효소(tryptophan synthase) $\alpha$ 소단 위체의 96번, 139번 과 258번 자리를 돌연변이 시킨 이중 돌연변이체 P96L/F139W, P6L/F258W와 삼중 돌연변이체 P96L/F139W/F258W의 효소 활성도와 형광 분광계를 이용한 분광학적 성질을 조사하였다. 이중 돌연변이체의 효소 활성도는 야생형과 유사하나 삼중 돌연변이체는 40% 감소된 활성도를 가진다. P96L/F139W 와 P96L/F258W의 형광세기는 야생형에 비해 감소하였으나 P96L/F139W/F258W는 야생형에 비해 증가하였다. 효소 활성도와 형광 결과는 96번의 치환이 8번 알파구조와 4번 베타 구조와 4번 알파구조 사이의 loop의 안정성에 영향을 준 것을 나타낸다. 이 결과로부터 P96L/F139W/F258W는 야생형과 다른 3차 구조를 가지나 139번과 258면 주위는 더 조밀한 구조를 가지고 있다는 것을 보여준다. Enzymatic activities and fluorescence spectroscopic properties of the double mutant proteins P96L/F139W, P96L/F258W and a triple mutant protein P96L/F139W/F258W of tryptophan synthase $\alpha$ subunit from Escherichia coli was examined to study tertiary and local structure changes around the tryptophan residues. The enzymatic activities of P96l./F139W and P96L/F258W were similar, but P96L/F139W/F258W had lower activity, as compared to wild type. The fluorescence intensities of double mutant, P96L/F139W and P96L/F258W, were decreased but that of a triple mutant, P96L/F139W/F258W, was increased when compared to wild type. The sum of the maximum fluorescence intensity (fluorescence intensity at the λ$_{max}$) for the double mutant proteins was not equal to the intensity seen in the triple mutant protein. The enzymatic activity and fluorescence data indicate that the replacement of Pro$^{96}$ longrightarrowLeu might affect on the stability of helix 8 and the loop located between strand 4 and helix4. The result suggests that the tertiary structure of triple mutant (P96L/F139W/F258W), being different from wild type, might have more compact residual structure at the vicinity of 139 and 258.8.

Various Aggregate Forms of Tryptophan Synthase α-Subunit

Myung Won Park(박명원),Woon Ki Lim(임운기) 한국생명과학회 2013 생명과학회지 Vol.23 No.2

단백질 덩어리는 질환의 원인이 되기도 하고, 유용한 유전자 재조합 단백질의 생산시 문제를 야기하기도 한다. 본 연구에서는 조건을 달리함으로 트립토판 합성효소 α 소단위체로부터 적어도 3가지 이상 다른 종류의 덩어리가 생길 수 있음을 보여주고 있다; (1) 불투명 흰색 침전 가능한 덩어리 (2) 투명하고 겔 유형의 침전 가능한 덩어리 (3) 불침전 덩어리. 이런 다른 종류의 덩어리 형태는 다른 기작을 통해 일어날 것으로 추정된다. Protein aggregation can cause diseases and hinder the production of useful recombinant proteins. The present study showed that at least three types of aggregates can be formed from tryptophan synthase α-subunit (αTS) by varying conditions: (1) an opaque white precipitous aggregate, (2) a transparent gel-like precipitous aggregate, and (3) an unprecipitous aggregate. Macroscopically different aggregate types might suggest different mechanisms underlying aggregation processes.

대장균 트립토판 생성효소의 소단위체간 상호조절

조원진(Won Jin Cho),임운기(Woon Ki Lim) 한국생명과학회 2017 생명과학회지 Vol.27 No.12

대장균 트립토판 생성효소는 α2β2 복합체로 구성되며, 트립토판 생합성에서 최종 2 단계의 반응에 관여한다. 두 개의 소단위체는 분자 터널로 연결되어 있어, 기질 채널링이 일어난다. 활성 부위간 상호 조절하는 정교한 조절 기작에는 α-루프 L6(αL6), αL2, αL3이 관여한다. 본 연구에서는 이 자리의 잔기치환체를 써서 소단위체에 특이적으로 결합하는 리간드의 영향을 조사하여 소단위체간 상호 조절기작에 따른 구조 변화를 살펴보았다. αTS의 활성부위에 결합하는 D,L-α-glycerophosphate(GP)는 모든 잔기치환체를 야생형 수준으로 회복시켰다. βTS의 기질인 L-Ser는 다양한 효과를 나타낸다. 야생형과 NS104에서는 속도가 감소한 반면, GD51과 PH53에서는 거의 영향이 없었고, PT53와 DG56은 증가하였다. 이는 반응 중간 화학종의 분포의 변화와 연관될 가능성을 제시한다. GP와 L-Ser를 동시에 처리했을 때는 특이하게도 PH53는 가장 안정한 잔기치환체였다. 이는 Pro53가 소단위체간의 조절기작에서 중요한 역할을 하는 것을 시사한다. Escherichia coli tryptophan synthase (TS) contains α2β2, which catalyzes the final two steps in Trp biosynthesis. A molecular tunnel exists between the two active sites of α and β subunits in TS. Via intersubunit communication, TS increases catalytic efficiency, including substrate channeling. The β subunit of TS is composed of two domains, one of which, the COMM (communication) domain, plays an important role in intersubunit communication. The α subunit has a TIM barrel structure. This protein has functional regions at the C terminal of β pleated sheets and in its loop regions. Three regions of the α subunit (αL6 [α-loop L6], αL2, and αL3) are implicated in intersubunit communication. In the present study, conformational changes in αL6 were monitored by measuring the sensitivity of mutant proteins in these regions to trypsin. The addition of a α subunit-specific ligand, D,L-α-glycerophosphate (GP), partially restored the sensitivity of mutant proteins to trypsin. In contrast, the addition of the β subunit-specific ligand L-serine (Ser) resulted in varied sensitivity to trypsin, with an increase in PT53 (substitution of Pro with Thr at residue 53) and DG56, decrease in NS104 and wild type, and no change in GD51 and PH53. This finding may be related to several reaction intermediates formed under this condition. The addition of both GP and Ser led to a highly stable state of the complex. The present results are consistent with the current model. The method used herein may be useful for screening residues involved in intersubunit communication.

두툽상어 matrix metalloproteinase 유전자 cDNA의 클로닝

김종원,조원진,천광호,김규원,김영진,이상준,신혜자,임운기,Kim, Jon Won,Cho, Won Jin,Chun, Kwang Ho,Kim, Kyu-Won,Kim, Yung-Jin,Lee, Sang-Jun,Shin, Hae-Ja,Lim, Woon Ki 한국생명과학회 1998 생명과학회지 Vol.8 No.3

Matrix metalloproteinases(MMP)는 배발생 및 재조직화 등의 정상적인 생체형성과 관절염, 암전이, 치근막염, 골조송증 등의 질병과정에서 collagen이나 proteoglycan과 같은 세포외기질의 구성성분을 분해하는 아연(zinc)효소군이다. 지금까지 다양한 종에서 mmp의 유전자가 클로닝되고 그 기능이 연구되어 왔지만 아직 어류에서는 연구결과가 보고된 바가 없다. 본 연구에서는 한국의 부산연안에 많은 연골어유 투툽상어(Scylliorhinus toraxzame)로부터 RT-PCR(reverse transcriptase dependent polymerase chain reaction)의방법으로 mmp cDNA의 일부를 클로닝하였다. 이것은 염기서열에서 인간, 쥐 및 닭의 membrane type matrix matalloproteinase-3(mt3-mmps)의 염기서열과 74% 동일성을 보이며, 아미노산서열에서는 90%이상의 동일성을 갖고 있다. 또한 MMP에 나타나는 cysteine switch domain, zinc binding domain(HExGH motif), propeptide cleavage site, and RRKR motif등을 가지고 있다. 이러한 결과로부터 본 연구에서 클로닝된 RT-PCR단편은 두툽상어의 mt3-mmp 또는 이와 유사한 유전자의 cDNA이라 믿어진다. Matrix metalloproteinases(MMPs) are a group of zinc enzymes responsible for degradation of the matrix components such as collagen and proteoglycans in normal embryogenesis and remodeling and in many disease processes such as arthritis, cancer, periodontitis, and osteprocess. Genetically distince MMPs have been characterized and their genes have been cloned thus far from a variaty of species but not from fishes. In this stydy, a mmp cDNA was cloned by using RT-PCR(reverse transcriptase dependent polymerase chain reaction) from Scylliorhinus toraxzame(shark), agroup of cartilaginous fish, abundant in the coast of Pusan, Korea. It has 74% base homologue with membrane type matrix matalloproteinase-3 genes(mt3-mmps) from human, rat and chick, and also shows more than 90% residue homologue with them. In addition, it has cysteine switch domain, zinc binding domain(HExGH motif), propeptide cleavage site, and RRKR motif, which are present in MMPs. This result indicates that cDNA fragment cloned here may be mt3-mmp or its analogous gejne cDNA fragment of Scylliorhinus torzame.

재조합 미생물 바이오센서를 이용한 chlorotoluene과 nitrotoluene 화합물의 검출

이다영(Da Young Lee),조재호(Jae Ho Cho),임운기(Woon Ki Lim),신혜자(Hae Ja Shin) 한국생명과학회 2014 생명과학회지 Vol.24 No.1

방향족 화합물은 독성 환경오염물질로 생태계와 인간의 건강에 해로운 영향을 미친다. 그중 chlorotoluene과 nitrotoluene 화합물은 수생생물에 독성을 나타내며 인간의 피부, 눈, 호흡기를 자극한다. 본 연구에서는 폐수의 chlorotoluene과 nitrotoluene 화합물을 저렴하고 간단하게 검출하고자 재조합 미생물 바이오센서를 개발하였다. BTEX (benzene, toluene, ethylbenzene, xylene) 분해 조절 유전자 xylR를 Po’ (upstream activating sequences를 제거한 DmpR 조절단백질 promoter Po) 또는 Pu (XylR 고유의 프로모터)::lacZ 유전자(β-galactosidase 유전자)의 upstream에 연결한 플라스미드를 제작한 후, E. coli DH5α에 형질 전환하였다. 유도 화합물 존재 하에서, 아가로스에 고정된 이 재조합 바이오센서 세포는 유도 화합물에 의해 β-galactosidase를 발현하고 기질인 chlorophenol red β-D-galactopyranoside (CPRG)를 분해하여 1~2시간에 붉은색을 나타내었다. BTEX 화합물 중, 특이적으로 o-, m-, p-chlorotoluene (0.1 ㎛-100 mM) 그리고 o-, m-, p-nitrotoluene (0.1 mM-100 mM)에서 높은 반응을 나타내었으며 Po’가 Pu보다 높은 반응성을 보여주었다. 아가로스에 고정된 바이오센서는 4℃에서 21일간 보존 후에도 활성의 큰 변화 없이 안정하였으며, chlorotoluene과 nitrotoluene 화합물들로 spike된 전처리 하지 않은 폐수 시료중에서도 좋은 반응을 보여 주어 폐수 중 chlorotoluene과 nitrotoluene 화합물의 간단한 초기 검출에 활용될 수 있음을 제시하였다. Aromatic hydrocarbons are toxic environmental pollutants that are detrimental to the ecosystem and human health. Among them, chlorotoluene and nitrotoluene are toxic to hydrobios and irritate the skin, eyes, and respiratory organs of humans. We herein report the development of recombinant microbial biosensors for cheap and rapid monitoring of chlorotoluene and nitrotoluene compounds. Plasmids were constructed by inserting the xylR regulatory gene for BTEX (benzene, toluene, ethylbenzene, and xylene) degradation into upstream of Po’ (the DmpR activator promoter Po with the deletion of its own upstream activating sequences) or Pu (the cognate promoter of XylR)::lacZ (the β-galactosidase gene) and transformed into Escherichia coli DH5α. In the presence of inducers, the biosensor cells immobilized in agarose developed a red color in 1-2 h due to the hydrolysis of chlorophenol red β-D-galactopyranoside (CPRG), a substrate of β-galactosidase that was expressed by the inducers. Among BTEX, high responses were specifically observed with o-, m-, p-chlorotoluene (0.1 ㎛-100 mM) and o-, m-, p-nitrotoluene (0.1 mM-100 mM). Po’ demonstrated higher responses than those with Pu. The biosensors immobilized in agarose showed good stability after 21 days’ storage at 4℃, and responses in untreated wastewater spiked with chlorotoluene and nitrotoluene, suggesting they can be used to detect compounds in wastewater.

Development of A Biosensor for Endocrine Disrupters

Yu Mi Kang(강유미),Young In Kim(김영인),Woon Ki Lim(임운기) 한국생물공학회 2004 한국생물공학회 학술대회 Vol.2004 No.4

트립토판 중합효소 알파 소단위체의 in vitro 구조재형성시 Ca^2+과 Mg^2+이온의 단백질 응집체 형성 촉진 효과

천광호,김종원,신혜자,임운기 부산대학교 유전공학연구소 1999 분자생물학 연구보 Vol.15 No.-

The effect of cations on the formation of protein aggregates was examined by in vitro refolding of mutant tryptophan synthase α-subunit in which Pro 24 was replaced by Leu. NH^+_4, K^+ and NA^+ had no effect, but Mg^2+ and Ca^2+ stimulated the formation of protein aggregates in dose-dependent manner. It is suggested that Mg^2+ and Ca^2+ may be implicated in the formation of protein aggregates in vivo.