Simple Identification of veA1 Mutation in Aspergillus nidulans

한갑훈,Jae-Sin Park,채건상,한동민 한국미생물학회 2010 The journal of microbiology Vol.48 No.6

The veA gene plays an important role in development of a homothallic filamentous fungus Aspergillus nidulans. The veA1 phenotype can be difficult to distinguish from the wild-type veA. Despite the importance of the veA allele, no efficient identification method has been reported besides DNA sequencing. Here, we present simple physiological and molecular biological ways to distinguish between the veA wild-type and veA1 allele. The novel approaches, which involve incubation in the presence of oxalic acid, polymerase chain reaction using double mismatched primers, and BstXI enzyme digestion, are simpler, faster and more cost-efficient than genome sequencing.

Environmental factors affecting develpopment of Aspergillus nidulans

한갑훈,Dong-BeomLee,Jong-HakKim,Min-SuKim,Kyu-YongHan,Won-ShinKim,Young-SoonPark,Heui-BaikKim,Dong-MinKim 한국미생물학회 2003 The journal of microbiology Vol.41 No.1

Aspergillus nidulans, a homothalic ascomycete, has a complete sexual reproductive cycle as well as an asexual one. Both sexual and asexual development are known to be genetically programmed, but are also strongly affected by environmental factors including nutrients, light, temperature and osmolarity. We have examined these factors to define favored conditions for fruiting body (cleistothecium) formation. In general, fruiting body formation was enhanced where carbon and nitrogen sources were sufficient. Limitation of C-source caused predominant asexual development while inhibiting sexual development. When higher concentrations of glucose were supplied, more cleistothecia were formed. Other carbon sources including lactose, galactose and glycerol made the fungus develop cleistothecia very well, whereas acetate caused asexual sporulation only. Organic nitrogen sources like casein hydrolysate and glycine, and an increase in nitrate or ammonium concentration also enhanced sexual development. In addition to nutrient effects, low levels of aerobic respiration, caused either by platesealing or treatment with various chemicals, favored sexual development. Carbon limitation, light exposure and a high concentration of salts promoted asexual development preferentially, suggesting that stress conditions may drive the cell to develop asexual sporulation while comfortable and wellnourished growth conditions favored sexual development.

Regulation of nsdD Expression in Aspergillus nidulans

한갑훈,Min-Su Kim,Kyu-Yong Han,Dong-Beom Lee,Jong-Hak Kim,Suhn-Kee Chae,Keon-Sang Chae,Dong-Min Han 한국미생물학회 2003 The journal of microbiology Vol.41 No.3

The nsdD gene has been predicted to encode a GATA type transcription factor with the type IVb zinc finger DNA binding domain functions in activating sexual development of A. nidulans. In several allelic mutants of nsdD producing truncated NsdD polypeptides lacking the C-terminal zinc finger, the transcription level of nsdD gene was greatly increased. Also in an over-expressed mutant, the transcription under its own promoter was reduced. These results suggest that the expression of nsdD is negatively autoregulated. When the nsdD gene was over-expressed, cleistothecia were formed in excess amounts even in the presence of 0.6M KCl that inhibited sexual development of the wild type. Northern blot analysis revealed that the expression of nsdD was repressed by 0.6M KCl. These results strongly suggest that the inhibition of sexual development by salts was carried out via the nsdD involved regulatory network.

Aspergillus nidulans 에서 nsdD 유전자의 cDNA 클로닝

한갑훈,한유정,한동민 원광대학교 생명공학연구소 1995 생명공학연구소보 Vol.3 No.1

In Aspergillus nidulans, Never in Sexual Development(nsdD) gene is required for the early stage of sexual development. A region of the A. nidulans genomic DNA carrying the nsdD gene which complements NsdD19 mutation was isolated by transformation of NsdD19 mutant with a cosmid library. The size of the subcloned gene was about 4kb-long and the plasmid containing the 4kb DNA fragment, pNSD19-SB4, was cloned. 2.5kb and 2. 1kb cDNAs of nsdD gene were obtained from the sexual-development specific cDNA library by plaque hybridization and cloned into pBluescriptⅡ KS+.

단보 : 고농도 CO2노출에 의한 Aspergillus nidulans의 유성생식 촉진효과

한갑훈 ( Kap Hoon Han ),양영석 ( Yeong Seok Yang ),김종화 ( Jong Hwa Kim ) 한국균학회 2013 韓國菌學會誌 Vol.41 No.3

진균의 분화과정은 다양한 환경요인에 의하여 영향을 받는다. 모델 사상성 진균인 Aspergillus nidulans의 경우 빛이 존재하거나 높은 염 농도, 비 발효성 당에 의하여 무성분화가 촉진되며 반대로 빛이 없거나 발효성 당이 풍부할 때, 그리고 저산소 조건일 경우 유성분화를 촉진하게 된다. 또한 veA나 nsdD와 같은 유성생식 양성조절유전자들도 유성분화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 A. nidulans에서 CO2의 농도와 분화패턴의 관계를 알아보고자 하였다. 정상적인 조건에서 veA+야생형 균주은 유성생식과 무성생식이 균형을 이룬 상태의 분화를 진행하게 된다. 그러나 5% 정도의 높은 CO2조건에서 배양하였을 경우 무성분화는 일어나지 않고 유성생식으로만 분화과정이 일어나게 된다. 뿐만 아니라 이러한 분화 양상은 veA와 nsdD에 의존적으로 일어나게 된다. 고농도의 CO2 조건이라 할지라도 veA-혹은 nsdD- 돌연변이 균주에서는 유성분화는 일어나지 않고 무성분화만이 일어나는 것을 관찰할 수 있었는데, 이는 CO2 농도가 높아져도 유성생식에 있어서 이들 유전자의 기능이 필요하다는 것을 시사한다. 또한 5% CO2조건은 인간 병원성 진균에게 있어서 사람의 신체 내에 살아남기 위하여 적응하여야 하는 대기 조건으로, 이러한 A nidulans의 CO2농도에 따른 분화양상의 변화는 A. fumigatus와 같은 인간 병원균의 생리, 분화적 변화에 대한 비교분석에 사용될 수 있다. Fungal development is largely affected by many environmental factors. In a model filamentous fungus Aspergillus nidulans, asexual development is promoted by exposure of light, presence of salt and non-fermentable sugars. In other hand, sexual development is largely induced by absence of light, fermentable sugars and hypoxic condition. Also, some important genes including veA and nsdD play positive roles in activating sexual development. Here, we reported that the effect of high concentration of CO2 on developmental decision in A. nidulans. When wild-type veA + strain was cultured in normal condition, sexual and asexual development occurred in balanced manner. However, high concentration of CO2 (~5%) strongly activated sexual development and inhibited asexual development. Furthermore, this CO2 effect was controlled by the veA(-) or nsdD(-) gene. High CO2 culture of veA or nsdD mutant didn`t activate sexual development, suggesting that the activation of sexual development induced by high CO2 cannot overcome the genetic requirement of sexual development such as veA(-) or nsdD(-). Since 5% CO2 is an important condition for human pathogenic fungi for surviving and adapting in human body, this developmental pattern of A. nidulans affected by CO2 concentration may provide interesting clues for comparative study with human fungal pathogens including Aspergillus fumigatus.

단문(短文) : 세신 정유 추출물의 피부진균 및 기회감염진균에 대한 항진균 효과

한갑훈 ( Kap Hoon Han ) 한국균학회 2007 韓國菌學會誌 Vol.35 No.1

Aspergillus nidulans에서 형질전환률을 증가시키는 DNA fragment에 관한 연구

김진희,한갑훈,한동민 圓光大學校 基礎自然科學硏究所 1996 基礎科學硏究誌 Vol.14 No.2

pNPG는 염색체 1번의 동원체 왼편에 위치하는 npgA1을 complementation할 수 있는 genomic DNA를 포함하는 이며, Aspergillus nidulans를 pNPG로 형질전환시켰을 때 형질전환율이 현저히 증가하였다. 이 때 불완전형질전환체가 형성되지 않았으며 Trp^+형질전환체 모두가 Npg^+임이 확인되었다. pNPG를 제한효소 PstⅠ으로 절단하여 얻어진 10.4kb 절편내에 형질전환율을 증가시키는 DNA서열이 존재함을 확인하였고 pILJ16 의 PstⅠ size에 재조합하여 pKJH10.4라 명명하였다. pKJH10.4로 A.nidulans를 형질전환시킨 결과 pILJ16 단독으로 형질전환했을 때보다 형질전환율이 200배 가량 증가함이 확인되었으며, 형질전환율을 증가시키는 최소한의 DNA절편은 EcoRⅠ―HaeⅢ 4.9kb 절편이었다. pNPG,a library plasmid containing genomic DNA complementing npgA1 which located on the left arm of linkage groupⅠ,transformed Aspergillus nidulans at high frequency. No abortive transformants were observed and the Trp^+ transformants were all Npg^+. The 10.4kb PstⅠ fragment was cloned into pILJ16, which increased the transformation efficiency of pILJ16 by more than 200folds. The full activity of enhanced transformation was retained on the 4.9kb EcoRⅠ―HaeⅢfragment. The DNA segment was similar to AMA1 rather than ANS1 in function and designated as AMA2.

Aspergillus nidulans의 유성분화에 관여하는 유전자들의 연구

정성수,한갑훈,한규용,한동민 圓光大學校 基礎自然科學硏究所 2000 基礎科學硏究誌 Vol.18 No.1

사상성 진균류인 Aspergillus nidulans에서 분리된 유성분화 결손 돌연변이주 6종을 형태학적, 유전학적 측면에서 분석하였다. 모든 NSD(Never in Sexual Development) 돌연변이 주들의 성장은 야생형 균주에 비해 늦어지는 양상을 보였다. 이 돌연변이주들 중 NSD206, NSD207 그리고 NSD2100은 분생포자병(conidiophore)의 발생시기가 야생형과 거의 비슷하였다. 반면, NSD213과 NSD216은 야생형보다 늦어졌고, NSD113은 야생형보다 빨라졌다. NSD206의 돌연변이 유전자는 nsdA4, nsdB5 그리고 nsdD19 돌연변이 유전자와 각각 상보(complementation)되었다. 이 결과로서 NSD206의 돌연변이 유전자는 새로운 nsd 유전자임을 알 수 있었다. NSD206의 돌연변이 유전자를 nsdC6라 명명하였고, 이 유전자가 연관군 Ⅱ에 연관됨을 결정하였다. 한편 NSD113, NSD207, NSD213, NSD216 그리고 NSD2100의 돌연변이 유전자는 nsdD19 돌연변이 유전자와 상보되지 않았다. 이 결과로서 NSD113, NSD207, NSD213, NSD216 그리고 NSD2100의 돌연변이 유전자는 nsdD 유전자의 다른 대립 유전자(allele)임을 알 수 있었다. 이 돌연변이 유전자들을 각각 nsdD13, nsdD213, nsdD16 그리고 nsdD10으로 명명하였다. 이 돌연변이주들 각각을 nsdD 유전자의 부분적인 ORF를 포함하는 DNA 절편들로 상보 실험을 수행하였고, 돌연변이주들 각각의 genomic DNA로부터 PCR을 수행하여 염기서열을 분석함으로서 돌연변이 부위를 결정하였다. 아직 돌연변이 부위를 결정하지 못한 nsdD13을 제외한 나머지 돌연변이들은 모두 ORF내에 발생한 돌연변이들로 나타났다. 이 돌연변이들로 말미암아 해독틀변경이 발생하여 해독틀내에 정지 코돈(non sense codon)이 발생한다. 이로서 nsdD7과 nsdD19는 86개, nsdD213과 nsdD16은 펩타이드(polypeptide)를 각각 만들어 낼 것으로 예상된다. 이 돌연변이주들 모두 nsdD 유전자의 발현양상에 있어서 야생형과 비교하여 약 10배, 또는 그 이상의 발현양상을 보였다. 이 결과로서 nsdD 유전자는 negatively auto-regulation되며 C-terminus zine finger domain이 이 조절에 필요하다는 것을 알 수 있다. Six NSD(Never in Sexual Development) mutants were characterized for the morphogenetical and genetical properties. Growths of all the mutants were retarded in compare with that of wild type. NSD206, NSD207 and NSD2100 mutants developed conidiophores almost same time as that of wild type, NSD213 and NSD216 later and NSD113 faster. The mutant gene of NSD206 was complemented with any of nsdA4, nsdB5, or nsdD19 mutant allele, implying that it was novel nsd gene. The mutant gene of NSD206 was named as nsdC6 and revealed to locate on linkage groupⅡ. On the other hand, since the mutant genes of NSD113, NSD207, NSD213, NSD216, and NSD2100 were not complemented with nsdD19 mutant allele, we assume these mutant genes to be another allelic mutants of nsdD gene. The alleles were named as nsdD13, nsdD7, nsdD213, nsdD16 and nsdD10, respectively. Complementation assay with various fragments of nsdD ORF and DNA sequencing identified the mutation sites. The most mutations were revealed to occur within ORF, except nsdD13 which could not be identified yet, resulting in frame shift and occurrence of non sense condon on frame. The nsdD7 and nsdD19 were expected to yield polypeptide with 86 amino acids, the nsdD213 and nsdD16, 160 amino acids and nsdD10, 334 amino acids, respectively. All of these NSD mutants expressed nsdD gene more than wild type by about ten-folds or more. These results indicated that the gene was negatively auto-regulated, which required the C-terminus zinc finger domain.

Aspergillus fumigatus에서 Methyltransferase 유전자 AfuvipB와 AfuvipC의 분리 및 분석

모하메드,한갑훈,Elgabbar, Mohammed A. Abdo,Han, Kap-Hoon 한국균학회 2015 韓國菌學會誌 Vol.43 No.1

사상성 진균에서 veA 유전자와 연계되어 있는 velvet 복합체는 진균의 분화와 이차 대사산물의 조절에 매우 중요한 기능을 한다. 모델 사상균인 Aspergillus nidulans의 경우 methyltransferase인 VipB와 VipC를 포함한 여러 단백질들이 VeA 단백질과 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 인간 기회감염 진균인 Aspergillus fumigatus에서 vipB와 vipC 유전자의 상동유전자를 분리하여 각각 AfuvipB와 AfuvipC로 명명하였다. AfuvipB 유전자는 AspGD 데이터베이스에 Afu3g14920으로 등록되어 있으며 1,510 bp 길이에 10개의 인트론을 가지고 있고, 유전자 산물은 336 아미노산 잔기로 구성된 단백질로 methyltransferase 도메인을 가지고 있었다. AfuvipC는 Afu8g01930으로 AfuvipB와 유사하게 10개의 인트론을 가지고 있으며 339개의 아미노산으로 구성된 methyltransferase를 암호화하고 있었다. A. fumigatus에서 각각의 유전자에 대한 기능을 알아보고자 유전자제거 돌연변이 균주들을 제조하고 그들의 표현형을 관찰하였다. AfuvipB 유전자 제거 돌연변이는 점 접종을 하였을 경우 대조군에 비하여 표현형의 차이를 보이지 않았다. 그러나 단일 포자에서 성장한 콜로니를 비교해 보았을 때 대조군에 비하여 그 크기가 작고 분화 속도도 약간 더딘 것을 관찰할 수 있었다. 반면에 AfuvipC 유전자 제거 돌연변이는 대조군과 비교하였을 때 표현형의 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 두 개의 methyltransferase가 상호 중복적인 역할을 수행하거나 정상적인 실험실 배양조건에서는 중요한 기능을 수행하지 않을 수 있음을 시사한다. In filamentous fungi, velvet complex associated with the veA gene plays pivotal roles in development and secondary metabolism. In a model fungus Aspergillus nidulans, many proteins that can interact with VeA, including two methyltransferases VipB and VipC, have been isolated and characterized. In this study, we isolated homologs of the vipB and vipC genes in the human opportunistic pathogenic fungus Aspergillus fumigatus and named AfuvipB and AfuvipC. The AfuvipB gene, annotated as Afu3g14920 in the Aspergillus Genome Database (AspGD) database, consists of 1,510 bp interrupted with 10 introns yielding 336 amino acid-long putative methyltransferase protein. Similarly, AfuvipC, which is Afu8g01930, has 10 introns and encodes a polypeptide with 339 amino acids having a methyltransferase domain in the middle of the protein. To characterize the function of the genes in A. fumigatus, knock-out mutants were generated and the phenotypes were observed. Deletion of AfuvipB gene caused no obvious phenotypic change on point inoculation but showed smaller colony than wild-type when the mutant was subjected to culture on single spore-driven culture condition. However, AfuvipC deletion mutant demonstrated no phenotypic difference from wild type both in point inoculation and streaking cultures. These results indicate that the two methyltransfereases might have a redundant role and could be dispensable in normal culture conditions.

화장품소재로서 곽향 추출물 및 발효물의 생리활성 연구

이정로,한갑훈,오태구,강정란 한국응용과학기술학회 2023 한국응용과학기술학회지 Vol.40 No.6

Agastachis herba is so similar in use to herbs that it is called Korea Mint in the West. Western herbs are commonly used as ingredients in cosmetics. However, in Korea, Agastachis herba is primarily used as a medicinal herb. This study aims to compare the effectiveness of one cosmetic ingredient with another cosmetic ingredient. Antioxidant, whitening, polyphenol, flavonoid, and antibacterial experiments were conducted on lactobacillus, yeast ferments, essential oils, and floral water using extracts from Agastachis herba. Antioxidants exhibited significant effects in all samples, while essential oils displayed the highest efficacy in terms of whitening, polyphenol content, and antibacterial properties. Flavonoids exhibited the strongest effect in the 70% ethanol extract. The essential oil had the most significant functional impact. However, it was confirmed that the fermented products that underwent yeast fermentation with extracts were as effective as essential oils.