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들깨 ${\gamma}-tocopherol$ methyltransferase cDNA 유전자의 분리 및 특성
황선갑,김동헌,이재열,김용환,황영수,김경환,Hwang, Seon-Kap,Kim, Dong-Hern,Lee, Jai-Youl,Kim, Young-Hwan,Hwang, Young-Soo,Kim, Kyung-Hwan 한국응용생명화학회 2002 한국농화학회지 Vol.45 No.4
${\gamma}-Tocopherol$ methyltransferase(TMT)는 토코페롤 생합성 대사의 마지막 단계인 감마 토코페롤을 알파 토코페롤로 변환하는데 관여하는 효소이다. 들깨의 미성숙 종자 cDNA유전자 은행에서 TMT로 추정되는 유전자를 분리하였으며 이 유전자는 1369개의 염기와 367개의 아미노산으로 구성되었으며 분자량은 약 42kDa의 추정된다. 이 cDNA는 Genbank와 상동성 분석결과 애기장대의 TMT유전자와 아미노산 수준에서 60% 정도의 상동성을 가지고 있으며 methyltransferase domain과 S-adenosyl methionine binding domain을 가지고 있으므로 TMT 유전자로 추정했다. 이 유전자의 특성을 알기 위하여 완전한 크기를 가지는 TMT유전자를 대장균에서 발현하고 invitro에서 효소의 활성을 측정하였다. ${\gamma}-Tocopherol$ methyltransferase (TMT) is an enzyme catalyzing ${\gamma}-tocopherol$ into ${\alpha}-tocopherol$ at the final step of ${\alpha}-tocopherol$ synthesis pathway. Putative TMT cDNA clone specific to Perilla frutescens immature seeds was isolated from cDNA library. The cDNA clone consisted of 1369 bp open reading frame encoding 369 amino acids with a relative Mw of 42 kDa. Results revealed the CDNA has 60% homology to Arabidopsis thaliana TMT, and possesses methyltransferase and S-adenosyl methionine-binding domains, suggesting that cDNA encodes a ${\gamma}-tocopherol$ methyltransferase To characterize the properties of the TMT gene, the cDNA sequences coding for mature TMT were expressed in E. coli and assayed to determine the enzyme activity in vitro.
Kluyveromyces fragilis의 Alkaline Phosphatase 유전자의 구조 분석
박수영,황선갑,하상철,김종국,박완,홍순덕 한국산업미생물학회 1994 한국미생물·생명공학회지 Vol.22 No.1
본 연구실에서 이미 클로닝되어 있는 Kluyveromyces fragilis Y610의 alkaline phosphatase 유전자를 함유한 3.0 kbp의 DNA 단편을 재료로 하여 몇 종류의 제한효소로 절단하여 M13mp18/19 vectors에 subcloning하거나, 세종류의 합성 oligonucleotide를 primer로 이용하여 Sanger의 dideoxy chain termination 방법으로 염기배열결정을 행하였다. 결정된 염기배열(2,988 bp)을 분석한 결과, 1,638 bp의 open reading frame(ORF)이 확인되었으며, ORF의 염기배열상의 상동성은 S. cerevisiae와 61%, E. coli와 46%로 나타났다. ORF로부터 추정된 아미노산배열은 546개의 아미노산잔기로 이루어져 있으며, 예상되는 분자량은 60,046 dalton이었다. S. cerevisiae의 PHO8 유전자로부터 유추된 아미노산배열과의 상동성은 60.2%로 나타났으며, E. coli, S.cerevisiae 및 human placenta의 alkaline phosphatase와 상동성이 높은 지역을 검색한 결과 Region I, II, IV의 세 부분이 공통부위로 관찰되었다. 또한, glycosylation 부위 및 active site로서 가능한 잔기의 위치를 예측할 수 있었다. From the pSKH201 plasmid which had been previously cloned in our laboratory, a 3.0kbp insert DNA encoding the alkaline phosphatase of Kluyveromyces fragilis was cleaved with several restriction endonucleases and ligated into the appropriate sites of M13mp18/19 vectors and sequenced by Sanger’s dideoxy chain termination method. The sequence contained a 1,638 bp open reading frame(ORF) whose similarities in nucleotide, when compared with those of Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli by GENETYX program, were found to be 61% and 46%, respectively. The deduced amino acid sequence consists of 546 amino acids and contains several homologous regions in the alkaline phosphatases of E. coli, S.cerevisiae and human placenta.
Kluyveromyces fragilis의 Alkaline Phosphatase 유전자의 E. coli 및 S. cerevisiae에서의 발현
박수영,황선갑,이동선,김종국,남주현,홍순덕 한국산업미생물학회 1995 한국미생물·생명공학회지 Vol.23 No.2
본 연구실에서 이미 클로닝하여 염기배열을 결정한 바 있는 Kluyveromyces fragilis의 ALPase 유전자의 발현연구를 위해 이 유전자를 E. coli YK537과 S. cerevisiae NA79-10C에 형질전환시켜 인산염이 고갈된 배지에서 그 발현을 관찰하였다. 그 결과 E. coli에서는 구성적인 효소활성을 나타내었고, S. cerevisiae에서는 효소활성이 derepression 됨을 관찰하였다. 한편, ALPase 유전자의 전사수준을 규명하기 위해 Northern hybridization 실험을 행하였으며, 전사개시부위를 알기 위해서 primer extension 분석을 행하였다. Northern hybridization 결과, K-ALPase 유전자의 전사는 K. fragilis 자신에서는 인산 고갈에 상관없이 구성적인 발현양상을 보였고 K-ALPase 유전자를 도입한 S. cerevisiae는 인산 고갈시 유전자 발현이 derepression 되는 양상을 보였으며, 이들 모두는 효소 활성 측정 결과와도 부합하였다. Primer extension 실험결과, K-ALPase 유전자의 전사는 최초의 ATG codon으로부터 상류 -169번 염기이니 C residue에서 시작됨이 밝혀졌다. The alkaline phosphatase (K-ALPase) gene of Kluyveromyces fragilis has been cloned (1) and determined its base sequences (2) previously in our laboratory. When the K-ALPase gene was expressed in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae, it showed a constitutive activity in E. coli, and a derepressed activity in S. cerevisiae in phosphate-limited medium. Northern hybridization experiment was performed to elucidate the transcription level of the K-ALPase gene. Northern experiment showed that transcription level of K-ALPase gene in S. cerevisiae was higher in phosphate depletion, but it was higher in high phosphate medium than in phosphate limited medium in K. fragilis. The transcription initiation site of the K-ALPase gene was determined by primer extension analysis. It matched nucleotide position -169 in relation to the putative trnslational start site.
Kluyverromyces fragilis의 Alkaline Phosphatase 유전자의 구조 분석
박수영,황선갑,하상철,김종국,박완,홍순덕,Park, Soo-Young,Hwang, Seon-Gap,Ha, Sang-Chul,Kim, Jong-Guk,Park, Wan,Hong, Soon-Duck 한국미생물·생명공학회 1994 한국미생물·생명공학회지 Vol.22 No.1
From the pSKH201 plasmid which had been previously cloned in our laboratory, a 3.0kbp insert DNA encoding the alkaline phosphatase of Kluyveromyces fragilis was cleaved with several restriction endonucleases and ligated int the appropriate sites of M13mp18/19 vectors and sequenced by Sanger's dideoxy chain termination method. The sequence contained a 1,638 bp open reading frame(ORP) whose similarities in nucleotide, when compared with those of Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli by GENETYX program, were found to be 61% and 46%, respectively. The deduced amino acid sequence consists of 546 amino acids and contains several homologous regions in the alkaline phosphatases of E. coli, S.cerevisiae and human placenta.
Espression of Alkaline Phosphatase Gene from Kluyveromyces fragilis in E. coli and S. cerevisiae
박수영,황선갑,이동선,김종국,남주현,홍순덕,Park, Soo-Young,Hwang, Seon-Kap,Lee, Dong-Sun,Kim, Jong-Guk,Nam, Joo-Hyun,Hong, Soon-Duck 한국미생물 · 생명공학회 1995 한국미생물·생명공학회지 Vol.23 No.2
The alkaline phosphatase (K-ALPase) gene of Kluyveromyces fragilis has been cloned (1) and determined its base sequences (2) previously in our laboratory. When the K-ALPase gene was expressed in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae, it showed a constitutive activity in E. coli, and a derepressed activity in S. cerevisiae in phosphate-limited medium. Northem hybridization experiment was performed to elucidate the transcription level of the K-ALPase gene. Northern experiment showed that transcription level of K-ALPase gene in S. cerevisiae was higher in phosphate depletion, but it was higher in high phosphate medium than in phosphate limited medium in K. fragilis. The transcription initiation site of the K-ALPase gene was determined by primer extension analysis. It matched nucleotide position - 169 in relation to the putative trnslational start site.
Escherichia coli의 시티딘/디옥시시티딘 디아미나제를 코드하는 cdd 유전자의 클로닝
권택규,김태호,황선갑,김종국,송방호,홍순덕 한국산업미생물학회 1990 한국미생물·생명공학회지 Vol.18 No.6
E. coli의 cytidine deaminase(cytidine/2'-deoxycytidine aminohydrolase; EC 3.5,4.5)를 코딩하는 cdd 유전자를 E. coli cdd^-pyr^- 결손 변이주를 cloning host로 하여 southern blotting과 colony hybridization을 통하여 클로닝하였다. cdd 유전자가 단편은, cdd 유전자의 transcription initiation 부위의 23개 nucleotide를 합성한 후 probe로 사용하여 Southern hybridization에 의해 회수된 cdd 유전자를 함유한 단편을 얻었으며, 이를 pBR322에 삽입한 후 형질전환하여 colony hybridization한 결과 cdd^+ cell을 얻었다. 삽입된 DNA 단편의 size는 27kb이었으며 이를 결실 및 subcloning을 연속 수행한 결과 2.1kb의 SalI/DraI tragment(pTK605)에 cdd 유전자가 location되어 있음을 알게 되었다. Mini cell 실험결과 합성된 polypeptide는 약 33kDa이었으며, wild type의 cytidine deaminase의 활성이 pBR322에서 증폭시킴으로서 37배 정도 배가되었으며, pBR322에 비해 pUC vector계에서 다시 활성이 7배 정도 증가됨을 알 수 있었다. We have cloned the cdd gene from E. coli C600 using (cdd^-) as a host. From the sequenced promoter region of E. coli cdd gene which has been determined by Valentin-Hansen P. (1985), we synthesized the 23 mer oligonucleotides corresponding to the transcription initiation region and used as a probe for cloning of the cdd gene by Southern blotting. The isolated fragments in the blotting were introduced to the colony hybridization after transforming it into the E. coli JF611 (cdd^-, pyr^- double mutant), and we identified the hybridized band at 27 kb long. From the original insert of 27 kb fragment in the BamHI site of pBR322, the 5.3 kb fragment containing the cdd gene was isolated by subsequent deletion and subcloning. From the derived plasmid pTK509, further deletion and subcloning were performed and clarified that the cdd gene was located in the 2.1 kb of SalI/DraI segment in the insert of pTK605. The polypeptide encoded by the cloned DNA was appeared to be a molecular mass of 33,000.
Kluyveromyces fragilis 의 Alkaline Phosphatase 유전자의 구조 분석
박수영,김종국,홍순덕,박완,황선갑,하상철 경북대학교 유전공학연구소 1995 遺傳工學硏究所報 Vol.10 No.1
From the pSKH201 plasmid which had been previously cloned in our laboratory, a 3.Okbp insert DNA encoding the alkaline phosphatase of Kluyveromyces fragilis was cleaved with several restriction endonucleases and ligated into the appropriate sites of M13mp18/19 vectors and sequenced by Sanger's dideoxy chain termination method. The sequence contained a 1,638 bp open reading frame(ORF) whose similarities in nucleotide, when compared with those of Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli by GENETYX program, were found to be 61% and 46%, respectively. The deduced amino acid sequence consists of 546 amino acids and contains several homologous regions in the alkaline phosphatases of E. coli, S.cerevisiae and human placenta.