동결 배아 이식에서의 동결 배아 보존 방법에 따른 임상 결과 비교 연구

이아름 상명대학교 대학원 2016 국내석사

최근 몇 년간 보조 생식술(Assisted Reproductive Technology, ART)의 급속한 발전으로 양질의 배아가 생산됨으로써 잉여 배아의 보존에 대한 중요성이 대두되어 왔다. 그 동안 많은 연구자들에 의해 다양한 기술이 발전되어 왔으며 크게 완만동결(slow-freezing)과 유리화동결(vitrification)로 나눌 수 있다. 이러한 동결 방법으로 인해 난임 환자들에게 다시 한 번 이식을 할 수 있는 기회가 제공되었다. 또한 최근 추세가 단일 배아 이식으로 이어지면서 동결 기술의 발전은 더욱 중요시 되고 있다. 본 연구에서는 이식 후 남은 잉여 배아를 보존함에 있어서 어떤 동결 방법이 임상적 결과에 효과적인지 알아보고자 하였다. 2009년에서 2014년까지 총 839명의 환자들을 대상으로 동결배아 이식을 진행하였으며 이 중 152명은 완만동결을 이용하여 동결 보존 후 이식을 하였고, 687명은 유리화동결을 이용하여 동결 보존 후 이식을 하였다. 또한 동결배아 이식과 신선배아 이식을 비교하기 위해 406명의 환자를 대상으로 신선배아 이식을 하였으며 이를 동결배아 이식과 비교하였다. 완만동결과 유리화동결 후 배아 생존율을 보면 할구가 전혀 손상되지 않고 완전하게 생존한 배아의 비율이 9% 정도 유리화동결에서 높게 나타났다(p<0.05). 동결-융해 후 퇴화되거나 할구가 용해된 배아의 비율을 보면 완만동결보다 유리화동결에서 약 11% 낮은 것을 확인하였다(p<0.05). 지속적 임신율이나 출생률에서는 유리화동결에서 수치상으로 높게 나타났으나 통계적으로 유의하지는 않았다. 완만동결에서는 착상률이 10.3%로 나타났으며 유리화동결에서는 19.8%의 착상률을 보였다(p<0.05). 동결배아 이식과 신선배아 이식을 비교해 보았을 때 화학적 임신율은 동결배아 이식에서 약 8% 높은 임신율을 보였다(p<0.05). 임상적 임신율도 마찬가지로 동결배아 이식에서 6.6% 높게 나타났다(p<0.05). 지속적 임신율에서는 동결배아 이식에서 수치상으로 약간 높게는 나타났으나 통계적으로 의미 있는 값은 아니었다. 출생률과 착상률 또한 동결배아 이식에서 약간 높게 나타났으나 거의 차이가 없는 것으로 확인되었다. 신선배아 이식과 완만동결을 이용한 동결배아 이식을 비교하였을 때에는 큰 차이를 보이지 않았으나 유리화동결을 이용한 동결배아 이식에서 10% 이상 높은 화학적 임신율을 보였다(p<0.05). 또한 임상적 임신율에서도 신선배아 이식과 완만동결을 이용한 동결배아 이식은 아주 근소한 차이를 보였으나 이 두 그룹과 유리화동결을 이용한 동결배아 이식을 한 그룹 간에는 대략 9% 정도의 차이를 보였다(p<0.05). 착상률에서도 유리화동결을 이용한 동결배아 이식, 신선배아 이식, 완만동결을 이용한 동결배아 이식 순서로 높은 착상률을 보였다(p<0.05). 본 연구에서는 유리화동결이 완만동결보다 시간이 단축되고 고가의 장비가 필요 없어 경제적이고 간단했을 뿐 아니라 동결-융해 후 전반적으로 높은 생존율을 나타내었다. 유리화동결을 이용한 동결배아 이식에서는 배아의 생존율이 높게 나타나 양질의 배아를 회수하는데 유리하였다. 이 때문에 유리화동결을 이용한 동결배아 이식에서 화학적 임신율, 임상적 임신율, 착상률에서 완만동결을 이용한 동결배아 이식보다 좋은 결과를 보였음을 확인하였다. 또한 동결배아 이식과 신선배아 이식을 비교한 결과에서 동결배아 이식에서의 임상적 결과가 좋거나 비슷한 양상을 보였으므로 동결배아 이식의 안정성을 판단하였다. 따라서 신선 주기에서 이식이 어려운 경우 동결배아 이식을 적극적으로 고려해 볼 필요가 있다고 사료된다. 체외수정, 동결배아, 유리화동결, 완만동결, 동결배아이식, 신선배아이식, 임상적임신 Recently, embryo cryopreservation technique became an important part of assisted reproductive technology(ART). Slow-freezing has been used as a good way for storage of embryos. But, slow-freezing has several disadvantages in time-effectiveness, cost-effectiveness, blastocyst formation, and etc. Vitrification has many advantages including simplicity and time-effectiveness. Also, vitrification is superior to slow-freezing in terms of survival rates of cryo-thawed embryos. The aim of this study was to investigate the differences in clinical outcomes between slow-freezing and vitrification. And this study suggests direction for better cryopreservation method through the differences in clinical outcomes. This study had been conducted from 2009 to 2014 in Seoul women's hospital, Incheon, Korea. 839 cycles were cryopreserved by either slow-freezing (152 cycles) or vitrification (687 cycles). Cryopreservation of embryos were performed by either conventional IVF or ICSI. Two of cryopreservation were used cryo-straw(0.25ml). Vitrification was performed using cryoprotectant which consisted of Dimethyl sulfoxide(DMSO), ethylene glycol and sucrose. On the other hand, slow-freezing cryoprotectant included ethylene glycol and sucrose without DMSO. Statistical analyses were performed using SPSS software. Also, a P value of <0.05 was considered to be statistically significant. In this study, A total of 5,143 embryos were cryopreserved by either slow-freezing or vitrification. There was no significant difference in patient characteristics between slow-freezing and vitrification groups. 650 embryos were transferred to slow freezing method (152 cycles, 4.3±1.2) while 2,067 embryos were subject to vitrified embryo transfer. (687 cycles, 3.0±1.0) According to this study, vitrification shows better clinical outcomes than slow-freezing. In this study, vitrification yields better embryo survival rates of cryo-thawed embryo transfer compared with slow-freezing. For this reason, vitrification shows higher clinical outcomes compared with slow-freezing. Therefore, vitification is considered as an effective embryo cryopreservation method. in vitro fertilization, embryo cryopreservation, vitrification, slow-freezing, cryo-thawed embryo transfer, fresh embryo transfer, clinical pregnancy

에틸렌 글리콜 동결보호제를 이용한 생쥐배아의 유리화 동결 보존

김미영 전남대학교 대학원 2005 국내석사

목적: 본 연구는 생쥐 후기 발달단계인 상실배와 배포기 배아를 이용하여 유리화 동결보존 및 해동 후 배아의 생존율과 발달률을 비교하고자 시행하였다. 재료 및 방법: 상실배와 배포를 획득하기 위하여 4∼5주된 ICR계 계통의 암컷과 8∼12주령의 수컷 생쥐를 이용하여 PMSG와 hCG로 과배란을 유도한 후 48시간째에 난관을 통해 2세포기의 수정란을 회수하여 상실배는 48시간동안, 배포는 72시간동안 10% Serum Substitute Supplement (SSS)가 첨가된 Human Tubal Fluid (HTF) 배양액으로 체외 배양시켰으며, 상실배와 배포로 성장한 배아를 선별하여 동결하였다. 동결시 사용되는 동결보호제는 30%, 35%, 40% ethylene glycol, 18% Ficoll, 0.5M sucrose가 함유된 EFS30, 35, 40용액을 사용하였다. 이 용액에 3단계의 동결법으로 유리화 동결 후 0.5M sucrose의 농도를 6단계로 낮춰주면서 해동을 실시하여, 회수된 상실배와 배포의 생존율과 부화배포로의 발달률인 부화율을 관찰하였다. 결과: 농도가 다른 동결보호제를 이용하여 동결보존 및 해동시킨 후 그 발달률을 관찰해본 결과, 먼저 상실배 배아의 생존율에서는 EFS30군이 94% EFS35군이 85.4% EFS40군이 60%로 통계적으로 유의한 차이를 보이며 그 중 EFS30군이 가장 높은 생존율을 보였다. 48시간 추가 배양 후 관찰한 부화율에서는 EFS30군이 30.6%, EFS35군이 25%, EFS40군이 11.3%로 통계적으로 유의한 차이를 보이며 EFS30군이 다른 두 군에 비해 높은 부화율을 보였다. 배포기 배아의 생존율을 살펴보면, EFS30군이 90.4%, EFS35군이 98.5%, EFS40군이 100%로 통계적으로 유의한 차이를 보이며 그 중 EFS40군이 가장 높은 생존율을 보였다. 24시간 추가배양 후 관찰한 부화율에서는 EFS30군은 46.2%, EFS35군은 57.6%, EFS40군은 64.3%로 EFS40군이 가장 높은 부화율을 보였으나 통계적 유의성은 없었다. 상실배와 배포기 배아의 생존율을 비교해본 결과, EFS35군과 EFS40군에서 배포기 배아가 통계적으로 높은 생존율을 보였으며, 부화배포까지의 발달률인 부화율에서도 EFS35군과 EFS40군에서 배포기 배아가 유의하게 높은 발달률을 보였다. 결론: 이러한 결과로 미루어보아 생쥐 상실배의 유리화 동결을 위한 동결보호제로는 30%의 ethylene glycol이 함유된 EFS30용액이, 배포기 배아의 유리화 동결을 위해서는 EFS40용액이 적합할 것으로 사료되고, 상실배 배아보다는 배포기의 배아가 유리화 동결을 위해 더 적합하다고 사료된다. Objective: This study was conducted to find an optimal condition for the vitrification of mouse morulae and expanded blastocysts. Materials and Methods: Mouse embryos were obtained at 2 cell stage and cultured to morula and expanded blastocyst stage in Human Tubal Fluid (HTF) medium supplemented with 10% Serum Substitute Supplement (SSS). The vitrification solutions used were EFS30, EFS35 and EFS40 that contains 30%, 35% and 40% ethylene glycol, respectively, with 18% ficoll and 0.5 M sucrose diluted in Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) medium supplemented with 10% SSS containing. The vitrification procedure was performed in EFS solution with three steps, followed by thawing in 6 steps with 0.5 M sucrose, and then survival and hatching-hatched rate per embryos recovered were compared between six groups. Results: After 24 h culture in different vitrification and thawing solution, the survival rate of morula embryos was 94.1%, 85.4% and 59.7% for EFS30, EFS35 and EFS40 group, respectively. Hatching rate of morula embryos after 72 h culture was 30.6%, 25% and 11.3% for EFS30, EFS35 and EFS40 group, respectively. The survival rate of expanded blastocyst embryos after 24 h culture was 90.4%, 98.5% and 100% for EFS30, EFS35 and EFS40 group, respectively. Hatching rate of expanded blastocyst embryos after 48 h culture was 46.2%, 57.6% and 64.3% for EFS30, EFS35 and EFS40 group, respectively. Conclusion: The EFS30 solution was the best for vitrification of mouse morulae. The EFS40 solution was the best for vitrification of mouse expanded blastocysts. The mouse expanded blastocyst was better than mouse morula for vitrification of mouse embryos.

돼지 난포란의 유리화동결 방법에 관한 연구

김선영 대구대학교 2003 국내석사

This study was conducted to develope the vitrification method in porcine oocytes. When the porcine oocytes were vitrified at different kinds and exposing time of cryoprotectants, and vitrification time, the rates of in uitro maturation and fertilization were examined. The results were summarized as follows. 1. When the oocytes matured additionally were matured in uitro for 0 or 24 hours after exposing of cryoprotectants, the maturation rates to MII were 26.4 and 30.8% in DMSO, 28.4 and 25.9% in glycerol, 36.7 and 37.4% in PROH, respectively. The maturation rate in control (56.9%) was higher (P<.Ol) than that in DMSO and glycerol, but were not shown that in PROH. 2. When the oocytes matured for 0, 24 and 44 hours were fertilized in vitro after exposing of cryoprotectants, the fertilization rates to PN were 6.3, 8.9 and 15.5% in DMSO, 6.9, 9.1 and 13.9% in glycerol, 9.2, 6.7 and 13.9% in PROH, respectively. The fertilization rate in control (23.9%) was higher (P<.Ol) than that in 0 and 24 hours, but were not shown that in 44 hours. 3. When the oocytes matured additionally were matured in vitro for 0 or 24 hours after frozen and thawed, the maturation rates to MII were 1.4 and 7.5% in DMSO, 3.0 and 5.0% in glycerol, 2.5 and 2.9% in PROH, respectively. The maturation rate in control (60.3%) was higher (P<.Ol) than that in others. 4. When the oocytes matured for 0, 24 and 44 hours were fertilized in vitro after frozen and thawed, the fertilization rates to PN were 1.0, 1.4 and 0.9% in DMSO, 0.9, 0.8 and 0.4% in glycerol, 0.0, 0.0 and 0.4% in PROH, respectively. The fertilization rate in control (24.7%) was higher (P<.Ol) than that in others.

(The) effect of long zona dissection using ICSI pipettes as mechanical assisted hatching in vitrified-thawed blastocyst transfers

손성대 부산대학교 2013 국내박사

1. 서론 본 연구는 유리화동결 후 해동한 포배아 이식에서 기계적인 보조 부화술의 방법인 미세조작피펫을 이용한 투명대 절개 과정 중 절개 길이에 따라 임상적인 차이점이 있는지 알아보기 위해 시행되었다. 2. 연구 방법 38세 이하, 120명의 불임환자를 대상으로 불임클리닉에서 체외 수정 시술에 의해 수정된 배아를 포배아기까지 배양하였고, Gardner와 Schoolcraft score상 3BB 이상의 양질의 배아를 선택하여 유리화동결과 해동을 거쳐 포배아 이식을 시행하였다. 배아 이식 전 보조 부화의 방법으로 투명대 절개를 시행하였는데, 투명대 직경의 2/3 이상을 절개한 긴 절개군 60명과 1/3 이하를 절개한 짧은 절개군 60명의 두 그룹으로 임의 배분하여 배아의 완전 부화율, 착상율, 그리고 임상적 임신율을 조사 비교하였다. 3. 결과 해동 5시간 후 배아의 완전 부화율은 긴 절개군에서 짧은 절개군에 비해 유의하게 높았다(52.4% vs 31.8%, P = 0.001). 배아의 착상율과 임상적 임신율 또한 긴 절개군에서 짧은 절개군에 비해 유의하게 높았다(40.9% vs 25.7%, P = 0.01, 63.0% vs 40.0%, P = 0.011). 지속적 임신율은 긴 절개군에서 짧은 절개군에 비해 높았으나 통계적으로 유의하지 않았다 (50.0% vs 33.3%, P = 0.064). 4. 결론 이 연구는 유리화동결 후 해동한 포배아 이식을 시행할 경우는 미세조작피펫을 이용한 기계적 보조 부화술이 유용하며, 특히 긴 투명대 절개법이 짧은 투명대 절개법에 비해 완전 부화율, 착상율, 임상적 임신율을 유의하게 증가시킴으로써 보조 생식술의 임상 결과를 향상시키는데 유용함을 시사한다.

Embryonic survival, development and cryoinjury of repeatedly frozen mouse preimplantation embryos

염진아 서울대학교 대학원 2017 국내석사

Objective Although guidelines about the number of embryos to be transferred differ among each country or individual IVF center, efforts to reduce the number of transferred embryo in a single cycle have been continuously made. If embryos were frozen in the past cycle and one or more embryos are transferred in the present cycle, surplus embryos should be re-frozen. It has been concerned that re-frozen embryos would have great cryoinjury, low survival, and subsequent poor pregnancy success. The aim of this study is to investigate the embryonic survival, development, and expressions of cryoinjury-related genes in once-frozen, twice-frozen, and three-time-frozen mouse preimplantation embryos using indirect vitrification methods. Methods Experimental animal study. Six hundred 8-cell stage embryos were obtained from 60 female mice and randomly assigned to control and three experimental groups (150 embryos per each group). 8-cell stage embryos were vitrified by indirect vitrification methods and warmed once, twice, and three times, respectively. We analyzed the developmental outcome including survival rate, blastocyst formation rate, the percentage of hatching/hatched blastocyst including the cell number differences. And we used DAPI staining in hatching or hatched blastocysts for cell count. And a part of hatching or hatched blastocysts were subjected to real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) for quantification of cryoinjury-related genes. We examined the expressions of cryoinjury related genes (Casp3, Cirbp, Sod 1, Gpx 3, Cat). And we also evaluated three anti-oxidant enzymes against ROS production on mouse embryo (Sod 1, Gpx 3, Cat). Data were analyzed by the comparative cycle threshold method in all experiments using Histone H2A.Z (H2afz) as endogenous reference genes. All mRNA expressions were normalized to that of H2afz mRNA. The experiments were repeated 6 times using different sets of embryos. Results In three frozen groups, overall survival rate, blastocyst-formation rates, the proportions of hatching/hatched blastocyst, and the cell count in hatching/hatched blastocyst were all similar compared to non-frozen control group. The mRNA expression of Casp 3, Cirbp showed no significant differences between 4 groups. And the mRNA expression of Sod 1, Gpx 3, Cat was significantly elevated in the experimental group. Conclusion This is the first study to evaluate the efficacy of three times of repetitive freezing-warming of mouse 8-cell embryos, and also the first study using indirect (closed) vitrification method. Repeatedly frozen mouse preimplantation 8-cell embryos even up to three times could preserve good survival and embryonic development. Similar expression of mRNAs for cryoinjury-related markers (Cirbp, Casp 3) or elevated anti-oxidant related enzymes (Sod 1, Gpx 3, Cat) indicates the safety of repeatedly frozen embryos at a molecular level. We demonstrated that closed (indirect) vitrification method also have efficacy and safety in frozen technologies.

완만동결된 배아와 유리화 동결된 배아를 이식했을 때의 임신 예후의 비교

곽은희 인하대학교 대학원 2014 국내석사

난자와 배아의 동결 보존은 난임 환자의 임신 성공확률을 향상시키는 요인 중 하나로 중요하게 여겨지고 있다. 그리하여 동결 보존 시 배아의 손상을 최대한 줄이기 위하여 배양액이 발달되고 동결 장비와 방법이 점점 다양하게 발달하였다. 완만 동결법은 배아를 동결하는데 오랫동안 좋은 방법으로 사용돼왔다. 그러나 배아의 손상도나 작업시간, 비용 등 여러 가지 단점들 때문에 이를 보완하기 위한 연구가 계속되었다. 다양한 기술을 시도하는 동안, 유리화 동결법이 완만동결법을 대체할 최적의 방법이라는 것이 보고되었다. 유리화 동결법은 동결과정에 있어서 얼음 결정을 형성하지 않는다. 얼음 결정은 세포가 동결될 때 세포에 손상을 주게 되는데 유리화 동결법은 완만동결법 보다 세포 손상을 최소화하게 된다. 유리화 동결법으로 동결-융해 된 배아의 경우 융해 후 배아 발달율이나 임신율이 완만동결-융해 된 배아보다 높다는 것이 보고되었으며 유리화 동결법은 작업 시간이 오래 걸리지 않으며 비용 효율도 높다. 보조생식술에서 중요하게 여겨지고 있는 또 다른 하나는 여러 개의 배아를 이식함으로 인해 발생하는 다태아 임신이다. 하나의 배아가 착상하여 한 명의 아이를 출생하는 성공률은 상대적으로 낮다. 이러한 이유로 많은 시험관아기 센터들은 하나 이상의 배아를 이식하게 되었으며 높은 성공률을 얻은 반면에 다태아 임신을 유도하게 되었다. 그러므로 최근 배아 이식수를 줄이면서도 높은 성공률을 얻으려는 노력이 이어지고 있다. 본 연구는 완만동결-융해된 배아와 유리화 동결-융해 된 배아의 생존율과 임신율, 착상률을 비교 분석하였다. 그 결과 유리화 동결-융해한 배아의 생존율이 더 높았고, 이식 배아의 개수는 적었으며 임신율과 착상률은 높았다. 배아를 동결하기 전 수정 방법에 따라 배아 동결 시 영향을 미치는지 확인하고자 군을 나누어 비교하였다. 그 결과 수정 방법(체외수정이나 정자미세주입술)에 따른 동결-융해한 배아의 생존율, 임신율과 착상률에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 또한 동결 보존 기간이 융해 후 배아에게 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 보존기간별로 군을 나누어 비교하였다. 그 결과 완만동결군의 경우는 1년 미만의 보존배아가 융해 후 높은 생존율을 보였으나 동결보존기간이 배아의 상태나 임상적 결과에 미치는 영향은 없었다. 유리화 동결군에 있어서 배아 이식 전 보조부화술을 시술하였다. 이 시술이 임신율과 착상률에 영향을 주는지 확인하기 위해 보조부화술을 시행한 군과 시행하지 않은 군으로 나누어 임신율과 착상률을 비교하였다. 그 결과 임신율에는 차이를 보이지 않았으나 착상률에서 보조부화술을 시행한 군이 더 높게 나타났다. 또한 배아를 이식한 개수는 보조부화술을 시행한 군이 더 낮게 나타났다. 결론적으로 유리화 동결법에 의해 동결-융해한 배아가 높은 생존율을 보였고 보조부화술을 시술함으로 인해 낮은 개수의 배아를 이식함에도 불구하고 임신율, 착상률이 더 높게 나타났다. 이는 유리화 동결법으로 동결된 배아를 융해하고 배아를 이식하기 전 보조부화술을 시행해주면 적은 수의 배아를 이식하면서도 임신 예후에 더 좋은 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.

인간 포배기 배아의 동결을 위한 효과적인 유리화 동결법의 개발

이주희 대구대학교 대학원 2001 국내석사

This study was examined the survival rate of vitrified blastocysts according to freezing vessels, equilibration time in cryoprotectant and artificial dehydration method. The results obtained in this study were summerized in follows : 1. The survival rate of vitrified blastocyst on plastic straw, OPS, EM grid as freezing vessels was 26.7, 13.0 and 60.5%, respectively. EM grid was significantly higher than plastic straw and OPS (p<0.05). 2. The survival rate of EB. MB and LB on 1.5 minutes equilibration time were 64.4, 81.0. and 20.0% respectively. The survival rate of EB and MB was significantly higher than LB (p<0.05). But that on 3 minutes was 69.9, 50.0 and 57.5% respectively. Each group was not significantly different. 3. In cytoplasmic shrinkage for artificial dehydration before vitrification, the survival rate of EB, MB and LB was 92.9, 100 and 75.9% respectivly. MB was significantly higher than LB (p<0.05). 4. The survival rate of vitrified human blastocysts by artificial dehydration and slow-frozen human blastocysts was 88.9 and 66.7% respectively, which was not significantly different. In conclusion, these results suggested that the survival rate of vitrified human blastocysts by EM grid and artificial dehydration was relatively high and effective. Therefore, the development of this method is a useful techniques for cryopreservation at blastocyst stage.

돼지 未成熟 卵胞卵의 琉璃化 凍結·融解時 諸要因이 體外成熟에 미치는 影響

고혁진 濟州大學校 大學院 1996 국내석사

본 실험은 재치 미성숙 난포난의 효과적인 유리화 동결을 위한 동결액 개발을 위해 공결전 과정에서 동결보호제의 독성, 평형시간, 노출방법, 회석시간과 방법 등이 례기 미성숙 난포난의 생존율에 미치는 영향과 혈청, 난포액을 동결액에 첨가하거나 cytoskeletal stabilizer 처리 후 동결융해후 난포난의 생존율을 조사하기 위하여 실시하였으며 결과는 단음과 같다. 1. 비침투성 동결보호제인 Sucrose의 독성 실험에서 0.1, 0.25, 0.5M sucrose 처리구가 1M의 처리구에 비해 높은 체외성숙율을 보여주었다(51.7, 49.1, 50.2%, vs 17.2%: p < 0.01). 그러나 대조구의 체외성숙율(57.8%)과는 유의차가 없었다. 2. 침투성 동결보호제의 폭성설험 결과 20% DMSO 와 PROH 에서 다른 내동제에 비해 가장 좋은 체외성숙율(60.8, 56.4%)을 보여주었나 대조구의 56.7%의 체외성숙율과 유의차가 없었다. 체외수정결과 10% DMSO 와 20% PROH 에서 다른 내동제에 비해 가장 좋은 체외수정율(25.5&, 15.6%)을 보여주었다. 그리나 대조구에서는 32.2%의 체외수정율을 보여주었고 10% DMSO를 제외하고는 모든 처리에서 유의성있게 낮게 나타났다(p < 0.01). 3. 돼지 난포난의 유리화 동결을 위한 동결액의 유리화검정 결과 ficoll 과 PVP 의 첨가에 관계없이 D20% P20% 에서는 융해시 빙정이 형성되었고 D25%, P25%에서는 비침투성 동결보호제 첨가없이(ficoll, PVP) 동결융해시 모두 유리화가 되었다. 4. 돼지난포난의 유리화동결액(VS: D25 P25 + 0.5M surrose + 10% FBS)에 1, 3, 5분의 평형시간에 따른 체외성숙율은 각각 49.4, 33.3, 23.2% 였으며 대조구 58.7%의 체외성숙율에 비해 유의차있게 낮았다(p<0.01). 한편 ficoll 10%가 첨가된 5에서는 5분 (29.5%)에 비해 1분, 3분에서 각각 58.7%, 50.8%의 높은 체외수정율을 보여주었다(p<0.01). 5. 동결액에 노출된 돼지미성숙 난포난의 희석시간에 따른 체외성숙율은 5(53.4%)에서 1분과 3분(22.2%, 34.5%)에서 보다 높게 나타났으며 (p< 0.01) 대조구의 체외수정율(55.1%)과 비슷한 수준이었다. 6. 돼지 미성숙난포난을 FBS 20%와 FBS 10% +pFF 10%가 첨가된 유리화 동결액에서 동결융해 후 각각 0.8%, 8.7%의 체외성숙율을 보여주었지만 대조구(56.1)에 비해 매우 저조판 성적이었다(p<0.01). 동결전 cytoskeletal stabilizer에 처리된 돼지 난포난의 유리화 동결융해 후 체외성숙율은 10.0%로 대조구(51.4%)보다 저조한 성적이었다(p < 0.01). 한편 성숙난자(37.2%)가 미성숙 난포난(18.9%)보다 동결보존 후 유의성 있게 높은 생존율을 보였다(p < 0.01). This study was carried out to examine the factors(cryoprotectants, equilibration time, exposure methods, Time in dilution solution and method) affecting the viability ut vitrified immature porcine follicle oocytes. The results are summarized as follows: 1. In an experiment done to determine optimum sucrose concentration in freezing medium. It was found that in vitro maturation(IVM) rates of immature porcine follicle oocytes were higher(p < 0.01) in 0, .1, .25 and .5M than in 1.0M sucrose(57.8, 51.7, 49.1, 50.0% vs 22.9 respectively). 2. In an experiment done to find out a proper permeable cryoprotectant(10, 20, 30, 40%(v/v) glycerol, dimethysulfoxide(DMSO), ethyleneglycoi, prophyleneglycol(PROH). It was found that IVM - rates of 10, 20, 30% DMSO(59.0, 60.8 and 52.9% respectively) and 10, 20, 30% PROH(54.9, 56.4 and 55.6% respectively) were similar and those values were higher than those in 40%(v/v)(DMSO:28.2%: PROH:28.6%). IVM - rates of other cryoprotectants(glycerol, ethyleneglycol) in all concentrations were very low than control(no cryoprotectant). However, there were no significant differences between control(no cryoprotectant) and 20%(v/v) of DMSO and PROH. 3. In an experiment done to find out a non-crystallization freezing medium, it was found that crystallization occurred in 20% DMSO+ 20% PROH with or without ficoll or PVP. However, the crystallization did not occur in 25% DMSO+ 25% DMSO(D25P25) without ficoll or PVP. 4. An experiment done to find out optimum time for oocytes in vitrification solution(VS) showed that IVM - rates of immature porcine follicle oocytes equillibrated in VS(D25P25) for 1 min, 3 min and 5 min were 43.4%, 33.3% and 23.2%, respectively. When equillibrated in VS containing 10% Ficoll, the respective rates were 58.7, 50.8 and 29.5%. In both V, the IVM - rates of immature follicle oocytes equilibrated for 5 min were lower than those found in oocytes equilibrated for 1 or 3 min. 5. An experiment conducted to find out optimum time in dilution medium(0.5M sucrose) showed that IVM-rate(53.4% of immature porcine follicle oocytes exposed in dilution medium for 5min was higher(p<0.01) than the rates of oocytes cultured for 1 min(34.5%) or for 3 min(22.2%). 6. IVM - rate of vitrified immature follicle oocytes was significantly lower( > 9%) than that of non-frozen immature follicle oocytes(56.1%). 7. An experiment done to determine the effect of cytoskelatal stabilizer for immature follicle oocytes during freezing showed that IVM-rate of the vitrified immature porcine follicle oocytes after treatment in cytoskeletal stabilizer for 15min was 10.0%, but, lower than non-frozen immature follicle oocytes(51.4%). However, viability of matured oocytes(35.2%) was higher than immature porcine follicle oocytes(22.4%).

생쥐배포의 유리화 동결보존에 관한 연구

이유진 全南大學校 大學院 2004 국내석사

목적: 본 연구는 생쥐 배포기 배아인 배포를 이용하여 두가지 동결보호제로 유리화 동결 보존 및 해동 후 배아의 생존율과 발달률을 비교하고자 시행하였다. 재료 및 방법: 배포를 획득하기 위하여 4~6주된 ICR계 계통의 암컷과 8~12주령의 수컷 생쥐를 이용하여 PMSG와 hCG로 과배란 유도한 후 수정 48시간 째에 난관을 통해 2세포기의 수정란을 회수하여 3일동안 10% Serum Substitute Supplement(SSS)가 첨가된 Human Tubal Fluid(HTF)배양액으로 체외배양 시켰으며, 배포기로 성장한 배아를 선별하여 동결하였다. 동결시 사용되는 동결보호제로는 40% ethylene glycol, 18% ficoll, 0.5M sucrose가 함유된 EFS40용액과 20% ethylene glycol, 20% DMSO,10% 1,3-butanediol이 함유된 VS용액을 사용하였다. 각각의 용액에 노출시켜 배포에 대한 독성을 점검한 후에, EFS40용액은 3단계의 동결법으로 유리화동결 후 0.5M sucrose의 농도를 5단계로 낮춰주면서 해동을 실시하였고, VS용액은 2단계의 동결법으로 유리화동결 후 1.0M의 trehalose를 이용하여 해동을 실시하고, 회수된 배포의 회수율 및 생존율과 부화 배포로의 배아 발달률인 부화율을 비교하였다. 결과: 각각의 용액에 동결없이 노출 후 발달을 유도한 결과 EFS40군에서는 95%의 생존율과 100%의 부화율을 보인 반면, VS군에서는 100%의 생존율과 87.5%의 부화율을 보였다. 각 동결보호제를 이용하여 동결보존 및 해동시킨 후 그 발달률을 관찰해본 결과, 먼저 회수율에서 EFS40군은 73.7%, VS군은 66.5%를 보였고, 생존율은 24시간 배양 후 EFS40군은 80.5%, VS군은 66%, 48시간 배양 후 EFS40군은 69%, VS군은 58.3%의 결과를 보였다. 부화율은 24시간 배양 후 EFS40군에서는 20.7%, VS군에서는 0%, 48시간 배양 후 EFS40군은 33.3%, VS군은 1.9%를 보여 EFS40군이 VS군에 비해 생존율과 부화율에서 각각 유의하게 높았다. 결론: 이러한 결과로 미루어보아 생쥐 배포의 유리화동결을 위한 동결보호제로는 VS용액보다 EFS40용액이 더 적합할 것으로 사료된다 Objective: The aim of this study was to compare the survival and developmental rate of two vitrification solutions for the vitrification of mouse expanded blastocysts. Materials and methods: Mouse embryos were obtained at 2 cell stage and cultured to expanded blastocyst stage in Human Tubal Fluid (HTF) medium supplemented with 10% serum substitute supplement(SSS). The vitrification solutions used were EFS40 and VS. EFS40 consisted of 40% ethylene glycol, 18% ficoll, and 0.5M sucrose while VS consisted of 20% ethylene glycol, 20% DMSO, and 10% 1,3-butanediol diluted in Dulbecco's phosphate-buffered saline(DPBS) medium supplemented with 10% calf serum(CS). Toxicity was tested by exposing expanded blastocysts to vitrification solution. The vitrification procedure used for EFS40 was performed in three steps, after which they were warmed in 5 steps with 0.5M sucrose. VS was performed in two steps, after which they were warmed with 1.0M trehalose. Recovery, survival and hatching rate per expanded blastocysts recovered were compared between two groups. Results: In toxicity test, survival and hatching rate of EFS40 group were 95% and 100%, respectively. In contrast, survival and hatching rate of VS group were 100% and 87.5%, respectively. After vitrification and warming in solution, recovery rate for EFS40 group was 73.7% whereas recovery rate for VS group was 66.5%. After 24h culture, survival and hatching rate were 80.5% and 20.7% for EFS40 and 66% and 0% for VS group, respectively. After 48h culture, survival and hatching rate were 69% and 33.3% for EFS40 and 58.3% and 1.9% for VS group, respectively. Survival and hatching rate in EFS40 group were significantly higher than those found in VS group. Conclusion: The EFS40 solution was better than VS solution for vitrification of mouse expanded blastocysts.

Cryopreservation of chrysanthemum(Chrysanthemum morifolium) shoot tips using the droplet-vitrification technique : 작은 방울-유리화법에 의한 국화 신초(Chrysanthemum morifolium)의 초저온동결보존에 대한 연구

Yun-Keol Lee 충남대학교 대학원 2012 국내박사

본 연구는 PVS3 동결보호제(Cryoprotectant)를 이용한 유리화법에 의한 국화 유전자원의 실용화를 위한 장기보존(초저온보존)과 관련된 요인들을 조사하고 이와 관련된 동결보존 기전을 해명하기 위하여 기획되었다. 특히 이 논문에서는 국화의 신초 중에서도 기내 실험적으로 다량 확보 가능한 측아의 실용 다양성을 효과적인 활용을 목적으로 진행하였다. 일반적으로 국화는 특별히 변종들이 많고, 이들의 민감성으로 하여 아직까지 국화 유전자원의 장기보존은 실용화되지는 않은 상황이다. 때문에 이 실험은 이러한 문제를 해결하기 위하여 우선 정아를 대상으로 0.3 혹은 0.7 M 사탕 용액에서 전배양(preculture)조건을 검토하였다. 0.3 M 사탕용액에서는 31시간, 0.7 M 사탕용액에서는 17시간이 좋았다. 또한 생존율이나 재생율을 높이기 위한 가장 중요한 요인인 삼투스트레스를 최소화하기 위하여 0.3 – 0.5 – 0.7 M 사탕(sucrose : S) 3단계 전배양조건을 검토하였다. 그리하여 국화의 정아에 대하여 31 – 16 – 6 시간 배양조건이 좋았다는 것을 밝혔다. 동시에 살아있는 정아 내 세포나 조직의 동결보존을 위하여 반드시 필요한 탈수 시 삼투압 쇼크를 최소화하기 위하여 반드시 필요한 로딩조건에 대한 검토를 전면적으로 진행하였다. 특히 이 과정에 작은방울-유리화(Droplet-vitrification)법을 개선하였다. 그리하여 2.0 M G + 0.5 S 대신에 유리화용액 PVS3의 35%가 좋았다는 것을 알게 되었다. 동시에 유리화를 위한 탈수과정 시 디메틸슬폭시드(DMSO)와 에틸린글리콜(EG)의 농도를 최소화하는 것이 기존의 유리화용액 PVS2의 빠른 침투성을 효과적으로 이용할 수 있다는 것에 착안하여 탈수과정을 단순화 시켰다. 또한 이러한 로딩 및 탈수화 과정에 관여하는 정아나 측아의 조직 내 얼음결정과 화학적 독성을 생물 물리적으로 해명하기 위하여 열역학적 분석수단인 DSC방법과 생화학적 수단인FCM방법을 이용하였다. 결과 작은방울-유리화방법에 의한 국화 정아나 신초의 생존율이나 재생율에 미치는 몇가지 중요한 요인들에 대한 구체적인 해명을 진행하였다. 또한 이 실험을 진행하기 위하여 이미 마늘을 이용하여 많은 연구를 진행한 김행훈 박사의 연구방법에 준하여 비교연구를 진행하였다. 중요하게는 실험적으로 침투성 CPA인 DMSO와 EG의 독성이 얼마나 독한지, 그리고 이를 최대한으로 줄이는 방법을 강구하는 과정에 신초 내 동결과 녹임 시 장해 유무를 구체적으로 관찰하였다. 즉 신초 내 전배양, 로딩, 탈수 시 PVS3과 PVS2를 기준으로 글리세린과 사탕, 디메틸슬폭시드와 에맅렌글리콜의 다양한 배합을 통하여 이들의 화학적 독성과 생물물리적 삼투압과 같은 여러 가지 생존율 및 재생율에 미치는 영향을 면밀히 검토하였다. 결과 정아는 4.5~5 주된 샘플, 측아는 6~7주된 샘플, 샘플의 냉각 순화를 통하여 탈수건조 저항성을 유도하는 경우 침투성 및 비(非)침투성 CPA의 농도보다는 중요하지 않다는 것을 생물 물리적으로 해명하였다. 탈수 시간도 정아인 경우는 90분, 측아인 경우는 60분이 PVS3을 이용하는 경우 재생율이 좋았다. PVS2 계열인 경우 A3(glycerol 37.5 + DMSO 15 + EG 15 + sucrose 22.5: % W/V) 적합하였다. 그리하여 동결보존을 위한 적합한 샘풀배양, 전배양, 탈수, 동결과 녹임과 언로딩 등 국화의 –196섭씨온도에서 장기보존을 실용화하기 위한 기술을 개발하였다. This study was planned for commercialization the cryopreservation protocol of chrysanthe- mum germ plasm. Therefore, the aim of this study was to investigate on the several factors of chrysanthemum (Dendranthema grandiflora T. cv. peak) shoot apices and axillary shoot tips cryopreserved using the dropet-vitrification methods. The factors include in the preculture condition of shoot apices and axillary shoot tips, loading condition, dehydration condition, thawing condition so on with PVS3 and PVS2 series solution, dehydration solution was found to effect the other bio materials’ cryopreservation. The assessment of the survival and the regeneration ratio was accounted the once of shoots survived(14d) and regenerated(28d) from cryopreserved shoot apices and axillary shoot tips in culture. These results support the necessity in order to use the regeneration obtained after cryopreservation of chrysanthemum, as this is a very useful technique for the conservation of chrysanthemum genetic resources. This study aimed at developing cryopreservation protocol for chrysanthemum shoot apices based on droplet-vitrification procedure, which is a combination of droplet-freezing and solut ion based vitrification. Progressive preculture of shoot apices in liquid MS medium supplemented with 0.3 and 0.7 M sucrose for 31 and 17 hours, respectively, was found optimum among preculture treatments tested. The composition of both loading and vitrification solutions significantly affected recovery growth of shoot tips before and after cryopreservation. Balancing glycerol and sucrose concentrations in the solutions was beneficial for recovery growth. The highest recovery after cryopreservation was observed when apical shoot tips were extracted from 4-week-old in vitro plantlets, progressively precultured with 0.3-0.5-0.7 M sucrose for 31 -17-7 hours, respectively, then treated with loading solution comprising of 2.0 M glycerol + 0.5 M sucrose (35% PVS3 solution). Apices were then dehydrated with the vitrification solution consisted of 50% glycerol + 50% sucrose for 60 minutes then directly immersed in liquid nitrogen. In plant vitrification protocols, the preculture and the loading treatment, which involves treating the explants with a moderately concentrated cryoprotectant solution, precedes dehydration of explants with highly concentrated vitrification solutions in order to reduce the toxicity which can be induced by their direct exposure to such highly concentrated solutions. This study aimed at developing alternative preculture and loading solutions composed of mixtures of glycerol and sucrose at various concentrations. Differential scanning calorimetry runs of loading solutions and of loaded and dehydrated explants were performed to assay the thermal events occurring during cooling and warming. These loading solutions were applied to two model species, viz. garlic and chrysanthemum which were cryopreserved using a droplet -vitrification procedure. The loading treatment proved to be beneficial to both garlic and chrysanthemum increased recovery of cryopreserved explants. However, response to the loading solutions tested varied between the two model species employed: with garlic, all the loading solutions had a similar effect, whereas survival of chrysanthemum shoot tips was significantly influenced by the composition of the loading solution employed. A loading solution comprising 1.9 M glycerol and 0.5 M sucrose was the most efficient. The loading treatment may thus act as an osmotic stress neutralizer and/or induce the physiological adaptation of tissues and cells, including membranes, to both dehydration and freezing. This study aimed at developing alternative vitrification solutions, modified either from the original PVS2 vitrification solution by increasing glycerol and sucrose and/or decreasing dim ethylsulfoxide and ethylene glycol concentration, or from the original PVS3 vitrification solution by decreasing glycerol and sucrose concentration. The application of these vitrification solutions to two model species, i.e. garlic and chrysanthemum in a droplet-vitrification procedure, revealed that PVS3 and variants were superior to PVS2 and variants and that most PVS2 variants were comparable to the original PVS2. Both species were sensitive to chemical toxicity of permeating cryoprotectants and chrysanthemum was also sensitive to osmotic stress. The lower recovery of cryopreserved garlic shoot apices dehydrated with PVS2 and variants compared with those dehydrated with PVS3 and variants seemed attributed to cytotoxicity of the vitrification solutions tested as well as to insufficient protection against freezing injury. Chrysanthemum shoot tips were very sensitive to both chemical toxicity and osmotic stress and therefore, induction of cytotoxity tolerance during preconditioning was required for successful cryopreservation. The present study revealed that some of the PVS2 variants tested which have increased glycerol and sucrose and/or decreased dimethylsulfoxide and ethylene gly col concentration can be applied when explants are of medium size, tolerant to chemical toxicity and moderately sensitive to osmotic stress. PVS3 and variants can be used widely when samples are heterogeneous, of large size and/or very sensitive to chemical toxicity and tole rant to osmotic stress. The optimized droplet-vitrification protocol was successfully applied to axillary shoot tips and to shoot apices of chrysanthemum, with regrowth percentages ranging between 81.9 ~84.6 %. Actually, apices(4weeks old plants), axillary shoot tips(protocol Ⅰ= 7weeks old plants, PVS3-25ºC-60 min) and axillary shoot tips(protocol Ⅱ= 7weeks old plants, A3-0ºC-55 min) was respectively studied regeneration ratio 81.9%, 84.6%, and 82.2%. This protocol should be further applied to all the most of the germplasm conservation.