지질다당질로 자극한 넙치 백혈구의 발현유전자의 분석

남보혜,문지영,김영옥,김우진,공희정,이상준,최태진,Nam, Bo-Hye,Moon, Ji-Young,Kim, Young-Ok,Kim, Woo Jin,Kong, Hee Jeong,Lee, Sang-Jun,Choi, Tae-Jin 한국해양바이오학회 2007 한국해양바이오학회지 Vol.2 No.3

넙치의 생체방어 및 면역관련 유전자의 대량확보를 위하여, 지질다당질로 자극한 넙치의 말초백혈구 cDNA library를 suppression subtractive hybridization 방법으로 제작하여 발현유전자의 발현 양상 및 특성을 분석하였다. 총 470개의 SSH 클론 중 기존에 밝혀진 유전자와 상동성을 보인 218개의 클론을 분석한 결과, 대표적인 전염증사이토카인 IL-1의 유인수용체인 IL-1RII가 34번의 가장 높은 빈도로 발현되었으며, IL-$1{\beta}$가 14번의 높은 발현 빈도를 보였다. 그 중 펩티도글리칸 인식 단백질및 혈관활성 장 펩타이드 유전자는 어류에서는 처음으로 보고되는 것으로, 지질다당질로 자극한 넙치의 말초백혈구 SSH cDNA library는 다양한 생체방어 및 면역관련 유전자를 포함하고 있었다. Suppression subtractive hybridization (SSH) was performed to construct an cDNA library of olive flounder Paralichthys olivaceus peripheral blood leukocytes (PBL) stimulated with lipopolysaccharide (LPS). Total 470 clones were randomly selected and sequenced, 214 out of 470 sequences showed identities with known genes and 252 sequences were unknown genes. Among the 218 known genes, 34 sequences were found to be homologous to IL-1RII gene, and 14 sequences were identified as IL-$1{\beta}$. RT-PCR analysis showed that IL-$1{\beta}$ mRNA was induced 1h after LPS-stimulation, and IL-1RII was increased from 3h after stimulation, indicating that most of SSH clones are associated with inflammatory responses in fish, and this SSH cDNA library would be useful to identify bio-defense and immuno-related genes in fish.

넙치(Paralichthys olivaceus) 혈청단백질의 이차원전기영동분석 조건확립

한윤희,남보혜,감영옥,김우진,공희정,이상준,최태진,Han, Yoon Hee,Nam, Bo-Hye,Kim, Young-Ok,Kim, Woo Jin,Kong, Hee Jeong,Lee, Sang Jun,Choi, Tae-Jin 한국해양바이오학회 2007 한국해양바이오학회지 Vol.2 No.1

Flounder is one of the major aquacultured fish and of an economically important item in Korean fisheries. Recently, there are trends of research worldwide that aim to analyze and characterize a whole genome or a whole proteome of interesting species. The data are utilized for the understanding and development of preventive and curative technologies for the serious diseases. However, there are very limited information of proteome for marine organisms, we optimized first the conditions for two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE) with serum form a marine fish, flounder (Paralichthys olivaceus). A pre-treatment of serum and an optimization of protein concentration analyzed were surveyed for enhancing the separation for proteins. A statistical analysis was performed on the overall 1,820 protein spots to overcome the variability among individual fishes. 넙치의 혈청 단백질체를 연구하기 위해 본 연구에서는 이차원전기영동 분석 시의 기본조건을 확립하였다. 넙치의 혈청단백질을 이차원전기영동 법으로 분석하기 위해서는 TCA 침전을 이용하여 혈청 내에 고농도로 존재하는 이온물질을 제거하는 전처리과 정이 반드시 요구되었다. 또한 분석 단백질의 농도는 $30{\mu}g$이 적당하였다. 넙치 10개체의 혈청단백질을 이용하여 총 51회의 이차원전기영동을 수행한 결과 1,8207개의 단백질로 이루어진 넙치 혈청단백질 표준 지도를 작성할 수 있었다.

Analysis of Hemolytic Microflora from the Ark Shell (Scapharca broughtonii)

Dong-Gyun Kim(김동균),Bo-Hye Nam(남보혜),Hee Jeong Kong(공희정),Woo-Jin Kim(김우진),Bong-Seok Kim(김봉석),Young-Ju Jee(지영주),Sang-Jun Lee(이상준),Choon Goo Jung(정춘구),Mi-Sun Kong(공미선),Young-Ok Kim(김영옥) 한국생명과학회 2012 생명과학회지 Vol.22 No.5

남해연안지역은 피조개(Scapharca broughtonii) 양식으로 매우 중요한 지역이나 최근 대량폐사로 인하여 생산량이 급격히 감소하였다. 이러한 대량폐사의 원인을 구명하기 위하여 다양한 환경요인들에 대한 연구는 수행되었으나, 미생물학적인 연구는 미비한 실정이다. 본 연구에서는 폐사율이 높은 강진만과 폐사발생이 적은 진해만연안 피조개 양식장의 해저 퇴적물과 피조개 체내에서 분리한 미생물 균총에 대하여 분석하였다. 각각의 샘플에 서 배양 가능한 모든 미생물을 분리하였으며, 분리한 미생물 중 알파 또는 베타 용혈활성을 보이는 미생물을 모두 동정하였다. 피조개 체내에 존재하는 용혈미생물의 균총은 해저 퇴적물 보다 낮은 다양성을 보였으며, 극히 한정된 종의 미생물이 존재함을 알 수 있었다. 강진만에서는 17속(genus) 88종(species)의 미생물을, 그리고 진해만에서는 16속 64종의 미생물을 분리할 수 있었다. 샘플 내에는 Bacillus 속의 미생물이 가장 많이 분리 되었으며, 그 중 Bacillus cereus group의 종이 가장 많고, Paenibacillus, Lynsilbacillus, 그리고 Vibrio 종 등이 그 다음으로 많이 존재하였다. 속(genus) 수준에서는 두 지역의 특별한 차이를 발견할 수 없었으나, 진해만 연안에서는 64종이 발견되었고 강진만에서는 88종이 분리되어, 강진만이 좀 더 종 수준에서의 높은 다양성을 알 수 있었다. 따라서 피조개 대량폐사의 원인은 이러한 균주의 종 수준에서의 차이에서 기인하는 것 이라고 가정할 수 있었으며, 폐사지역에서 발견되는 미생물을 이용한 감염실험을 통하여 피조개의 대량폐사 원인 균을 구명 할 예정이다. The southern coast of Korea is important for the ark shell (Scapharca broughtonii) aquaculture, but the productivity was rapidly reduced during the previous decade by mass mortality. To overcome this economic loss, investigations only focused on environmental factors, and microbiological researches were performed insufficiently. In this study, two sites (Gangjin and Jinhae bay) were selected for their high and low rate of mortality, respectively, and the existence of microflora from underwater sediments in the bodies of S. broughtonii was analyzed. We screened the whole body of each sample and chose unique colonies, which exhibit alpha- and beta-hemolytic activity, for identification. The microflora in S. broughtonii was less variable than sediments, and restricted species were isolated. We identified 17 genera of 88 species and 16 genera of 64 species from the two bays, respectively. A major proportion was comprised of Bacillus species, with the Bacillus cereus group being the most common species among the Bacillus strains, while Paenibacillus, Lynsilbacillus, and Vibrio species were the second most abundant species. At the genus level, there were no significant microbial differences between the two coastal regions. 64 species were isolated from rare site (Jinhae bay), but more species (88) with greater variety were isolated from the frequent site (Gangjin bay). Therefore, it was assumed that the cause of mass mortality lay in the difference in specie-level diversity, and conducting investigations on the diagnosis of pathogenic species by challenging tests using isolated unique species.

대하 Penaeidin 3-2 유전자의 동정 및 발현

박은미,조현국,홍경은,남보혜,김영옥,김우진,이상준,한현섭,이재용,김종식,장인권,정재훈,최태진,공희정,Park, Eun-Mi,Cho, Hyun Kook,Hong, Gyeong-Eun,Nam, Bo-Hye,Kim, Young-Ok,Kim, Woo-Jin,Lee, Sang-Jun,Han, Hyon Sob,Lee, Jae Yong,Kim, Jong-Sheek,Ja 한국해양바이오학회 2007 한국해양바이오학회지 Vol.2 No.1

Penaeidins은 새우류에 존재하는 항미생물성펩티드의 한 종류로서 새우의 외부 병원체에 대한 방어기작을 구성하는 중요한 인자이다. 본 연구에서는 대하 혈구세포의 cDNA library로부터 분리된 EST 클론을 분리 동정하였다. 아미노산 염기서열 분석과 계통수 분석을 통하여 본 연구에서 분리한 EST 클론이 대하의 Penaeidin 3-2 유전자와 아미노산 수준에서 동일함을 밝혔다. 대하의 Penaeidin 3-2는 signal peptides로 예상되는 19개 아미노산 잔기를 포함하여 전체 71개의 아미노산 잔기로 이루어져 있고, C-말단에는 3개의 이중황화결합을 형성할 수 있는 6개의 cysteine가 존재하였다. 대하 Penaeidin 3-2 전사체는 혈구세포, 간췌장, 근육 조직에서 발현되었으며, 특히 혈구세포에서 주로 많이 발현되었다. 흰반점바이러스의 인위감염 실험에서 바이러스 감염 후 대하 Penaeidin 3-2의 발현이 증가하였다. 이상의 결과들로부터 대하 Penaeidin 3-2가 자체 방어 작용에서 중요한 역할을 할 것으로 예상된다. Penaeidins are members of a special family of antimicrobial peptides existing in several species of shrimp and play a crucial role in the immunological defense of shrimp. In this study, we isolated and characterized one EST clone (penaeidin) from cDNA library of fleshy prawn Fenneropenaeus chinensis hemocytes. Amino acids sequence comparison and phylogenetic analysis with other known penaeidins revealed that our clone was completely identical to F. chinensis Penaeidin 3-2 (Accession no. ABC33920), which composed of 71 amino acids with a putative signal peptide (1-19) and a cysteine-rich domain (C-terminal part). The expression and distribution of Penaeidin 3-2 transcripts in shrimp were detected in hemocytes, hepatopancreas, and muscles, and that Penaeidin 3-2 was constitutively expressed mainly in hemocytes. The artificial infection of white spot syndrome virus to F. chinensis resulted in Penaeidin 3-2 mRNA up-regulation in hemocytes, suggesting that the possible role of Penaeidin 3-2 in host defense system of F. chinensis.

참담치(Mytilus coruscus) 유래 항균 펩타이드 분리 및 정제

오륜경(Ryunkyoung Oh),이민정(Min Jeong Lee),김영옥(Young-Ok Kim),남보혜(Bo-Hye Nam),공희정(Hee Jeong Kong),김주원(Joo-Won Kim),안철민(Cheul Min An),김동균(Dong-Gyun Kim) 한국생명과학회 2016 생명과학회지 Vol.26 No.11

항생제 남용의 문제점 및 사용제한에 따른 천연물 유래 항생제 대체제 개발을 위하여 우리나라와 중국, 일본에서만 서식하는 고유종인 참담치의 족부 근육 추출물로부터 항균 펩타이드를 분리 및 정제하였다. C18 역상 컬럼을 사용하여 항균 펩타이드를 정제하였으며, MALDI-TOF/MS로 분석 결과 분자량은 6,701 Da에 해당하였다. edman degradation 방법으로 N-말단 아미노산 서열 분석을 통하여 20개의 아미노산 서열을 밝혔으며 이는 캘리포니아 홍합(Mytilus californianus)의 sperm-specific protein 또는 protamine-like PL-II/PL-IV precursor와 100% 상동성을 지님을 밝혀냈다. 이러한 정보를 바탕으로 ORF를 분석한 결과 60개의 아미노산을 코딩하는 183 bp로 캘리포니아 홍합의 protamine-like PL-II/PL-IV precursor와 아미노산 서열이 100% 일치하였고 유전자 염기서열은 97.2%의 상동성을 나타냈다. 합성된 항균 펩타이드는 그람 양성 균주 Bacillus cereus (MEC, 20.8 μg/ml), Bacillus subtilis(MEC, 0.2 μg/ml), Streptococcus mutans (MEC, 0.2 μg/ml), 그람 음성 균주 Pseudomonas aeruginosa (MEC, 5.7 μg/ml), Escherichia coli (MEC, 2.6 μg/ml) 그리고 진균류 Candida albicans (MEC, 56.3 μg/ml)의 항균활성을 나타냈다. 또한 높은 열안정성을 지녔으며, C. albicans를 제외하고 염안정성을 지닌 항균 펩타이드로 확인되었다. 이를 통해 참담치 유래의 항균 펩타이드는 항생제 대체제의 후보소재로 높은 가능성을 지녔다고 할 수 있다. 따라서 본 연구에서 분리한 참담치 족부 근육 유래 항균 펩타이드는 향후 추가적인 연구를 통하여 항생제를 대체할 수 있는 물질의 개발이 가능할 것으로 사료된다. 그리고 해양무척추동물의 선천성 면역 기작에 대한 정보를 제공할 것으로 기대한다. In this study, we investigated antimicrobial peptide from the acidified muscle extract of Mytilus coruscus, which mostly inhabits China, Japan, and Korea, to develop a natural product-derived antibiotics substitution in terms of its abuse and restriction. Antimicrobial peptide was purified by C18 reversed-phase high-performance liquid chromatography and was detected as having a molecular mass of 6,701 Da by MALDI-TOF/MS. The N-terminal amino acid sequence of the purified peak was obtained from edman degradation, and 20 identified residues shown 100% identity with the N-terminus region of sperm-specific protein and protamine-like PL-II/PL-IV precursor of Mytilus californianus. We also identified 60 open-reading frame (ORF) encoding amino acids with 183 bp of purified peptide based on the obtained amino acid residues. The amino acid sequence of ORF showed 100% and the nucleotide sequence revealed 97.2% identity with the protamine-like PL-II/PL-IV precursor of Mytilus californianus. Synthesized antimicrobial peptide showed antimicrobial activity against gram-positive bacteria, including Bacillus cereus (minimal effective concentration [MEC], 20.8 μg/ml), Bacillus subtilis (MEC, 0.2 μg/ ml), Streptococcus mutans (MEC, 0.2 μg/ml), gram-negative bacteria including Pseudomonas aeruginosa (MEC, 5.7 μg/ml), Escherichia coli (MEC, 2.6 μg/ml) and fungi, Candida albicans (MEC, 56.3 μg/ml). In addition, synthesized peptide showed stable activities under heat and salt conditions against gram-positive and gram-negative bacteria, but was inhibited by salt against only C. albicans. With these results, isolated peptide from M. coruscus could be an alternative agent to antibiotics for defending against pathogenic microorganisms, and helpful information to understand the innate immune system of marine invertebrates.

The Study of Genetic Diversity and Population Structure of the Korean Fleshy Shrimp, Fenneropenaeus chinensis, Using Newly Developed Microsatellite Markers

Eun-Ha Shin(신은하),Hee Jeong Kong(공희정),Bo-Hye Nam(남보혜),Young-Ok Kim(김영옥),Bong-Seok Kim(김봉석),Dong-Gyun Kim(김동균),Cheul Min An(안철민),Hyungtaek Jung(정형택),Woo-Jin Kim(김우진) 한국생명과학회 2015 생명과학회지 Vol.25 No.12

대하(Fenneropenaeus chinensis)는 우리나라에서 경제적으로 가장 중요한 양식생물 중 하나이다. 그러나 대하의 유전적 특성에 대한 연구는 전무하다. 본 연구에서는 새로 개발된 13개 미세위성체 유전자좌를 이용하여 우리나라에 서식하는 4개 지역 대하의 유전 다양성 및 집단간 관련성을 분석하였다. 평균 대립유전자 richness =16.87, 평균 이형접합률 =0.845를 보여 유전 다양성은 비교적 높은 수준을 보였다. 52개 유전좌중에서 13개 유전자좌가 집단간 분석에서 Hardy–Weinberg 평형에서 유의적인 차이로 벗어났다. Neighbor-joining, principal coordinate 및 molecular variance 분석 결과로 우리나라 대하 집단은 3개 집단(나라도, 천수만, 법성포 및 채석포)으로 구성되어 있으며, 이 결과는 유전적 거리에 근거한 군집 결과와 일치하였다. 본 연구에서 조사된 유전 다양성 및 분화결과는 앞으로 대하의 지속 가능한 자원관리 및 선발 육종을 통한 유전적 개량에 적용될 수 있을 것이다. The fleshy shrimp, Fenneropenaeus chinensis, is the family of Penaeidae and one of the most economically important marine culture species in Korea. However, its genetic characteristics have never been studied. In this study, a total of 240 wild F. chinensis individuals were collected from four locations as follows: Narodo (NRD, n = 60), Beopseongpo (BSP, n = 60), Chaesukpo (CSP, n = 60), and Cheonsuman (CSM, n = 60). Genetic variability and the relationships among four wild F. chinensis populations were analyzed using 13 newly developed microsatellite loci. Relatively high levels of genetic variability (mean allelic richness = 16.87; mean heterozygosity = 0.845) were found among localities. Among the 52 population loci, 13 showed significant deviation from the Hardy–Weinberg equilibrium. Neighbor-joining, principal coordinate, and molecular variance analyses revealed the presence of three subpopulations (NRD, CSM, BSP and CSP), which was consistent with clustering based on genetic distance. The mean observed heterozygosity values of the NRD, CSM, BSP, and CSP populations were 0.724, 0.821, 0.814, and 0.785 over all loci, respectively. These genetic variability and differentiation results of the four wild populations can be applied for future genetic improvement using selective breeding and to design suitable management guidelines for Korean F. chinensis culture.

참담치(Mytilus coruscus) 혈구(hemocyte)에서 분리한 McSSP-31의 항균 특성 분석

오륜경(Ryunkyoung Oh),이민정(Min Jeong Lee),김영옥(Young-Ok Kim),남보혜(Bo-Hye Nam),공희정(Hee Jeong Kong),김주원(Joo-Won Kim),박중연(Jung-Youn Park),서정길(Jung-Kil Seo),김동균(Dong-Gyun Kim) 한국생명과학회 2017 생명과학회지 Vol.27 No.11

참담치 hemocyte에 존재하는 항균 펩타이드를 역상 HPLC column을 사용하여 분리 및 정제하였다. 정제된 펩타이드는 matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrophotometer (MALDI-TOF/MS) 분석을 통해 분자량이 3330.549 Da이며, edman 분해법을 통해 14개의 N-말단 아미노산 서열을 확보하였다. 분석한 N-말단 서열은 M. californianus의 sperm-specific protein Phi-1과 protamine-like PL-III protein과 각각 93%와 87%의 유사도를 나타냈으며, M. edulis의 sperm-specific protein Phi-1과 87% 일치함을 확인하였다. 또한 openreading frame (ORF)은 306 bp의 길이에 101개의 아미노산을 코딩하고 있음을 밝혔으며, 이는 M. californianus의 sperm-specific protein Phi-1와 93.5% 유사하였다. 분자량과 아미노산 서열에 근거하여 31개 아미노산으로 구성된 펩타이드를 합성하였으며 이는 그람 양성균인 B. subtilis, S. mutans, S. aureus와 그람 음성균인 E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, P. aeruginosa 그리고 진균류인 C. albicans에 항균 활성을 보였다. 합성한 펩타이드는 항생제 내성균주인 S. aureus CCARM 0203와 S. aureus CCARM 0204에 항균 활성을 보였다. 합성 항균 펩타이드는 넙치 혈장에 대한 용혈현상은 없었고, 세포독성을 확인한 결과 HUVEC cell line에 전혀 독성을 보이지 않았다. 본 연구결과, 참담치의 혈구로부터 분리 및 정제한 sperm-specific protein 유래 항균 펩타이드는 다양한 균주에 항균 활성을 보였고 낮은 세포독성을 가졌으며, 이러한 특성은 본 실험에서 분리한 항균 펩타이드가 항생제 대체재로서 개발 가능성을 제시하고 있다. This study isolated and purified the antimicrobial peptide McSSP-31 from an acidified hemocyte extract of a Mytilus coruscus. The antimicrobial peptide was purified by using a C18 reversed-phase high-performance liquid chromatography (HPLC). The peptide was determined to be 3330.549 Da by matrix assisted–laser desorption ionization time-of-flight mass spectrophotometer (MALDI- TOF/MS). The N-terminus of a 14 amino-acid sequence was identified as P-S-P-T-R-R-S-T-S-R-S-K-S-R by Edman degradation method. The acquired sequence showed a 93% similarity with the sperm-specific protein Phi-1, which is from M. californianus. The identified open-reading frame (ORF) of peptide was 306 bp encoding 101 amino acids, which was analyzed by rapid amplification of cDNA ends (RACE), cloning and sequencing analysis. We compared the full sequence with other known proteins that reveal the sperm-specific protein Phi-1 (93.5%) of M. californianus. Synthesized antimicrobial peptide (McSSP-31) showed antibacterial activity against gram-positive bacteria including B. subtilis, S. mutans, S. aureus and gram-negative bacteria including E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, P. aeruginosa and fungi, C. albicans. Also, synthesized peptide showed strong antibacterial activity against antibiotic-resistant strains, including S. aureus. The cytotoxicity of the peptide was determined by using the HUVEC human cell line. The peptide did not exhibit any significant cytotoxic effects on the normal human cell line, and it had very low hemolytic activity with flounder hemoglobin. The results demonstrated that peptide purified from the hemocyte of a M. coruscus exhibits antibacterial activity against various bacteria and has the potential to be an alternative antibiotic agent.

피조개 양식장 내 용혈성 미생물의 다양성 분석

권병근 ( Byeong Geun Gwon ),김영옥 ( Young Ok Kim ),남보혜 ( Bo Hye Nam ),김우진 ( Woo Jin Kim ),공희정 ( Hee Jeong Kong ),김봉석 ( Bong Seok Kim ),지영주 ( Young Ju Jee ),이상준 ( Sang Jun Lee ),안철민 ( Cheul Min An ),김동균 ( D 한국어병학회 2013 한국어병학회지 Vol.26 No.3

피조개, Scapharca broughtonii는 돌조개 과에 속하는 이매패류로 한국과 일본에서 매우 중요한 수산식품이며, 주로 국내 남해안 지역에서 양식되고 있다. 그러나 피조개 생산량은 여름철 대량폐사로 인하여 지난 10년 동안 급격하게 감소하였다. 대량폐사로 인한 경제적인 손실을 해결하기 위하여 피조개의 생리에 영향을 미치는 다양한 환경 인자에 대한 연구가 집중적으로 수행되어 왔으나 미생물학적인 연구는 미진한 실정이다. 본 연구에서는 피조개의 주요 혈액성분인 헤모글로빈이 미생물의 병원성인자에 의하여 피해를 받아 발생하는 용혈현상과 피조개의 폐사와의 연관성을 규명하기 위하여 피조개 양식장의 용혈활성 미생물을 중심으로 분석하였다. 여름철 고수온기인 6월부터 9월까지 강진만과 진해만 피조개 양식장의 해저퇴적물과 피조개 체내에서 분리한 약4,200여점의 배양가능 용혈성 미생물의 다양성 및 지역 특이적인 미생물을 분석하였다. 6월에 25속 118종, 7월에 24 속 89종, 8월에 30속 109종, 그리고 39속141종의 미생물을 분리하였으며, 16S rDNA 정보를 통하여 지역별 미생물 다양성을 분석한 결과 폐사빈발 지역에서만 특이적으로 존재하는 140종의 미생물을 분리하였다. 이러한 지역 특이적 미생물 균총 연구는 피조개 대량폐사 원인 규명의 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 사료되며 나아가 다양한 패류의 폐사연구에도 기여할 것으로 기대된다. The ark shell, Scapharca broughtonii is a marine bivalve mollusks belonging to the family Arcidae and important seafood for Korean and Japanese, and southern coast is brisk bays for the ark shell aquaculture. However, productivity of ark shell from these regions were rapidly reduced during the last decade due to mass mortality. The reason of this great damage has not yet been identified. To overcome this economic loss, diverse investigations were focused on environmental factors that affects in the physiology of S. broughtonii, but microbiological researches were performed insufficiently. Hemoglobin is one of the major blood component of ark shell and is damaged by some species of bacterial toxins. We concentrated on this red pigment because hemolysis could be the cause of ark shell mortality. In this study, we analyzed microbial diversity of underwater sediments in coastal regions and also existences in the body of S. broughtonii. We investigate about 4,200 isolates collected from June to September for microbial diversity of sediments and ark shell. We screened all of culturable microorganisms, and identified 25 genera 118 species, 24 genera 89 species, 30 genera 109 species and 39 genera 141 species, and selected 140 unique colonies for identification and challenge assay.

RAPD 기법을 이용한 갈파래목 해조류의 유전 변이 분석

조용철(Yong Chul Cho),박지원(Ji Won Park),진형주(Hyung Joo Jin),남보혜(Bo Hye Nam),손철현(Chul Hyun Sohn),홍용기(Yong Ki Hong) 한국수산과학회 1997 한국수산과학회지 Vol.30 No.3

The random amplified polymorphic DNAs (RAPD) technique was used to characterize seven isolates of the green seaweed Ulvales collected from Songjeng, Haeundae, Jumunjin, Dadaepo and Wando in Korea. Total DNA was extracted by the LiCI extraction method from thalli of green seaweed. The extracted DNA (3 ng) in 25 ㎕ reaction volume was amplified by 45 cycles of the polymerase chain reaction with arbitrary primers. Thirty-four primers resulted in 1227 PCR products ranged 240 bp to 1.5 kb of both conserved and polymorphic bands. Genetic similarities of the seven isolates calculated by Jaccard`s equation were ranged from 7% to 36%. Monostroma nitidum (Wando) was shown to be most distantly related with the others based on genetic similarity and did not produce the amplified band of 630 bp, common in Ulvales using primer OPB-01 (CATCCCCCTG).

참담치(Mytilus coruscus) 혈구(hemocyte) 유래 항균 펩타이드 mytilin B의 정제 및 특성 분석

이민정(Min Jeong Lee),오륜경(Ryunkyoung Oh),김영옥(Young-Ok Kim),남보혜(Bo-Hye Nam),공희정(Hee Jeong Kong),김주원(Joo-Won Kim),박중연(Jung Youn Park),서정길(Jung-Kil Seo),김동균(Dong-Gyun Kim) 한국생명과학회 2018 생명과학회지 Vol.28 No.11

참담치(Mytilus coruscus)의 혈구 유래의 항균 펩타이드를 역상 column들을 사용한 reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC)로 분리 및 정제하였다. 정제된 펩타이드는 matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrophotometer (MALDI-TOF/MS)를 통해 분자량이 4041.866 Da으로 밝혀졌으며 Edman degradation법을 통해 25개의 N-말단 서열을 확보하였다. 이는 참담치의 mytilin B precursor 와 100%, mytilin 8 precursor, mytilin 4 precursor와 96% 일치하였다. 또한 103개의 아미노산 서열을 코딩하고 있는 312 bp의 open-reading frame (ORF)을 밝혔으며 이는 참담치의 mytilin B precursor와 100% 일치하였다. 밝혀진 분자량과 아미노산 서열을 바탕으로 C-말단 alanine 잔기의 유무에 따라 2개의 펩타이드를 합성하였으며 이는 mytilin B1과 B2라고 명명하였다. 이들은 그람 양성 균주 Bacillus cereus, Streptococcus parauberis [minimal effective concentrations, MECs 41.6-89.7 μg/ml], 그람 음성 균주 Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio ichthyoenteri [MECs 7.4-39.5 μg/ml] 그리고 진균류인 Candida albicans [MECs 26.0-31.8 μg/ml]에 항균활성을 나타냈다. 본 연구 결과, 참담치 혈구유래 mytilin B1과 mytilin B2는 넓은 항균 스펙트럼을 가지고 열과 염분에 대한 안정성이 높으며 용혈현상과 세포독성은 나타나지 않았다. 이러한 특성은 기능성 사료첨가제 및 항생제 대체제로써 충분히 안정적인 역할을 할 뿐만 아니라 추후 mytilin의 구조적 중요성과 참담치의 면역학적 측면에서 다양한 자료를 제시할 것으로 사료된다. We purified an antimicrobial peptide from the acidified hemocyte extract of Mytilus coruscus by C18 reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). The peptide was 4041.866 Da based on matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrophotometer (MALDITOF/MS) and the 25 amino acids of the N-terminus sequence were identified. Comparison of this sequence of the purified peptide with the N-terminus sequences of other antimicrobial peptides revealed 100% identity with the mytilin B precursor of Mytilus coruscus. We also identified a 312 bp open-reading frame (ORF) encoding 103 amino acids based on the obtained amino acid residues. The nucleotide sequence of this ORF and the amino acid sequence also revealed 100% identity with the mytilin B precursor of Mytilus coruscus. We synthesized two antimicrobial peptides with an alanine residue in the C-terminus, and designated them mytilin B1 and B2. These two antimicrobial peptides showed antimicrobial activity against gram-positive bacteria, including Bacillus cereus and Streptococcus parauberis (minimal effective concentration, MECs 41.6-89.7 μg/ml), gram-negative bacteria, including Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, and Vibrio ichthyoenteri (MECs 7.4-39.5 μg/ml), and the fungus Candida albicans (MECs 26.0-31.8 μg/ml). This antimicrobial activity was stable under heat and salt conditions. Furthermore, the peptides did not exhibit significant hemolytic activity or cytotoxic effects. These results suggest that mytilin B could be applied as alternative antibiotic agent, and they add to the understanding of the innate immunity of hard-shelled mussels.