Lipopolysaccharide 생합성에 관여하는 Vibrio anguillarum의 phosphomannomutase/phosphoglucomutase 유전자 cloning과 특성

오륜경 ( Ryunkyoung Oh ),문수영 ( Soo Young Moon ),조화진 ( Hwa Jin Cho ),장원제 ( Won Je Jang ),김장호 ( Jang Ho Kim ),이종민 ( Jong Min Lee ),공인수 ( In Soo Kong ) 한국미생물생명공학회(구 한국산업미생물학회) 2016 한국미생물·생명공학회지 Vol.44 No.3

수해양성 병원성 미생물로 알려진 Vibrio anguillarum으로부터 mannose-1-phosphate를 mannose-6-phosphate, glucose-1-phosphate를 glucose-6-phosphate로 가역적으로 변환시키는 phosphomannomutase/phosphoglucomutase (pmm/pgm)의 유전자를 sequencing하여 1338 bp의 open reading frame (ORF)을 밝혔다. 이는 446개의 아미노산을 포함하며 47,625 Da을 가지고 있다. 보고된 다른 Vibrio sp. 의 pmm/pgm 유전자와 상동성을 비교하였을 때 V. mimicus V. vulnificus, V. splendidus, V. harveyi와 92.3%, 91.4%, 89.9%, 89.9%에 해당하는 상동성을 지니고 있었다. 증폭된 목적 유전자를 pET-28a(+) vector에 연결하여 대장균에서 단백질의 대량발현을 유도하였으며 이는 주로 soluble한 상태로 나왔다. Soluble fraction을 Ni-NTA column chromatography로 정제하여 약 50 kDa의 단백질을 얻었고 이는 주로 mannose-1-phosphate를 이용하는 효소로 확인되었으며 Mg2+ 이온이 존재할 때 효소의 활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구의 유전자는 낮은 온도의 stress하에서 발현이 증가됨을 Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)을 통해 확인하였고, 상동성 재조합 (homologous recombination)에 의한 돌연변이 균주 제작을 통해 PMM/PGM protein과 lipopolysaccharide (LPS)의 생합성과의 관계를 규명하였다. V. anguillarum wild type과 mutant로부터 LPS를 분리하였고 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE)후 silver staining을 통해 LPS의 high molecular weight (HMW) 부분인 O-antigen에서의 변화를 확인하였다. 또한 V. anguillarum wild type과 mutant의 growth와 viability를 확인한 결과 mutant가 wild type보다 정지기까지 더 낮은 생육을 보였으며 viability가 감소함을 확인하였다. 본 연구를 통하여 V. anguillarum의 pmm/pgm 유전자가 미생물의 생육과 LPS 생합성에 관여하고 있음을 알 수있었다. The phosphomannomutase/phosphoglucomutase gene (pmm/pgm) of Vibrio anguillarum (the causative agent of fish vibriosis) was cloned, and the open reading frame corresponded to a protein with 446 amino acids. The pmm/pgm gene showed a significant degree of sequence homology with the previously reported genes from V. mimicus, V. vulnificus, V. splendidus, and V. harveyi, with 92.3%, 91.4%, 89.9%, and 89.9% amino acid identity, respectively. By reverse transcriptase-polymerase chain reaction, we found that the pmm/pgm gene was upregulated under cold stress condition. The PMM/PGM protein is known to catalyze the interconversion between mannose-1-phosphate and mannose-6-phosphate or glucose 1 phosphate and glucose-6-phosphate, which are important intermediates for lipopolysaccharide (LPS) biosynthesis. To confirm the role of PMM/PGM in the LPS biosynthetic pathway, we constructed a knock out mutant by homologous recombination. The respective LPSs were isolated from the V. anguillarum wild-type and mutant strains, and changes were compared by subjecting them to sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Based on the different patterns of the LPSs, we expect the pmm/pgm gene to have an important role in LPS biosynthesis. The pmm/pgm-deficient mutant of V. anguillarum will contribute to further studies about the role of LPS in V. anguillarum pathogenesis.

참담치(Mytilus coruscus) 혈구(hemocyte)에서 분리한 McSSP-31의 항균 특성 분석

오륜경(Ryunkyoung Oh),이민정(Min Jeong Lee),김영옥(Young-Ok Kim),남보혜(Bo-Hye Nam),공희정(Hee Jeong Kong),김주원(Joo-Won Kim),박중연(Jung-Youn Park),서정길(Jung-Kil Seo),김동균(Dong-Gyun Kim) 한국생명과학회 2017 생명과학회지 Vol.27 No.11

참담치 hemocyte에 존재하는 항균 펩타이드를 역상 HPLC column을 사용하여 분리 및 정제하였다. 정제된 펩타이드는 matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrophotometer (MALDI-TOF/MS) 분석을 통해 분자량이 3330.549 Da이며, edman 분해법을 통해 14개의 N-말단 아미노산 서열을 확보하였다. 분석한 N-말단 서열은 M. californianus의 sperm-specific protein Phi-1과 protamine-like PL-III protein과 각각 93%와 87%의 유사도를 나타냈으며, M. edulis의 sperm-specific protein Phi-1과 87% 일치함을 확인하였다. 또한 openreading frame (ORF)은 306 bp의 길이에 101개의 아미노산을 코딩하고 있음을 밝혔으며, 이는 M. californianus의 sperm-specific protein Phi-1와 93.5% 유사하였다. 분자량과 아미노산 서열에 근거하여 31개 아미노산으로 구성된 펩타이드를 합성하였으며 이는 그람 양성균인 B. subtilis, S. mutans, S. aureus와 그람 음성균인 E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, P. aeruginosa 그리고 진균류인 C. albicans에 항균 활성을 보였다. 합성한 펩타이드는 항생제 내성균주인 S. aureus CCARM 0203와 S. aureus CCARM 0204에 항균 활성을 보였다. 합성 항균 펩타이드는 넙치 혈장에 대한 용혈현상은 없었고, 세포독성을 확인한 결과 HUVEC cell line에 전혀 독성을 보이지 않았다. 본 연구결과, 참담치의 혈구로부터 분리 및 정제한 sperm-specific protein 유래 항균 펩타이드는 다양한 균주에 항균 활성을 보였고 낮은 세포독성을 가졌으며, 이러한 특성은 본 실험에서 분리한 항균 펩타이드가 항생제 대체재로서 개발 가능성을 제시하고 있다. This study isolated and purified the antimicrobial peptide McSSP-31 from an acidified hemocyte extract of a Mytilus coruscus. The antimicrobial peptide was purified by using a C18 reversed-phase high-performance liquid chromatography (HPLC). The peptide was determined to be 3330.549 Da by matrix assisted–laser desorption ionization time-of-flight mass spectrophotometer (MALDI- TOF/MS). The N-terminus of a 14 amino-acid sequence was identified as P-S-P-T-R-R-S-T-S-R-S-K-S-R by Edman degradation method. The acquired sequence showed a 93% similarity with the sperm-specific protein Phi-1, which is from M. californianus. The identified open-reading frame (ORF) of peptide was 306 bp encoding 101 amino acids, which was analyzed by rapid amplification of cDNA ends (RACE), cloning and sequencing analysis. We compared the full sequence with other known proteins that reveal the sperm-specific protein Phi-1 (93.5%) of M. californianus. Synthesized antimicrobial peptide (McSSP-31) showed antibacterial activity against gram-positive bacteria including B. subtilis, S. mutans, S. aureus and gram-negative bacteria including E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, P. aeruginosa and fungi, C. albicans. Also, synthesized peptide showed strong antibacterial activity against antibiotic-resistant strains, including S. aureus. The cytotoxicity of the peptide was determined by using the HUVEC human cell line. The peptide did not exhibit any significant cytotoxic effects on the normal human cell line, and it had very low hemolytic activity with flounder hemoglobin. The results demonstrated that peptide purified from the hemocyte of a M. coruscus exhibits antibacterial activity against various bacteria and has the potential to be an alternative antibiotic agent.

참담치(Mytilus coruscus) 유래 항균 펩타이드 분리 및 정제

오륜경(Ryunkyoung Oh),이민정(Min Jeong Lee),김영옥(Young-Ok Kim),남보혜(Bo-Hye Nam),공희정(Hee Jeong Kong),김주원(Joo-Won Kim),안철민(Cheul Min An),김동균(Dong-Gyun Kim) 한국생명과학회 2016 생명과학회지 Vol.26 No.11

항생제 남용의 문제점 및 사용제한에 따른 천연물 유래 항생제 대체제 개발을 위하여 우리나라와 중국, 일본에서만 서식하는 고유종인 참담치의 족부 근육 추출물로부터 항균 펩타이드를 분리 및 정제하였다. C18 역상 컬럼을 사용하여 항균 펩타이드를 정제하였으며, MALDI-TOF/MS로 분석 결과 분자량은 6,701 Da에 해당하였다. edman degradation 방법으로 N-말단 아미노산 서열 분석을 통하여 20개의 아미노산 서열을 밝혔으며 이는 캘리포니아 홍합(Mytilus californianus)의 sperm-specific protein 또는 protamine-like PL-II/PL-IV precursor와 100% 상동성을 지님을 밝혀냈다. 이러한 정보를 바탕으로 ORF를 분석한 결과 60개의 아미노산을 코딩하는 183 bp로 캘리포니아 홍합의 protamine-like PL-II/PL-IV precursor와 아미노산 서열이 100% 일치하였고 유전자 염기서열은 97.2%의 상동성을 나타냈다. 합성된 항균 펩타이드는 그람 양성 균주 Bacillus cereus (MEC, 20.8 μg/ml), Bacillus subtilis(MEC, 0.2 μg/ml), Streptococcus mutans (MEC, 0.2 μg/ml), 그람 음성 균주 Pseudomonas aeruginosa (MEC, 5.7 μg/ml), Escherichia coli (MEC, 2.6 μg/ml) 그리고 진균류 Candida albicans (MEC, 56.3 μg/ml)의 항균활성을 나타냈다. 또한 높은 열안정성을 지녔으며, C. albicans를 제외하고 염안정성을 지닌 항균 펩타이드로 확인되었다. 이를 통해 참담치 유래의 항균 펩타이드는 항생제 대체제의 후보소재로 높은 가능성을 지녔다고 할 수 있다. 따라서 본 연구에서 분리한 참담치 족부 근육 유래 항균 펩타이드는 향후 추가적인 연구를 통하여 항생제를 대체할 수 있는 물질의 개발이 가능할 것으로 사료된다. 그리고 해양무척추동물의 선천성 면역 기작에 대한 정보를 제공할 것으로 기대한다. In this study, we investigated antimicrobial peptide from the acidified muscle extract of Mytilus coruscus, which mostly inhabits China, Japan, and Korea, to develop a natural product-derived antibiotics substitution in terms of its abuse and restriction. Antimicrobial peptide was purified by C18 reversed-phase high-performance liquid chromatography and was detected as having a molecular mass of 6,701 Da by MALDI-TOF/MS. The N-terminal amino acid sequence of the purified peak was obtained from edman degradation, and 20 identified residues shown 100% identity with the N-terminus region of sperm-specific protein and protamine-like PL-II/PL-IV precursor of Mytilus californianus. We also identified 60 open-reading frame (ORF) encoding amino acids with 183 bp of purified peptide based on the obtained amino acid residues. The amino acid sequence of ORF showed 100% and the nucleotide sequence revealed 97.2% identity with the protamine-like PL-II/PL-IV precursor of Mytilus californianus. Synthesized antimicrobial peptide showed antimicrobial activity against gram-positive bacteria, including Bacillus cereus (minimal effective concentration [MEC], 20.8 μg/ml), Bacillus subtilis (MEC, 0.2 μg/ ml), Streptococcus mutans (MEC, 0.2 μg/ml), gram-negative bacteria including Pseudomonas aeruginosa (MEC, 5.7 μg/ml), Escherichia coli (MEC, 2.6 μg/ml) and fungi, Candida albicans (MEC, 56.3 μg/ml). In addition, synthesized peptide showed stable activities under heat and salt conditions against gram-positive and gram-negative bacteria, but was inhibited by salt against only C. albicans. With these results, isolated peptide from M. coruscus could be an alternative agent to antibiotics for defending against pathogenic microorganisms, and helpful information to understand the innate immune system of marine invertebrates.

참담치(Mytilus coruscus) 혈구(hemocyte) 유래 항균 펩타이드 mytilin B의 정제 및 특성 분석

이민정(Min Jeong Lee),오륜경(Ryunkyoung Oh),김영옥(Young-Ok Kim),남보혜(Bo-Hye Nam),공희정(Hee Jeong Kong),김주원(Joo-Won Kim),박중연(Jung Youn Park),서정길(Jung-Kil Seo),김동균(Dong-Gyun Kim) 한국생명과학회 2018 생명과학회지 Vol.28 No.11

참담치(Mytilus coruscus)의 혈구 유래의 항균 펩타이드를 역상 column들을 사용한 reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC)로 분리 및 정제하였다. 정제된 펩타이드는 matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrophotometer (MALDI-TOF/MS)를 통해 분자량이 4041.866 Da으로 밝혀졌으며 Edman degradation법을 통해 25개의 N-말단 서열을 확보하였다. 이는 참담치의 mytilin B precursor 와 100%, mytilin 8 precursor, mytilin 4 precursor와 96% 일치하였다. 또한 103개의 아미노산 서열을 코딩하고 있는 312 bp의 open-reading frame (ORF)을 밝혔으며 이는 참담치의 mytilin B precursor와 100% 일치하였다. 밝혀진 분자량과 아미노산 서열을 바탕으로 C-말단 alanine 잔기의 유무에 따라 2개의 펩타이드를 합성하였으며 이는 mytilin B1과 B2라고 명명하였다. 이들은 그람 양성 균주 Bacillus cereus, Streptococcus parauberis [minimal effective concentrations, MECs 41.6-89.7 μg/ml], 그람 음성 균주 Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio ichthyoenteri [MECs 7.4-39.5 μg/ml] 그리고 진균류인 Candida albicans [MECs 26.0-31.8 μg/ml]에 항균활성을 나타냈다. 본 연구 결과, 참담치 혈구유래 mytilin B1과 mytilin B2는 넓은 항균 스펙트럼을 가지고 열과 염분에 대한 안정성이 높으며 용혈현상과 세포독성은 나타나지 않았다. 이러한 특성은 기능성 사료첨가제 및 항생제 대체제로써 충분히 안정적인 역할을 할 뿐만 아니라 추후 mytilin의 구조적 중요성과 참담치의 면역학적 측면에서 다양한 자료를 제시할 것으로 사료된다. We purified an antimicrobial peptide from the acidified hemocyte extract of Mytilus coruscus by C18 reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). The peptide was 4041.866 Da based on matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrophotometer (MALDITOF/MS) and the 25 amino acids of the N-terminus sequence were identified. Comparison of this sequence of the purified peptide with the N-terminus sequences of other antimicrobial peptides revealed 100% identity with the mytilin B precursor of Mytilus coruscus. We also identified a 312 bp open-reading frame (ORF) encoding 103 amino acids based on the obtained amino acid residues. The nucleotide sequence of this ORF and the amino acid sequence also revealed 100% identity with the mytilin B precursor of Mytilus coruscus. We synthesized two antimicrobial peptides with an alanine residue in the C-terminus, and designated them mytilin B1 and B2. These two antimicrobial peptides showed antimicrobial activity against gram-positive bacteria, including Bacillus cereus and Streptococcus parauberis (minimal effective concentration, MECs 41.6-89.7 μg/ml), gram-negative bacteria, including Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, and Vibrio ichthyoenteri (MECs 7.4-39.5 μg/ml), and the fungus Candida albicans (MECs 26.0-31.8 μg/ml). This antimicrobial activity was stable under heat and salt conditions. Furthermore, the peptides did not exhibit significant hemolytic activity or cytotoxic effects. These results suggest that mytilin B could be applied as alternative antibiotic agent, and they add to the understanding of the innate immunity of hard-shelled mussels.