우리나라 옥수수산지에서 분리한 Fusarium sporotrichioides 균주들에 의한 T-2 독소 및 관련 대사물의 생성

이인원,김국형,정후섭 ( Yin Won Lee,Kook Hyung Kim,Hoo Sup Chung ) 한국균학회 1990 韓國菌學會誌 Vol.18 No.1

Contamination of Fusarium Mycotoxins in Corn Samples Imported from China

강효중,김진철,서정아,이인원,손동화,Kang, Hyo-Jung,Kim, Jin-Cheol,Seo, Jeong-Ah,Lee, Yin-Won,Son, Dong-Hwa 한국응용생명화학회 1994 Applied Biological Chemistry (Appl Biol Chem) Vol.37 No.5

중국으로부터 수입한 68개의 옥수수시료에서 Fusarium진균독소의 오염을 조사하였다. 수입옥수수에서 eoxynivalenol(DON), 15-acetyldeoxynivalenol(15-ADON), 3-acetyldeoxynivalenol(3-ADON) 및 nivalenol(NIV) 등 4가지의 8-ketotrichothecene이 검출되었다. 또한 zearalenone(ZEA), fumonisin $B_1(FB_1)$, fumonisin $B_2(FB_2)$ 그리고 fumonisin $B_3(FB_3)$도 검출되었다. DON, 15-ADON, 3-ADON, ZEA 그리고 $FB_1$이 주요 오염독소였으며, 이들 독소의 평균오염농도는 각각 277, 34, 37, 39, 그리고 123 ng/g이었다. The occurrence of Fusarium mycotoxins was surveyed in 68 corn samples imported from China. Four 8-ketotrichothecenes including deoxynivalenol (DON), 15-acetyldeoxynivalenol (15-ADON), 3-acetyldeoxynivalenol (3-ADON), and nivalenol (NIV) were detected in corn. In addition, the corn samples were contaminated with zearalenone (ZEA), fumonisin $B_1$, $(FB_1)$, fumonisin $B_2$, and fumonisin $B_3$. DON, 15-ADON, 3-ADON, ZEA, and $FB_1$ were major contaminants in corn, with mean levels of 277, 34, 37, 39, and 123 ng/g, respectively.

중국으로부터 수입한 옥수수에서의 Fusarium 진균독소오염

강효중(Hyo Jung Kang),김진철(Jin Cheol Kim),서장아(Jeong Ah Seo),이인원(Yin Won Lee),손동화(Dong Hwa Son) 한국응용생명화학회 1994 Applied Biological Chemistry (Appl Biol Chem) Vol.37 No.5

The occurrence of Fusarium mycotoxins was surveyed in 68 corn samples imported from China. Four 8-ketotrichothecenes including deoxynivalenol (DON), 15-acetyldeoxynivalenol (15-ADON), 3-acetyldeoxynivalenol (3-ADON), and nivalenol (NIV) were detected in corn. In addition, the corn samples were contaminated with zearalenone (ZEA), fumonisin B₁, (FB₁), fumonisin B₂, and fumonisin B₃. DON, 15-ADON, 3-ADON, ZEA, and FB₁, were major contaminants in corn, with mean levels of 277, 34, 37, 39, and 123 ng/g, respectively.

희석에 의한 우유 중 Aflatoxin M<SUB>1</SUB>의 효소면역측정법

손동화(Dong-Hwa Shon),임선희(Sun-Hee Lim),이인원(Yin-Won Lee) 한국식품과학회 1996 한국식품과학회지 Vol.28 No.6

효소면역측정법에 의한 우유중의 Aflatoxin M1 분석

손동화,임선희,이인원 한국미생물생명공학회 ( 구 한국산업미생물학회 ) 1996 한국미생물·생명공학회지 Vol.24 No.5

국내산 우유중 aflatoxin M_1 (AFM_1)의 오염현황을 조사하기 위하여, 효소면역측정법(ELISA)을 개발하고 이를 이용한 독소의 정량을 행하였다. 항체의 생산을 위하여 AFM_1 bovine serum albumin 결합체를 Freund's adjuvant와 함께 토끼에 피하주사하여 면역하였다. 가장 높은 항체역가를 보인 항혈청과 AFB_1-horseradish peroxidase 결합체를 이용하여 직접법에 의한 경합적 효소면역측정법(competitive direct ELISA ; cdELISA)의 조건을 확립하였으며, 그 검출한계는 0.003ppb로 나타났다. 또한 유사독소에 대한 교차반응율은 aflatoxin M_1, M_2, B_1, _2, G_1, G_2, B_2a, and G_2a 에 대하여 각각 100, 29.9, 25.0, 2.7, 13.0, 0.65, 0, 및 0%이었다. 다음으로, AFM_1을 인위적으로 오염시킨 우유를 C_18 cartridge로 세척후 cdELISA로 분석하였을 때, 0.01~1 ppb(10~1,000 ppt)의 범위에서 그 회수율의 평균은 104%(CV의 평균, 6.4%)로 나타났다. 시유 및 목장우유를 대상으로 AFM_1의 오염현황을 cdELISA로 조사하였을 때, 평균 오염도는 80.4±55.0 ppt (n=64; range, 5,6~280 ppt)이었다. For a survey of the occurrence of aflatoxin M_1 (AFM_1) in domestic cow's milk, we developed an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) system, and quantitated the toxin in cow's milk. In order to produce specific antibodies AFM_1 conjugated to bovine serum albumin (AFM_1-BSA) and Freund's adjuvant were immunized subcutaneously to rabbits. By use of the antiserum showing the highest titer and AFB_1-HRP conjugate, we established a competitive direct ELISA (cdELISA) for AFM_1 whose detection limit was 0.003 ppb. The cross-reactivities of the antiserum against aflatoxin M_1, M_2, B_1, _2, G_1, G_2, B_2a, and G_2a were 100, 29.9, 25.0, 2.7, 13.0, 0.65, 0, and 0%, respectively. When the cdELISA was applied to the cow's milk spiked with AFM_1 and followed by cleanup with C_18 cartridge, the mean recovery of the assay was 104% (mean of CV, 6.4%) in the final concentration of 0.01~1 ppb (10~1,000 ppt). When cow's milk samples gathered from markets and farms were assayed by the cdELISA, the mean concentration and SD of AFM_1 was 80.4±55.0 ppt (n=64; range, 5,6~280 ppt).

효소면역측정법을 이용한 Fumonisin의 검출법 개발

손동화,한성민,임선희,이인원,조선희,강신영,이경애 한국미생물생명공학회 ( 구 한국산업미생물학회 ) 1996 한국미생물·생명공학회지 Vol.24 No.1

Fumonisin에 대한 효소면역측정법(ELISA)을 개발하기 위하여 특이항체를 생산하고, 분석조건을 확립하여, 인위적으로 오염시킨 옥수수 시료의 분석을 행하였다. Fumonisin B_1 (FB_1)을 cholera toxin (CT)에 결합시킨 FB_1-CT conjugate를 면역원으로 하여 Freund's adjuvant와 함께, 또는 단독으로 두 군의 토끼에 면역하고 특이항체를 생산하였다. 항혈청을 ELISA로 분석한 결과 그 adjuvant와 함께 면역한 경우 항체역가(titer)가 높게 나타났다. 가장 높은 항체역가(1 : 16,000)를 나타낸 항혈청 및 그로부터 정제한 항체를 이용하여 간접법 및 직접법에 의한 경합적 ELISA(ciELISA 및 cdELISA)를 각각 확립하였다. 이 항체의 유사독소와의 교차반응을 ciELISA로 조사하였을 때, FB_3에 대한 교차반응율은 2%로 매우 낮았으나, FB_2에 대한 것은 179%로 다소 높았다. FB_1의 검출한계는 ciELISA에서 0.03ppb, cdELISA에서 0.3 ppb로 각각 나타났다. 실제 곡물시료의 분석에 ELISA 활용가능성을 조사하기 위하여 인위적으로 FB_1을 오염시킨 옥수수를 75% methanol로 추출하고 그 회수율을 측정한 결과, 분석이 불안정하여 회수율이 일정하게 나타나지 않았다. 그러나 방해물질의 제거를 위하여 시료추출액을 strong anion exchange(SAX) cartridge를 거쳐 세척한 다음 분석하였을 때, 3~10 ppm 범위의 FB_1 오염 옥수수에서 평균 34%(CV의 평균, 8.2%)의 안정된 회수율을 보였다. In order to develop enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for fumonisins, production of specific antibodies, establishement of ELISA conditions, and quantitation of the toxin from spiked corns by ELISA were performed. Fumonisin B_1 (FB_1) conjugated to cholera toxin (CT) with or without Freund's adjuvant was subcutaneously injected into 2 groups of rabbits. When the titer of the antisera produced by each rabbit tested, higher titer was observed in case of the immunization with the adjuvant. By use of the antiserum showing the highest titer (1 : 16,000) and its purified antibodies, competitive indirect and direct ELISA's (ciELISA and cdELISA) were established, respectively. When the cross-reactivity of the antibody against fumonisin analogs was investigate by the ciELISA is was very low against B_3 (2%) but high against fumonisin B_2 (179%). The sensitivity of the ELISAs was also very high, because the detection limit for FB_1 was 0.03 ppb in ciELISA and 0.3 ppb in cdELISA. When the ELISA's were applied to the spiked corns after extraction with 75% methanol, the assay recovery of FB_1 was too unstable to assay. However, when cleanup by strong anion exchange (SAX) cartridge was introduced to remove interfering materials, the mean ELISA recovery of FB_1 from corns spiked to 3~10 ppm was found to be 34.0% and stable (mean of CV, 8.2%).

수입곡물 중의 Aflatoxin B_1 검출을 위한 효소면역측정법의 평가

손동화,박애란,이인원 한국산업미생물학회 1992 한국미생물·생명공학회지 Vol.20 No.3

곡물 중의 aflatoxin B_1(AFB_1)을 검출하는 방법으로서 효소면역측정법(ELISA)의 활용가능성을 평가하기 위하여, ELISA 분석치를 인위적인 오염치 및 자연오염된 시료의 HPLC 분석치와 비교하였다. 분석대상 시료로는 외국산 면실박(19점), 채종박(11점), 대두박(9점), 옥수수(3점) 등의 수입곡물을 사용하였다. 각 곡물별로 작성한 표준곡선으로부터 실제 곡물시료 중 대체로 1∼100ng/g 농도의 AFB_1이 분석가능함을 알 수 있었다. 이를 기준으로 하여 표준 AFB_1을 인위적으로 오염시킨 시료를 ELISA로 분석하였을 때, 1 ng/g의 저농도에서는 그 회수율이 높았으나(평균 268%) 3 ng/g 이상의 농도에서는 평균 138%(68∼193%)이었으며, 각 분석치의 상대적인 분산도(C.V.)는 평균 7.0%(0∼22%)로 매우 양호하였다. 한편 자연오염된 시료의 ELISA 분석치를 HPLC 분석치와 비교하였을 때, 10 ng/g 이하의 시료에서는 특히 채종박의 경우 두 분석치 간에 차이가 다소 크게 나타났으나, 그 이상의 오염시료에서는 몇몇 예외를 제외하고는 비교적 근사한 수치를 나타내었다. 특히 오염도가 심각한 면실박의 경우 HPLC분석치에 대한 ELISA 분석치의 비율이 평균 153%로 양호하였다. 따라서 본 효소면역측정법은 10 ng/g 이상의 AFB_1이 오염된 곡물시료의 분석에 실용화가 가능한 것으로 나타났다. In order to evaluate an enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) for practical use in detecting aflatoxin B_1(AFB_1) from cereals, we compared AFB_1 concentrations of samples contaminated artificially or naturally that were quantitated by the ELISA with those spiked or quantitated by HPLC. Cotton seed meals(19 items), rape seed meals(11), soybean meals(9), and corns(3) imported from foreign countries were used as sample cereals. The standard curves of each cereal class showed that 1∼100 ng/g of AFB_1 from cereals could be assayed by the ELISA. When artificially contaminated cereals were assayed by ELISA, the average recovery of AFB_1 from samples spiked to 3 ng/g and more was 138%(68∼193%), although that spiked to 1 ng/g was somewhat high(268%). The average C.V. of recovery was 7.O%(O∼22.2%). When naturally contaminated cereals were assayed, the concentrations of AFB_1 below 10 ng/g especially from rape seed meals quantitated by ELISA were much lower than those determined by HPLC. However, the concentrations of 10 ng/g and more from samples, except a few extraordinary samples, quantitated by ELISA were similar to those determined by HPLC, especially in case of cotton seed meals whose average recovery (ELISA/HPLC) was 153%. In conclusion, the ELISA was elucidated such as a practical tool to detect AFB_1 of 10 ng/g and more from cereals.

Bacillus sp. SUH4-2로부터 생산되는 말토올리고당 생성 α-Amylase의 정제 및 특성

윤상현,김묘정,김정완,권기성,이인원,박관화 한국산업미생물학회 1995 한국미생물·생명공학회지 Vol.23 No.5

토양에서 분리된 내열성 균주인 Bacillus sp. SUH 4-2가 생산하는 maltose, maltotriose 생성 amylase를 (NH_4)_2SO_4 침전 분획, DEAE-Toyopearl 및 Mono-Q HR 5/5 column 크로마토그래피로 16.1배 정제하였으며 수율은 13.5%이었다. 이 효소의 최적 반응온도는 60∼65℃이며 60℃에서 40분간 방치된 후에도 50% 이상의 역가가 유지되었다. 최적 반응 pH는 5.0∼6.0이며 pH 5.0∼8.0에서 안정하였다. 이 효소의 등전점은 5.8이었으며 SDS-PAGE로 분석한 결과 분자량은 약 63.6 kD이었다. 이 효소를 가용성 전분과 반응시켜 생성된 당류를 TLC로 조사하여 maltose와 maltotriose가 선택적으로 많이 생성되는 것을 확인할 수 있었으며 HPIC로 정량하여 당들이 glucose : maltose : maltotriose : maltotetraose=11 : 59 : 25 : 5의 비율로 생성됨을 알 수 있었다. A Bacillus strain capable of producing an extracellular malto-oligosaccharides forming α-amylase was isolated from soil and designated as Bacillus sp. SUH4-2. The enzyme was purified by ammonium sulfate fractionation, DEAE-Toyopearl and Mono-Q HR 5/5 column chromatographies using a FPLC system. The specific activity of the enzyme was increased by 16.1-fold and the yield was 13.5%. The optimum temperature for the activity of α-amylase was 60∼65℃ and more than 50% of initial activity was retained after the enzyme was incubated at 60℃ for 40 min. The enzyme was stable over a broad pH range of 5.0∼8.0 and the optimum pH was 5.0∼6.0. The molecular weight of the enzyme was determined to be about 63.6 kD and isoelectric point was around 5.8. The enzyme activity was strongly inhibited by Mn^(2+), Ni^(2+), and Cu^(2+); slightly by Ca^(2+). The purified enzyme produced starch hydrolyzates containing mainly maltose and malto- triose from soluble starch. The starch hydrolyzates were composed of 11% glucose, 59% maltose, 25% maltotriose and 5% maltotetraose.

옥수수 중의 Zearalenone 분석을 위한 효소면역측정법

손동화,한성민,임선희,이인원,강신영 한국산업미생물학회 1994 한국미생물·생명공학회지 Vol.22 No.4

효소면역측정법(ELISA)에 의한 옥수수중의 zearalenone(ZEA) 정량법을 개발하기 위하여, ZEA-6'-carboxymethyloxime-BSA(ZEA-BSA)을 토끼에 면역하여 생산한 다클론항체를 정제하고 간접법에 의한 분석법(competitive indirect ELISA)을 확립하였다. 이 항체는 ZEA의 유사독소인 α-zearalenol, β-zearalenol, α-zearalanol 및 β-zearalanol에 대하여 9.6∼1.4%의 낮은 교차반응을 보였다. ZEA 표준품에 대하여 작성한 표준곡선으로부터 이 분석법에 의한 ZEA의 검출농도는 0.3∼1,000 ng/㎖ 정도로 나타났다. 분쇄옥수수에 ZEA를 인위적으로 오염하여(10∼1,000 ng/g) ELISA 분석치와 비교하였을 때, 10 ng/g의 저농도에서는 그 회수율이 높게 나타났지만(258%) 30 ng/g 이상 1,000 ng/g의 농도에서는 평균 109%(94∼123%)로 양호하였으며, 오염농도별 각 분석치의 상대적인 분산도(CV)는 평균 18.0%(0.9∼28.3%)였다. 한편 자연오염된 9개의 옥수수시료를 3차례 분석하였을 때, CV가 다소 크게 나타난 경우도 있었으나 평균 27.7%(9.3∼52.4%)로 대체로 근사한 수치를 나타내었다. 따라서 본 효소면역측정법은 30 ng/g 이상의 ZEA이 오염된 옥수수시료의 분석에 활용가능한 것으로 나타났다. In order to develop an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for zearalenone (ZEA) in corn, we produced antisera by immunizing rabbits with ZEA-6'-carboxymethyloxime-BSA, purified polyclonal anti ZEA antibodies, and subsequently established a competitive indirect ELISA. The antibodies showed low cross-reactivity of 9.6∼1.4% against ZEA analogues such as α-zearalenol, β-zearalenol, α-zearalanol, and β-zearalanol. From the standard curve of the ELISA for ZEA in corn, the detection range was found to be 0.3∼1,000 ng/㎖. When artificially contaminated corns were assayed by the ELISA, the average recovery of ZEA spiked to 30∼1,000 ng/g was 109% (96∼123%), although that of ZEA spiked to 10 ng/g was somewhat high (258%). The average coefficient of variation (CV) of the recovery was 18.0% (0.9∼28.3%). When 9 corn samples naturally contaminated were assayed 3 times, the average CV of the determinations was 27.7% (9.3∼52.4%). Therefore, the ELISA was elucidated to be a practical tool for the detection of ZEA of 30 ng/g and more from corn.

Aflatoxin B_1의 검출을 위한 효소면역측정법의 개발

손동화,박애란,서병철,김진철,이인원,남영중,허우덕 한국산업미생물학회 1992 한국미생물·생명공학회지 Vol.20 No.2

효소면역측정법에 의한 aflatoxin B_1(AFB_1)의 정량법을 개발하기 위하여, 항체를 생산 정제하여 분석법을 확립하고 직접법과 간접법(direct/indirect competitive ELISA)의 특성 및 문제점을 비교·검토하였다. Bovine serum albumin(BSA)을 carrier protein으로 한 AFB_1-1-(0-carboxymethyl)oxime-BSA를 토끼에 면역하여 항AFB_1항혈청을 생산하였다. 정량 침강반응에 의하여 항혈청으로부터 항BSA항체를 제거하고 황산암모늄 침전법 및 DEAE-Sephadex A-50 이온교환 크로마토그래피를 통하여 순도 높은 IgG항체를 정제하여 항AFB_l항체로 사용하였다. 이 항체는 2×10^6이상의 높은 항체가를 갖고 있었으며, AEB_1의 유사독소인 G_2, B_2, G_1에 대하여는 3∼34%의 낮은 교차반응성을 보여 특이성이 비교적 높았다. 직접법 및 간접법의 분석조건을 확립한 후, AFB_1 표준품에 대하여 작성한 표준곡선으로부터 각 방법에 의한 AFB_1의 검출농도는 각각 0.2∼20 및 1∼10,000 ng/㎖(ppb)로 나타나, 직접법이 간접법보다 검출농도의 범위는 좁으나 감도가 더 높았다. 직접법은 분석의 안정성, 간편성, 신속성 등의 면에서 간접법보다 실용화에 적합한 것으로 나타났다. In order to develop an enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) for detecting aflatoxin B_1(AFB_1), we produced and purified antibodies, thereafter established and evaluated methods of direct and indirect competitive ELISA. Anti-AFB_1 antisera, produced by immunizing rabbits with AFB_1-1-(0-carboxymethyl)oxime-bovine serum albumin conjugate(AFB_1-BSA), were removed of anti-BSA antibodies by quantitative precipitation reaction and further purified by ammonium sulfate precipitation and DEAE-Sephadex A-50 ion exchange chromatography. Purified IgG fractions were used as anti-AFB_1 antibodies. The antibodies, whose titer was determined extremely high above 2×10^6, showed low cross-reactivity of 3∼34% against AFB_1 analogues such as G2, B2, and Gl. From the standard curves of direct and indirect competitive ELISA for AFB_1, the detection ranges were found 0.2∼20 and 1∼10,000 ng/㎖(ppb) respectively. In their sensitivity, stability, simplicity, and rapidity, the direct method was more suitable than the indirect method for practical use.