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Alkaline Proteinase를 생산하는 Yarrowia lipolytica 504D의 분리 동정
김창화,진익렬,유춘발,Kim, Chang-Hwa,Jin, Ingnyol,Yu, Choon-Bal 한국미생물학회 1998 미생물학회지 Vol.34 No.3
자연계로부터 분리한 효모중에서 새우젓으로부터 분리한 효모균주 504D가 alkaline 조건에서 가장 우수한 proteinase 생산성을 보여 분류동정하였다. 분리효모의 형태학적 특성은 주로 영양세포로 출아증식을 하였으나, citric acid가 함유된 MM 배지에서만 위균사를 형성하였고, N-acetylglucosamin과 ${\beta}$-D-glucose가 첨가된 MM 배지에서만 진균사를 형성하였다. 유성적으로 자낭포자를 형성함으로써 반자낭균류이었고, 무성적으로 출아포자 및 분절 포자를 형성하였다. 생리생화학적인 특성으로 대부분의 탄소원과 nitrate 및 nitrate를 이용하지 못하였으나 일부 유기산과 알콜류를 이용하였다. 세포지방산을 분석한 결과, 불포화지방산 53.67%와 포화지방산 14.58%로 나타났으며, 대조균들에는 관찰되지 않는 C17:1이 관찰되었다. 전체적인 실험결과에서 분리균은 균사형성능과 세포지방산의 조성에서 약간의 차이를 제외하면 대조균 Saccharomycopsis lipolytica KCCM 12495 및 KCCM 35426의 모든 특성들과 거의 동일하여 분리효모 504D를 Yarrowia lipolytica로 동정하였다. The yeast strain 504D, isolated from salted shrimp soup, showed the best proteolytic activity under alkaline condition. The yeast formed vegetative cells in almost optimal media for yeasts, but formed only pseudohyphae in the MM medium containing citric acid and true hyphae in the MM medium containing N-acetylglucosamin and ${\beta}$-D-glucose. The yeast was classified as hemiascomycetes to form ascospores by sexual reproduction, and formed blastospores and athrospores by asexual reproduction. The yeast strain did not assimilate almost of the carbon sources, nitrate and nitrite, but some organic acids and alcohols. The fatty acids of whole cells were composed of 53.67% unsaturated fatty acids and 14.58% saturated, and, especially, C17:1 was observed in this strain but not in two control yeasts. However, almost of all results were very similar to the morphological and physiological characteristics of Yarrowia lipolytica KCCM 12495 and KCCM 35426, except for a little differences which are the composition of fatty acids and the manner of mycellium formation. Therefore, the isolated yeast strain 504D is identified as a Yarrowia lipolytica.
Yarrowia lipolytica 504D의 Alkaline Proteinase 특성
김창화,진익렬,유춘발,Kim, Chang-Hwa,Jin, Ingnyol,Yu, Choon-Bal 한국미생물학회 1998 미생물학회지 Vol.34 No.3
Yarrowia lipolytica 504D가 생산하는 alkaline proteinase를 정제한 결과, 분자량은 32,000으로 나타났고, pH 9.5와 $42^{\circ}C$에서 최적활성을 보였으며, pH 4-10의 범위와 $45^{\circ}C$까지 비교적 안정한 것으로 나타났다. PMSF를 비롯하여 EDTA, EGTA, phenanthrolin도 효소활성을 저해하여 정제효소가 serine proteinase인지 metal proteinase인지 불확실하였다. 그러나 28% 활성증가를 보인 $Cu^{2+}$ 외에 $Zn^{2+}$를 비롯한 대부분의 무기염들이 효소활성을 증가시키지 못하였고, 또한 EDTA의 첨가로 불활성화된 효소도 Ca 염의 첨가로 활성이 복원되었다. 따라서 정제효소는 serine proteinase(E.C. 3.4.21.14)로 추정되었다. An alkaline proteinase secreted from Yarrowia lipolytica 504D was purified by salting-out and column chromatography. The molecular weight of the purified enzyme was about 32,000 Da estimated by SDS-PAGE. The optimal condition for the activity of the enzyme was at pH 9.5 and $42^{\circ}C$ The enzyme was stable up to $45^{\circ}C$ and at the range of pH 4-10. Because the enzyme was inhibited by PMSF as well as EDTA, EGTA, and phenan-throlin, it is uncertain whether the enzyme is serine proteinase or metalloproteinase. However, almost all metal salts tested did not increase the enzyme activity, and Ca salt restored the activity of the enzyme inactivated by EDTA. Therefore, the purified enzyme seems to be an serine proteinase (E.C. 3.4.21.14).
고온내성 연료용 알코올 효모균주 Saccharomyces cerevisiae KNU5377에서 HSF1 유전자의 변이주 구축
김일섭,윤혜선,최혜진,손호용,유춘발,김종국,진익렬,Kim Il-Sup,Yun Hae-Sun,Choi Hye-Jin,Sohn Ho-Yong,Yu Choon-Bal,Kim Jong-Guk,Jin Ing-Nyol Korean Society of Life Science 2006 생명과학회지 Vol.16 No.3
출아효모인 Sacharomyces cerevisiae S288C균주를 이용한 효모의 게놈이 완성된 후 S. cerevisiae는 다양한 연구 모델로 이용되어져 왔다. 현재까지 효모를 이용한 기능 유전체학 측면에서의 연구는 laboratory strainin인 S288C 균주 또는 그 유래의 균주들이다. 그러나 자연에서 분리된 효모 또는 산업적으로 이용되어지고 있는 S. cerevisiae의 유전학 측면에서의 연구는 낮은 포자형성률 및 형질전환률, 그리고 S288C 균주와의 게놈상의 상이성 때문에 거의 이루어지지 않고 있다. 여기서 우리 연구진은 자연에서 분리된 Saccharomyces cerevisiae KNU5377 균주를 이용하여 random spore analysis를 통해 MATa 및 $MAT{\alpha}$ 타입의 각각의 haploid cell을 분리 후 이미 보고된 KanMX module를 가지고 round PCR기법에 의한 short flanking homology 기법을 이용하여 전사조절인자인 HSF1 유전자가 치환된 변이주를 구축할 수 있었다. 덧붙여, 모든 유전자에 이 기법을 적용할 수는 없다는 것을 확인하였다. 앞으로 이 변이주를 통해 기능 유전체학적인 측면에서 이 유전자의 스트레스와의 관련성을 연구하고자 한다. HSF1 is the heat shock transcription factor in Saccharomyces cerevisiae. S. cerevisiae KNU5377 can ferment at high temperature such as $40^{\b{o}}C$. We have been the subjects of intense study because Hsf1p mediates gene expression not only to heat shock, but to a variety of cellular and environmental stress challenges. Basing these facts, we firstly tried to construct the hsf1 gene-deleted mutant. PCR-method for fast production of gene disruption cassette was introduced in a thermotolerant yeast S. cerevisiae KNU5377, which allowed the addition of short flanking homology region as short as 45 bp suffice to mediate homologous recombination to kanMX module. Such a cassette is composed of linking genomic DNA of target gene to the selectable marker kanMX4 that confers geneticin (G418) resistance in yeast. That module is extensively used for PCR-based gene replacement of target gene in the laboratory strains. We describe here the generation of hsf1 gene disruption construction using PCR product of selectable marker with primers that provide homology to the hsf1 gene following separation of haploid strain in wild type yeast S. cerevisiae KNU5377. Yeast deletion overview containing replace cassette module, deletion mutant construction and strain confirmation in this study used Saccharomyces Genome Deletion Project (http:://www-sequence.standard.edu/group/yeast_deletion_project). This mutant by genetic manipulation of wild type yeast KNU5377 strain will provide a good system for analyzing the research of the molecular biology underlying their physiology and metabolic process under fermentation and improvement of their fermentative properties.
동해안 사구로부터 Auxin을 생산하는 Bacillus cereus A-139의 분리 및 그 특성
소재현 ( Jae Hyun So ),김덕진 ( Duk Jin Kim ),신재호 ( Jae Ho Shin ),유춘발 ( Choon Bal Yu ),이인구 ( In Koo Rhee ) 韓國環境農學會 2009 한국환경농학회지 Vol.28 No.4
해안사구로부터 auxin을 분비하여 식물의 생육을 조절할 수 있을 것으로 생각되는 한 균주를 분리 선발하여 Bacillus cereus A-139 로 동정하였다. 분리된 Bacillus cereus A-139의 배양액을 HPLC로 확인한 결과 IAA를 생성하는 것으로 확인 되었으며 LB배지상에서 배양했을 때 auxin의 생산은 배양 8일 후 16.1 μg/mL 로 가장 높았으며 2%의 tryptone을 첨가하였을 때 배양 6일 후 auxin의 생산은 49.0 μg/mL로 증가되었으며 전구물질인 tryptophan의 농도가 증가할수록 auxin의 생성은 증가 하였으며 tryptophan이 0.1% 첨가되었을 때 배양 7 일 후 auxin의 생산은 162.6 μg/mL로 가장 높았다. 또한 Bacillus cereus A-139 의 배양액은 애기장대와 녹두를 이용하여 시험한 결과 주근의 생육을 저해하였으나 측근의 생육을 촉진시키는 전형적인 auxin의 특징을 나타내었다. 따라서 해안사구의 보호와 사구식물의 보호를 위해 이러한 미생물들의 생육분포를 조절할 필요가 있을 것으로 생각된다. A bacterium, which was named to be Bacillus cereus A-139, secreting auxin was isolated from the east coast sand dunes in Korea. The secretion of auxin was confirmed by HPLC. When cultured in LB broth, Bacillus cereus A-139 produced 16.12 μg/mL auxin after 8 days in LB broth. Bacillus cereus A-139 produced 49 μg/mL auxin and 162.6 μg/mL by the addition of 2% tryptone and 0.1% tryptophan, respectively. The root growth of Arabidopsis thaliana was retarded by Bacillus cereus A-139 culture broth up to 57% but the formation of lateral roots was increased up to almost twice after 4 days incubation. Also the formation of lateral roots of mung bean was increased up to 57% after 10 days incubation.
유춘발 대구대학교 (한사대학) 산업기술연구소 1986 産業技術硏究 Vol.5 No.-
Thermophilic Streptomyces sp. TS 20-1 which produced an antibiotic substance against Bacillus thuringiensis was isolated from soil. Escherichia coli was less sensitive to the antibiotic than B. thuringiensis. The antibiotic was purified from culture filtrate with charcoal adsorption, and extracted with chloroform and acetone. Purified antibiotic was emitted single blue fluorescent spot under UV irradiation on paper chromatography in carbontetrachloride: chloroform (8:1) solvent system. The substance was stable in acid, but it was unstable by heat.