Yarrowia lipolytica TH65가 생산하는 Alkaline Proteinase의 정제 및 특성

유춘발,김창화,진영호,진익렬 한국미생물생명공학회 ( 구 한국산업미생물학회 ) 1996 한국미생물·생명공학회지 Vol.24 No.3

최적조건에서 생산한 효소를 40~65% ammonium sulfate 분획, DEAE-cellulose chromatography, Sephadex G-100과 Sephadex G-75 gel filtration을 이용하여 수율 14%, 15배 정제하였다. 정제효소의 분자량은 SDS-PAGE로 측정한 결과 31,500 정도였고, 최적온도와 최적 pH는 각각 40℃와 8.5~9.0이었다. 대부분의 2가 금속이온은 효소활성을 저해하였으며, 특히 Hg^2+, Zn^2+, Co^2+ 등은 강하게 저해하였다. PMSF는 효소활성을 완전히 저해시켰으며, EDTA, EGTA 및 phenanthroline은 부분적으로 저해시켰으나 Ca^2+을 첨가하면 모두 효소활성이 복원되는 것으로 나타나 metalloprotease는 아닌 것으로 생각되었다. 이상의 결과로 보아 본 효모 Yarrowia lipolytica TH65가 생산하는 효소는 alkaline serine proteinase로 생각된다. An alkaline proteinase produced by Yarrowia lipolytica TH65 was purified by 40~65% ammonium sulfate fractionation, DEAE-cellulose chromatography, and gel filtration with Sephadex G-100 and Sephadex G-75. The purified enzyme was shown as a single ban on SDS-PAGE, and its molecular weight 31,500. Optimum temperature and pH were 40℃ and 8.5~9.0, respectively, and the enzyme was stable below 40℃ and in the pH range of 6~8. The enzyme was strongly inhibited by divalent ions, completely by PMSF, and partially by EDTA, EGTA, and phenanthroline. But the inhibitory effect in the presence of EDTA, EGTA and phenanthroline could be reversed by addition of Ca^2+. Thus, these results indicated that the purified enzyme was an alkaline serine proteinase (E.C. 3.4.21.14).

고온성 방선균에 의한 항생물질의 생산

유춘발 대구대학교 (한사대학) 산업기술연구소 1986 産業技術硏究 Vol.5 No.-

Thermophilic Streptomyces sp. TS 20-1 which produced an antibiotic substance against Bacillus thuringiensis was isolated from soil. Escherichia coli was less sensitive to the antibiotic than B. thuringiensis. The antibiotic was purified from culture filtrate with charcoal adsorption, and extracted with chloroform and acetone. Purified antibiotic was emitted single blue fluorescent spot under UV irradiation on paper chromatography in carbontetrachloride: chloroform (8:1) solvent system. The substance was stable in acid, but it was unstable by heat.

전통발효식품(된장)의 품질 균일화 및 개선을 위한 기술 개발

유춘발,송치현 대구대학교 공과대학 1997 산학연 공동기술개발컨소시엄 최종보고서 Vol. No.

Monascus sp. YH-69의 분리동정과 색소의 생산

유춘발,진영호 한국생명과학회 1998 생명과학회지 Vol.8 No.1

The mold YH-69 producing pigments was isolated from soil, and identified as Monascus sp.. For the production of the pigments from the mold, the best condition was observed with 6% rice powder with 200 mesh, 0.2% yeast extract, 0.3% ammonium sulfate, and 0.02% ZnSO4 at pH 5 and 30$\circ$ for 6 day with reciprocal shaking. 자연계로 부터 색소생산균을 분리하고 색고 생산성이 가장 양호한 YH-69를 동정한 결과, Monascus ruber의 근연균으로 동정되었따. 분리균의 색소 생산성을 분석한 결과, 탄고원은 200 mesh의 6% 쌀가루가 가장 우수하였으며,질소원은 0.2%의 yeast extract, 인산염은 0.3% ammonium sulfate, 무기염은 0.002% $ZnSO_4$에서 높은 생산성을 보였다. 가장 높은 생산성을 보인 인자들을 조한하여 최적의 배지를 구성하고 색소생산성을 조사한 결과, pH 5와 30${\circ}C$에서 높은 생산성을 보였으며, 배양 3일째로부터 색소생산성이 증가하여 배양 6일째 최고의 생산성을 보였다.

내열성 세균 아밀라아제의 산업적 생산기술 개발

유춘발 대구대학교 공과대학 1998 산학연 공동기술개발컨소시엄 최종보고서 Vol. No.

Yarrowia lipolytica 504D의 Extracellular Alkaline Proteinase 생산성

유춘발,김창화,김태곤 한국생명과학회 1998 생명과학회지 Vol.8 No.3

Productivity of alkaline proteinase from Yarrowia lipolytica 504D was investigated. For the production fo the enzyme, hemoglobin was the best nitogen source, however, casein and skim milk were also good. All carbon sources inhibited strongly the producitivity of the enzyme. Yeast extract increased the productivity of the enzyme to 220%, but almost mineral salts except monovalant ions decreased it. Based on these results, optimal medium was composed of 1.2% casein, 0.2% glucose, 0.16% yeast extract, and 0.1% ammonium sulfate. the best condition for the production of the enzyme was observed at pH 9 and $20^{\circ}C$ for 42 hours.

자체봉함형 골판지상자 제조시스템 개발

하영선,유춘발,김수일 대구대학교 공과대학 1996 산학연 공동기술개발컨소시엄 최종보고서 Vol. No.

Yarrowia lipolytica 504D의 Alkaline Proteinase 특성

김창화,진익렬,유춘발,Kim, Chang-Hwa,Jin, Ingnyol,Yu, Choon-Bal 한국미생물학회 1998 미생물학회지 Vol.34 No.3

Yarrowia lipolytica 504D가 생산하는 alkaline proteinase를 정제한 결과, 분자량은 32,000으로 나타났고, pH 9.5와 $42^{\circ}C$에서 최적활성을 보였으며, pH 4-10의 범위와 $45^{\circ}C$까지 비교적 안정한 것으로 나타났다. PMSF를 비롯하여 EDTA, EGTA, phenanthrolin도 효소활성을 저해하여 정제효소가 serine proteinase인지 metal proteinase인지 불확실하였다. 그러나 28% 활성증가를 보인 $Cu^{2+}$ 외에 $Zn^{2+}$를 비롯한 대부분의 무기염들이 효소활성을 증가시키지 못하였고, 또한 EDTA의 첨가로 불활성화된 효소도 Ca 염의 첨가로 활성이 복원되었다. 따라서 정제효소는 serine proteinase(E.C. 3.4.21.14)로 추정되었다. An alkaline proteinase secreted from Yarrowia lipolytica 504D was purified by salting-out and column chromatography. The molecular weight of the purified enzyme was about 32,000 Da estimated by SDS-PAGE. The optimal condition for the activity of the enzyme was at pH 9.5 and $42^{\circ}C$ The enzyme was stable up to $45^{\circ}C$ and at the range of pH 4-10. Because the enzyme was inhibited by PMSF as well as EDTA, EGTA, and phenan-throlin, it is uncertain whether the enzyme is serine proteinase or metalloproteinase. However, almost all metal salts tested did not increase the enzyme activity, and Ca salt restored the activity of the enzyme inactivated by EDTA. Therefore, the purified enzyme seems to be an serine proteinase (E.C. 3.4.21.14).

Extracellular Proteinase를 생산하는 효모의 분리동정과 효소의 생산

김창화,이태형,유춘발,진익렬 한국미생물생명공학회 ( 구 한국산업미생물학회 ) 1996 한국미생물·생명공학회지 Vol.24 No.4

토양 및 농업용수와 하수 등으로부터 분리한 237주의 효모를 대상으로 단백질 분해력이 있는 효모 13주를 분리한 후, 알카리 조건에서 활성이 우수한 효모 TH65의 형태학적 및 생리생화학적 특성을 조사하고, 그 결과를 Saccharomycopsis lipolytica KCCM 12495 및 S. lipolytica KCCM 35426와 비교한 바, 발효성이 없고 대부분의 당류와 nitrate를 이용하지 못하는 등 대조 균주와 거의 동일한 특성을 보임에 따라 분리균주를 Yarrowia lipolytica TH65로 동정하였다. 분리효모의 protease 생산성을 조사한 결과, 탄소원으로는 glycerol과 glucose가 좋았고, glucose 농도는 0.5%가 적당하였다. 질소원으로는 0.6% skim milk에서 가장 많은 효소가 유도되었고, 아미노산에 의한 영향을 조사한 결과는 cysteine, cystine 및 tryptophane에 의해 효소 생산성이 감소되는 것으로 나타났다. Yeast extract 농도의 영향을 조사한 결과는 0.1~0.5%에서 양호하였으나, 첨가된 대부분의 무기염과 인산염은 효소생산성을 증가시키지 못하는 것으로 나타났다. 배양초기 pH는 9~11에서 가장 좋았고, 배양온도는 18℃에서 가장 좋았으며, 배양시간에 따른 효소생산성은 36시간에서 최고치를 나타내었다. A yeast strain TH65 producing a high level of proteinase under alkaline condition was isolated, and identified as Yarrowia lipolytica by morphological, physiological, and biochemical characteristics. In proteinase productivity, glycerol and glucose among tested carbon sources were very effective, and optimum concentration of glucose was 0.5%. Skim milk was found to be most effective nitrogen source in productivity, and its optimum concentration was 0.6%. But, cysteine, cystine and tryptophane decreased the proteinase productivity. Yeast extract was relatively effective at the range of 0.1~0.5%. The yeast showed maximum production of proteinase at 18℃, pH 9~11, and cultivation time of 36 hours.

Alkaline Proteinase를 생산하는 Yarrowia lipolytica 504D의 분리 동정

김창화,진익렬,유춘발,Kim, Chang-Hwa,Jin, Ingnyol,Yu, Choon-Bal 한국미생물학회 1998 미생물학회지 Vol.34 No.3

자연계로부터 분리한 효모중에서 새우젓으로부터 분리한 효모균주 504D가 alkaline 조건에서 가장 우수한 proteinase 생산성을 보여 분류동정하였다. 분리효모의 형태학적 특성은 주로 영양세포로 출아증식을 하였으나, citric acid가 함유된 MM 배지에서만 위균사를 형성하였고, N-acetylglucosamin과 ${\beta}$-D-glucose가 첨가된 MM 배지에서만 진균사를 형성하였다. 유성적으로 자낭포자를 형성함으로써 반자낭균류이었고, 무성적으로 출아포자 및 분절 포자를 형성하였다. 생리생화학적인 특성으로 대부분의 탄소원과 nitrate 및 nitrate를 이용하지 못하였으나 일부 유기산과 알콜류를 이용하였다. 세포지방산을 분석한 결과, 불포화지방산 53.67%와 포화지방산 14.58%로 나타났으며, 대조균들에는 관찰되지 않는 C17:1이 관찰되었다. 전체적인 실험결과에서 분리균은 균사형성능과 세포지방산의 조성에서 약간의 차이를 제외하면 대조균 Saccharomycopsis lipolytica KCCM 12495 및 KCCM 35426의 모든 특성들과 거의 동일하여 분리효모 504D를 Yarrowia lipolytica로 동정하였다. The yeast strain 504D, isolated from salted shrimp soup, showed the best proteolytic activity under alkaline condition. The yeast formed vegetative cells in almost optimal media for yeasts, but formed only pseudohyphae in the MM medium containing citric acid and true hyphae in the MM medium containing N-acetylglucosamin and ${\beta}$-D-glucose. The yeast was classified as hemiascomycetes to form ascospores by sexual reproduction, and formed blastospores and athrospores by asexual reproduction. The yeast strain did not assimilate almost of the carbon sources, nitrate and nitrite, but some organic acids and alcohols. The fatty acids of whole cells were composed of 53.67% unsaturated fatty acids and 14.58% saturated, and, especially, C17:1 was observed in this strain but not in two control yeasts. However, almost of all results were very similar to the morphological and physiological characteristics of Yarrowia lipolytica KCCM 12495 and KCCM 35426, except for a little differences which are the composition of fatty acids and the manner of mycellium formation. Therefore, the isolated yeast strain 504D is identified as a Yarrowia lipolytica.