Molecular analysis of the hypoxia-sensitive mutant HUV6 in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus : Aspergillus nidulans와 Aspergillus fumigatus에서 저산소 민감성 돌연변이체 HUV6의 분자생물학적 분석

용득수 배재대학교 대학원 2012 국내석사

Pathogenic fungi have to overcome low oxygen stress to successfully colonize in a host after infection. To understand fungal adaptation to hypoxia, hypoxia-sensitive mutants in A. nidulans were isolated. One of the mutants, HUV6 showed high sensitivities to hypoxia and itraconazole. A genomic DNA fragment complementing the hypoxia-sensitive (HPS) phenotype of HUV6 was isolated by introducing an A. nidulans gDNA library. One ORF out of three ORF within the complemeting gDNA was proven to be responsible to complementing the hypoxia-sensitivity of HUV6. The complementing gene named hpsA has an ORF of 1,010 bp and encodes polypeptide of 302 amino acids, which owns a possible UBA (ubiquitin-associated) domain. A point mutation in the start codon was identified in the hpsA1 mutant allele of HUV6. Aspergillus hpsA exhibited amino acid sequence homogoy to S. pombe dsc2 (80% of homology), which was shown to be one of the component of DSC E3 ligase complex, necessary in the Sre1 N-terminal cleavage activation in response to hypoxia in S. pombe. Disruption of hpsA caused HPS phenotype as seen in HUV6. HPS phenotype was also seen in Af-hpsA disruptants of A. fumigatus a human pathogen causing Aspergillosis. HPS phenotype in ΔhpsA as well as HUV6 was complemented with the overexpressed SrbA N-terminus but not with SrbA, an ER-tethered transcription factor required for transactivation of hypoxic genes. In western analysis, the cleaved N-terminal product of SrbA was not detected in ΔhpsA and HUV6. The interaction between the SrbA C-terminus and HpsA was seen by using the Yeast two hybrid system. Taken together, these results indicated that HpsA played a critical role on the process of SrbA cleavage activation to adapt to hypoxic environment in A. nidulans as well as A. fumigatus. 병원성 곰팡이가 숙주에 감염 후 성공적으로 집단을 형성하기 위해서는 반드시 저산소 조건을 극복해야만 한다. 저산소 조건에 대한 곰팡이의 적응을 이해하기 위해 A. nidulans에서 저산소 민감성 돌연변이체를 분리하였다. 돌연변이체 중 하나인 HUV6는 저산소와 itraconazole조건에 아주 높은 민감성을 보였다. A. nidulans genomic DNA library의 유입을 통해 HUV6의 저산소 민감성(HPS)를 보완하는 유전자 조각을 분리하였다. genomic DNA에 존재하는 세 개의 유전자 중 하나의 ORF가 HUV6의 저산소 민감성을 보완하는 현상을 보였다. 이 유전자를 hpsA라 명명하였고 이는 1,010bp의 ORF를 가지며 UBA(Ubiquitin-associated)도메인을 포함한 302개의 아미노산을 암호화 하고 있었다. HUV6의 hpsA1 돌연변이 대립형질에서 시작 코돈에 point 돌연변이가 있는 것이 확인되었다. Aspergillus hpsA는 S. pombe에서 저산소시 Sre1 N-terminal 절단에 필수적인 DSC E3 ligase 복합체의 구성성분 중 하나로 보이는 S. pombe dsc2(유사도 80%)와 서열 유사도를 보였다. hpsA의 결손은 HUV6 돌연변이체와 같이 저산소 민감성(HPS) 표현형을 보였다. 저산소 민감성은 Aspergillosis를 유발하는 인간 병원성 균인 A. fumigatus의 Af-hpsA의 결손 돌연변이체에서도 보였다. hpsA 결손돌연변이체 뿐만 아니라 HUV6의 저산소 민감성은 저산소 유전자들의 전사활성에 필요한 ER-tehtered 전사인자인 SrbA N-terminus의 과대발현에 의해 보완되었으나 SrbA full gene은 보완할 수 없었다. western 분석에서 SrbA의 절단된 N-terminal 생성물은 DhpsA와 HUV6에서 검출되지 않았다. SrbA C-terminus 와 HpsA의 상호결합은 Yeast two hybrid system을 통해 확인되었다. 이러한 결과들은 HpsA가 A. nidualns 뿐만 아니라 A. fumigatus의 저산소 적응을 위한 SrbA의 절단 과정에 중요한 역할을 하는 것을 나타낸다.

Aspergillus nidulans의 autolysis와 conidiation에서 MpkB MAP kinase의 역할에 관한 연구

강지영 전북대학교 일반대학원 2013 국내박사

The mpkB gene of Aspergillus nidulans encodes a MAP kinase homolog of Fus3p in Saccharomyces cerevisiae which is involved in conjugation process. In previous study, MpkB was known for comprising the sexual development at the anastomosis and post-karyogamy stages. In addition, this study showed that MpkB was affected through the life cycle including asexual development and autolysis in A. nidulans. The size of conidia and the conidiation process of conidiophore in the mpkB deletion strain were irregular compared to those of wild type. In addition, the mpkB deletion strain produced conidia under the repression condition of conidiation such as sealing and even in the submerged culture concomitant with persistent brlA expression, implying that MpkB might have a role in timely regulation of brlA expression. The deletion of mpkB caused the hyphae to be fragmented and the DCM to be decreased rapidly in the extended submerge-culture. Simultaneously, mpkB deletion strain showed the mRNA accumulation of the chiB, engA, mutA and pepJ genes and the activities of chitinase and β-1,3-glucanase. These results suggest that MpkB might play a role in regulation of BrlA-involving autolysis because it was known that the brlA regulated the autolysis through the regulation of chiB and engA. Beside, to investigate the proteins that affect to MpkB MAP kinase, signal transduction system of S. cerevisiae was applied in A. nidulans. However, deletion of Ste20 homologs, AN2067 and AN8836, showed that MpkB MAP kinase module of A. nidulans might be not activated by these protein kinases. And the homologs of the genes regulated by Ste12 in S. cerevisiae are not shown any difference in mRNA expression compared with wild type. These results showed that MpkB MAP kinase cascade of A. nidulans was different at least with Fus3p MAP kinase of S. cerevisiae.

Cellular function of the genes encoding Gα protein homologs in the development of Aspergillus nidulans : Aspergillus nidulans 분화과정에서 Gα protein의 역할

장미희 Graduate School of Chonbuk National University 2004 국내박사

Aspergillus nidulans로부터 Gα 단백질 유사체를 암호화하는 유전자 ganA와 ganB를 분리하였다. GanB Gα protein은 adenylate cyclase을 activation시키는 mammalian Gα_(s) subfamily와 밀접하게 관련된 fungal Gα protein의 group Ⅲ에 속하는 반면 GanA는 mammalian counterpart를 갖지 않는 group Ⅱ에 속하는 Gα protein이다. ganA와 ganB 유전자는 A. nidulans의 life cycle 중에 vegetative growth 상태보다는 development 동안에 훨씬 더 많은 transcript가 생성되며 ganA transcript는 asexual 혹은 sexual development 초기에 많이 축적되고 ganB mRNA는 sexual development가 진행됨에 따라 크게 증가하는 것으로 조사되었다. 이들 Gα 단백질의 세포 내 기능을 알아보고자 ganA와 ganB의 여러 가지 돌연변이 균주를 제조하였다. GanA가 항상 발현되는 돌연변이주인 ganA constitutively-inactive mutants의 경우 배양액의 점도가 감소되며 또한 Novozym 234^(TM)에 대한 감수성이 증가되는 것으로 확인되었다. 그러나 ganA의 다른 돌연변이주들은 생장과 분화 등에 있어 뚜렷한 형질의 차이를 보이지 않았다. 한편 ganB deletion과 constitutively-inactive 돌연변이주는 액체 배양에서 무성분화가 일어나는 hyperactive sporulation 형질을 보이며 액체배양에서 발현이 억제되는 brlA 유전자를 다량 발현되도록 한다. GanB의 constitutive activation은 hyphal growth를 감소시키고 asexual sporulation을 급격하게 저해한다. 따라서 이러한 결과들로부터 GanB에 의한 signaling이 asexual development를 억제함을 알 수 있었다. 또한 ganB의 constitutively-active mutants에서 pigment의 축적이 증가하는 반면 deletion 혹은 inactive mutants에서는 감소하고 이러한 결과는 GanB가 A. nidulans에서 pigment production의 조절에 중요한 역할을 담당하리라는 것을 시사한다. 이뿐만 아니라 CanB의 deletion 혹은 inactivation은 germination rate를 감소시키는 반면 constitutive activation은 precocious germination을 유발한다. 게다가 constitutively-active 돌연변이주의 conidia는 탄소 원 없이도 germination을 유도한다. 이러한 결과로부터 GanB가 germination동안 탄소 원의 인식을 통하여 germination을 유발하며 또한 asexual development를 억제하는 신호전달자로 작용함을 알 수 있었다. 한편 GanA Gα protein은 무성 유성 분화 과정에 직접적으로 작용하는 것으로는 보이지 않고 생장 기간 중 세포벽 형성에 관여하는 신호를 전달할 것으로 추정된다. The ganA and ganB genes encoding the Gα protein homologs were isolated from Aspergillus nidulans. The GanB Gα protein belongs to the group closely related to the mammalian Gα_(s) subfamily that is involved in the activation of adenylate cyclase while GanA is among of group have no mammalian counterpart. Both the ganA and ganB mRNA were more accumulated at the developmental stage than at vegetative growth stage, especially more ganA mRNA was present in the early stages of asexual and sexual development. The transcript of ganB was increased as sexual development proceeds. To investigate the cellular function of these G proteins, various mutant strains of ganA and ganB were isolated by gene targeting and amino acid substitution. The viscosity of culture broth of ganA constitutively-active mutant in which GanA is constitutively activated was lower than that of wild type. The protoplasts were generated more rapidly in this mutant. However deletion, over-expression, or constitutively-inactive mutants of ganA have shown no clear phenotype in growth and development although ganA deletion and inactive mutants were more sensitive and constitutively-active mutants showed increased tolerance to SDS, H_(2)O_(2) or temperature. Constitutive activation of GanB dramatically increased pigment accumulation while deletion and inactivation reduced it. Moreover, constitutive activation caused a slight reduction in hyphal growth. These result suggest that GanB may play important role in pigment accumulation. Deletion or constitutively-inactive mutants of ganB showed conidiation and derepressed brlA expression in a submerged culture. Constitutive activation of GanB caused a severe defect in asexual sporulation and over-expression of ganB also resulted in a reduction of conidiation. Therefore it is propose that GanB may negatively regulate asexual sporulation through the BrlA pathway. In addition, deletion or constitutive inactivation of GanB reduced germination rate while constitutive activation led to precocious germination. Furthermore, conidia of a constitutively-active mutant could germinate even without carbon source. The effects of ganB mutations on ascospore germination were further examined. As with conidia, the constitutive activation of GanB led to precocious ascospore germination while ganB deletion and constitutively-inactive mutants germinated very poorly. Therefore GanB is a positive signal transducer for initiation of germination in both conidia and ascospores in A. nidulans. Taken together, these results indicated that GanB plays a positive role during germination, possibly through carbon source sensing, and negatively regulates asexual conidiation in A. nidulans.

Modulation of sexual development in association of newly isolated IndB/D with a GATA transcription factor, NsdD in Aspergillus nidulans

권낙중 Graduate School of PaiChai University 2006 국내박사

NsdD 단백질은 zinc finger 부분을 가지는 GATA 전사조절 인자로서 자기조절 능력을 가지고 있고, 사상성 진균류인 Aspergillus nidulans의 유성분화동안 양성조절자로서의 중요한 역할을 한다. Yeast two-hybrid 방법을 이용하여 NsdD와 상호 결합하는 세 종류의 단백질들을 분리하였고, IndA, IndB, IndD (Interactor of NsdD) 라고 명명하였다. 그들의 cDNA의 염기서열을 분석하여 indA, indB, indD 유전자들이 각각 335, 268, 282개의 아미노산을 암호화하고 있다는 것을 예측하였다. IndA 단백질은 phytochrome 신호 변환 과정에서 식물 핵단백질의 FAR1 집단과 상응성을 보이지만 IndB, IndD 단백질은 현재 밝혀져 있는 어떤 유전자 혹은 단백질들과도 상응성을 보이지 않는다. NsdD-IndB, NsdD-IndD의 상호결합은 각각 GST-pull down 방법을 사용하여 시험관 내에서 확인하였고, co-immunoprecipitation 방법을 사용하여 생체조건에서 증명되었다. 또한 IndB, IndD 단백질은 NsdD의 zinc finger 부분에 결합한다는 것을 증명하였다. 시험관과 생체조건에서의 chromatin immunoprecipitation 실험은 IndB 혹은 IndD 단백질의 NsdD에 대한 결합이 NsdD 자신의 promoter에 존재하는 GATA 인자와의 결합에 의한 자기조절능력을 억제한다는 것을 알아냈다. ΔindD 균주에서는 생장이 저해되는 것을 확인하였으나 ΔindB 균주에서는 그렇지 않았다. indB 혹은 indD 결손돌연변이는 정상적인 유성분화를 진행하지만 indB와 indD가 모두 결손 되어진 돌연변이는 유성분화 동안에 유성분화기관 형성이 조절되지 않고, 그 결과 완성된 유성분화기관과 미숙한 기관들이 계속 생겨난다. 이와 대비하여 IndB, IndD 단백질의 과대발현은 veA^(+) 균주에서 유성분화를 억제한다. 흥미롭게도 indB, indD의 발현 정도는 유성분화가 감소되는 ΔveA 돌연변이에서 확연히 증가된다. 이와 같이 새로운 단백질인 IndB와 IndD는 NsdD와의 상호결합을 통해서 유성분화의 음성조절자로서의 기능을 할 것이다. ΔveA 돌연변이에서 indB와 indD의 발현이 증가되는것은 불완전한 유성분화를 설명할 수 있을 것이다. NsdD is an auto-regulated putative GATA transcription factor with a zinc finger domain and plays an important role as a positive regulator during sexual development of the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Three interacting proteins of NsdD were isolated using the yeast two-hybrid assay and named IndA, IndB, and IndD (Interactor of NsdD). Sequencing analysis of their cDNAs predicted that the indA, indB, and indD genes encoded 335, 268 and 282 amino acids, respectively. IndA displayed sequence homology to the FAR1 family of plant nuclear proteins involved in phytochrome signal transduction, yet IndB or IndD showed no homology to any genes or proteins characterized to date. Interactions of NsdD-IndB and NsdD-IndD were verified in vitro and in vivo using a GST-pull down assay and co-immunoprecipitation, respectively. Furthermore, mapping of NsdD interaction domain(s) demonstrated that IndB and IndD bound to the zinc finger domain of NsdD. In vitro and in vivo chromatin immunoprecipetation (ChIP) assay revealed that binding of IndB or IndD to NsdD inhibited auto-regulation of NsdD by binding to the GATA elements in its own promoter. Vegetative growth was reduced in ΔindD bot not in ΔindB. Null mutants of indB or indD were normal in sexual development, however, mutants disrupted both in indB and indD displayed uncontrolled cleiostothecial formation during sexual development, resulting in continuing production of mature and immature cleistothecia. In contrast, over-expression of IndB or IndD blocked sexual development in veA^(+) strains. Interestingly, expression levels of indB and indD were significantly increased in the sexually-impaired ΔveA mutant. Thus, the novel proteins, IndB and IndD, function as negative regulators of sexual development through interaction with NsdD. The incresed expression of indB and indD may explain the defective sexual development in the ΔveA mutant.

Aspergillus nidulans에서 siderophore의 합성과 분비에 G 단백질이 미치는 영향

강지영 전북대학교 대학원 2007 국내석사

G 단백질은 진핵생물의 신호전달 체계에 있어서 중요하게 작용하는 기작이다. 이 신호전달 체계가 미생물이 mammalian cell에 감염함에 있어서 하나의 중요한 단계가 되는 siderophore에 어떻게 영향을 미치는지를 알아보기 위해 Aspergillus nidulans를 이용하여 알아보았다. A. nidualns의 G 단백질 돌연변이 균주에서 siderophore를 검출하고 siderophore를 합성하는 enzyme을 암호화하는 sidA 발현량을 확인함으로써 이들의 상관관계를 알 수 있었다. A. nidulans의 heterotrimeric G protein 중 Gα를 암호화하는 ganB는 sidA의 발현과 TAFC의 분비를 양성적으로 조절하며 veA는 sidA의 발현에는 음성적으로 조절하지만 TAFC의 분비에는 관여하지 않는 것으로 보인다. 그러나 veA1 일때는 sidA의 발현에는 영향을 미치지 않지만 TAFC 분비에는 음성적으로 조절한다. 그리고 FadA는 TAFC의 분비에는 양성적으로 작용하지만 sidA의 발현에는 관여하지 않는다. ganA는 이 둘 다에 영향을 미치지 않았다. 유일한 Gβ subunit인 sfaD는 sidA의 발현량과 TAFC의 분비에 모두 양성적으로 작용하였다. 이것으로 G 단백질 중 fadA와 ganB, sfaD가 siderophore의 합성 또는 분비에 관여하고 있다는 것을 알 수 있었다. 그래서 이들의 신호전달 체계가 하위에 존재하는 어떤 단백질과 연관되어 있는지 알아보기 위해 MAP Kinase중 하나인 mpkC돌연변이 균주에서 siderophore의 합성 또는 분비량을 확인해 보았다. 이 결과 mpkC는 ganA 돌연변이에서 보였던 것처럼 모두 영향을 미치지 않았다. 이것으로 ganA와 mpkC의 연관성을 추측해 볼 수 있다. 그리고 더 나아가 다른 signal pathway를 선택하여 siderophore의 합성과 분비를 조사함으로써 fadA와 ganB 또는 sfaD:gpgA의 하위단계에 존재하여 siderophore의 합성 또는 분비에 관여하는 pathway를 밝힐 필요가 있다. G protein is an essential mechanism in signal pathway in eukaryotic organisms. Aspergillus nidulans have the mechanism of heterotrimeric G protein which was composed of α, β and γ subunit. fadA, ganA and ganB are encoding the Gα subunit. Also, sfaD and gpgA are encoding the Gβ and Gγ subunit, respectively. When iron was lacking in environment, microorganisms secreted the siderophore to uptake the insoluble iron. In addition, the secretion of siderophores is a key step in the infection of mammalian cell by the microorganism. A. nidulans produces two major siderophores : it secretes triacetylfusarinine C (TAFC) and contains ferricrocin (FC) intra -cellularly. These siderophore was synthesized by SidA which is the enzyme acts on initial step of the biosynthetic pathway. For understanding of the interactions between G protein and siderophore, we investigated the detection of TAFC and the expression of sidA. ganB positively regulated the expression of sidA and the secretion of TAFC but veA negatively regulated those. fadA positively regulated the secretion of TAFC but is not involved in the expression of sidA. ganA is not involved in both the secretion of TAFC and the expression of sidA. sfaD positively regulated the expression of sidA but is not involved in the secretion of TAFC. As these results, we known that the biosynthesis and secretion of siderophore are regulated by fadA, ganB and sfaD. Therefore, we investigated the accumulation of sidA transcript and the secretion of TAFC in mpkC mutants for under- standing whether MAP kinase protein exists under the signal pathway. These results showed that the pathway through mpkC does not have any effect like ganA mutants. These findings suggested that there may be an interaction between ganA and mpkC. In conclusion, our studied showed that fadA, ganB, sfaD and veA effect on siderophore secretion and biosynthesis. Consequently, these result suggested that the study on the interaction between other proteins related with G protein signaling and other proteins related with siderophore biosynthesis pathway could become one of the important data for understanding the action mechanism concerning iron uptake of A. nidulans.

Aspergillus nidulans에서 cycliheximide에 민감성을 보이는 chxA 유전자의 기능 분석

이규선 배재대학교 대학원 2010 국내석사

Cycloheximide (CHX)는 진핵세포 80S 리보솜의 60S subunit에 특정한 결합을 하여 tRNA translocation을 억제하고, 리보솜에서의 tRNA 유리를 저해함으로써 폴리솜을 축적해 단백질 합성을 억제하는 항생물질이다. 본 연구실의 선행연구자는 사상성진균인 Aspergillus nidulans를 대상으로 과발현시 CHX에 저항성을 보이는 유전자를 분리하였고 이를 chxA라 명명하였다. chxA null mutant는 CHX에 매우 민감하였고 chxA 과대발현 균주는 CHX에 저항성을 보였다. CHX 외에 다른 항생제인 erythromycin, kanamycin, gentamycin에는 야생주와 동일한 민감도를 나타내었고 단백질 합성억제 항생제인 hygromycin B에 대해서는 △chxA는 매우 민감성을 보였고, chxA 과대발현 균주는 저항성을 나타내었다. ChxA는 Aspergillus 종에서만 유사단백질이 예견되었고 효모나 다른 종의 사상성진균에서는 나타나지 않아 종 특이성 유전자일 것으로 예측되었다. 하지만 ChxA 유사단백질들 사이에서도 N-terminus의 A, B, 그리고 C 부위와 C-terminus 끝 부분의 D 부위가 잘 보존되어있는 반면 다른 부위들의 유사도는 낮았다. ChxA가 과대발현 시 CHX에 저항성을 보이는 부위가 어디인지 조사하기 위하여 ChxA 단편들을 제조하였고 과발현을 통해 CHX 민감도를 확인하였다. 그 결과, CHX에 저항성을 보이기 위해서는 최소 N-terminal 부분의 A와 B부위를 가져야 하고 C-term 끝부분인 D부위는 CHX에 저항성을 보이는 데 영향을 미치지 않았다. 반면 ChxA의 C부위의 과대발현은 CHX에 민감한 형질을 나타내 완전한 ChxA의 과발현에 의한 CHX 저항성과는 반대의 표현형질을 나타내었다. ChxA는 LexA DBD와 융합하여 발현시켰을 때 LexA 결합부위가 포함된 reporter의 발현을 유도하는 transactivation 능력을 나타내었다. ChxA truncated 단백질들의 transactivation 능력 조사를 통해 N-term 부분의 A와 B부위를 포함하는 토막이 transactivation에 관여하는 부위로 확인되었다. Split-ubiquitin yeast two-hybrid 분석을 수행하여 ChxA가 homo-complex를 형성함을 확인하였다. 선행 연구에서 효모의 GAAC (general amino acid control) pathway에 관련된 Aspergillus homolog 유전자들의 돌연변이체들에서 CHX 저항성 또는 민감성이 나타남이 보고되어 chxA와 GAAC patheway와의 상관관계를 조사하였다. 효모에서 eIF2 kinase Gcn2의 활성화에 관여한다고 알려진 GCN1과 GCN20 복합체의 Aspergillus homolog인 gcnC와 gcnA의 null mutant들은 CHX에 저항성을 나타내었으나, ΔgcnC;ΔchxA double mutant에서는 CHX 민감성을 확인하였다. 하지만 ΔgcnC와 ΔgcnA에서의 chxA transcript 발현 양상은 야생주와 동일하였다. gcnA, gcnC, 및 cpcA 유전자들은 chxA와 유사하게 CHX 처리시 transcript 발현증가가 확인되었으나 이러한 증가는 ΔchxA에서도 동일하였다. Cycloheximide (CHX) is a translation inhibitor to prevent translocations and a separation of tRNAs from ribosome by accumulating a store of polysome and stops synthesis of protein. Previously in our lab, ORF causing high CHX-resistance phenotype was identified and named chxA in A. nidulans. ChxA over-expressed strains showed high CHX-resistant phenotype while chxA null mutants exhibited CHX-sensitivity as well as hygromycin B sensitivity. Introductions of chxA genomic DNA to chxA null mutant resulted in complementation to the CHX-sensitive phenotype of chxA. chxA was found only in Aspergillus species as a genus specific gene. Domain mapping of ChxA was done to define which fragments of ChxA were responsible for its CHX-resistant phenotype. A variety of truncated ChxA mutants were generated and over-expressed in wild type. As a result, several truncates of ChxA exhibited CHX-resistance phenotype like ChxA full-sized protein while interestingly some fragments caused CHX sensitivity when over-expressed. The A and B regions of the ChxA N-teminus, which were well conserved amomg ChxA homologs in Aspergillus species were responsible for CHX-resistant phenotype whereas C portion in the middle caused CHX-sensitivity. ChxA showed transactivation abilities in the test of yeast two-hybrid assay. ChxA fused to LexA-DBA was able to express the reporter genes in yeast. The A and B regions of the ChxA N-terminus were shown to contain transactivation domains. Using a split ubiquitin yeast two-hybrid assay system, we were able to demonstrate that homo-complex of ChxA existed. We further tested relationship between chxA and genes in the GAAC (general amino acid control) pathway. cpcA expression was highly enhanced with CHX treatment as found in chxA. ActA1 and its null mutant gcnC as well as gcnA null mutant exhibited CHX sensitivity, while △cpcA showed CHX-sensitive phenotype. △chxA;ActA1 and △chxA;△gcnC double mutants showed CHX-sensitivity indicating that ChxA was required for their CHX-resistant phenotype. However, chxA expression was not changed in ActA1 and △gcnC.

Aspergillus nidulans의 저산소 환경 생장에 필요한 hitB 유전자의 기능 분석

곽준용 배재대학교 2010 국내석사

SREBP(sterol-regulatory element binding protein)는 포유류 세포에서 콜레스테롤 합성과 지방산 합성을 조절하는 막결합 전사인자로 알려져 있다. 최근 S. pombe에서 SREBP의 homolog인 Sre1은 산소량이 적은 환경에서 생존에 필요한 유전자들의 발현을 유도하는 것으로 알려졌다. 본 연구실의 선행 연구에 의하여 사상성 진균인 Aspergillus nidulans에서 SREBP의 homolog인 HitA가 저산소 환경에서의 생장을 위해 필수적으로 요구되는 유전자라는 것이 밝혀졌다. 본 연구에서는 HitA와 유사한 N-terminal 부위를 갖고 있으나 HitA와 SREBP에 존재하는 막 결합 도메인과 C-terminal이 결여된 hitB 유전자의 기능 분석을 시도하였다. HitB가 저산소 생장에 관여하는지 알아보기 위해 null mutant를 제작하였다. 그 결과, △hitB는 저산소 조건에서 자라지 못하였고, 이는 HitB도 HitA와 마찬가지로 A. nidulans의 저산소 생장에 필요한 유전자임을 확인할 수 있었다. △hitB는 △hitA와 다르게 hydroxyurea와 항진균제인 itraconazole에 야생주와 유사한 민감도를 보여 HitA와 HitB의 기능적 차이를 보였다. HitA의 N-terminal이 HitB와 유사하므로 △hitB에 과발현 하였을 시 hypoxia-sensitive phenoteype을 보완할 수 있는지 여부와 반대로 HitB의 과발현으로 저산소 조건에서 △hitA의 생장을 보완할 수 있는지 조사하였다. 그 결과, HitB의 과대발현은 △hitA의 저산소 조건에서 성장 결여를 보완하지 못하였고, 반면에 HitA의 과발현은 △hitB의 성장을 보완할 수 있었다. 특히 저산소 조건에서 활성화되는 최종 부위인 HitA N-terminal 부위를 과발현 시켰을 때 △hitB의 성장이 야생주 정도로 보완되었다. hitB의 발현을 northern 분석을 통해 확인해본 결과 저산소 조건에서 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, hitA와 hitB 유전자의 결여는 이들 상호간의 유전자 발현에도 영향을 미쳤다. 즉 △hitA에서는 hitB 발현의 감소가 △hitB에서는 hitA 발현이 증가하였다. HitA와 HitB의 직접적인 발현 유도를 확인하기 위해 면역침강 (ChIP) 분석을 수행한 결과, HitA는 hitB의 promotor에 결합하였으나 반면 HitB는 hitA의 promotor에 결합하지 않았다. 세포 내 HitB의 위치를 확인하기 위하여 RFP와 융합된 HitB 단백질을 발현하였고 형광현미경으로 관찰한 결과 HitB는 핵에 위치하였다. HitB가 homo-multimer를 형성하는 지를 in vitro resin binding assay를 수행하였고 western 분석을 통해 HitB가 상호 결합함을 확인하였다. 나아가 HitA N-terminal과 HitB의 heterodimer도 확인하였다. SREBP (sterol-regulatory element binding protein) is a ER membrane tethered transcription factor that controls synthesis of cholesterol and fatty acid in mammalian cells. Recently, Sre1 a S. pombe homolog of SREBP was identified that Sre1 induces transcription of hypoxic genes for it's survival in low-oxygen environment. In preceding study of our lab, HitA, a Aspergillus nidulans SREBP homolog was shown to be essential for hypoxic growth in A. nidulans. In this study, we analyzed the hitB gene of which product had amino acid similarities to the N-terminus but lacked the transmembrane domain and the C-terminus found in HitA and SREBP. hitB null mutants were constructed and confirmed by Southern and norther analysis. △hitB failed to grow in hypoxic condition similarly shown in △hitA. This indicated that hitB was also required for hypoxic growth in A. nidulans. However, differing from △hitA, △hitB did not demonstrate hydroxyurea (HU) and itraconazol sensitivities. Tests were further performed to see the N-terminus of HitA or HitA could complement the hypoxia-sensitive phenotype of △hitB. As a result, the hypoxic growth deficiency of △hitB was complemented by over-expression of HitA and the HitA N-terminus. Over-expression of the HitA N-terminus in △hitB caused better complementation than HitA. On the other hand, the hypoxia-sensitive phenotype of △hitA did not complemented by over-expression of HitB in hypoxia. hitB transcript level was enhanced in hypoxic condition as seen for hitA. Furthermore, hitA and hitB affected each other on their gene expressions. A transcript level of hitB was decreased in △hitA, while hitA transcripts were increased in △hitB. We further confirmed direct binding of HitA to the promoter of hitB by ChIP assay. However, HitB failed to bind to the hitA promoter. HitB was localized to the Nucleus based on the observation of HitB-RFP fusion proteins with a fluorescence microscope. We were also able to show that HitB interacted with the HitA N-terminus to form heterodimer as well as with HitB for homo-multimer as the results of in vitro resin binding assay.

Regulation of gene expression for cell wall biosynthesis in Aspergillus nidulans : Aspergillus nidulans에서 세포벽 합성 유전자들의 발현 조절

박범찬 충남대학교 대학원 2002 국내박사

세포벽 합성의 시공간적인 조절은 곰팡이의 생장과 분화과정 동안 일어나는 형태발생과정에 있어 결정적인 역할을 한다. 키틴과 베타-1,3-글루칸은 곰팡이 세포벽의 주요 구조 성분으로 세포벽의 물리적인 견고함을 제공한다. 따라서, 키틴 생합성 효소 유전자와 베타-1,3-글루칸 생합성 효소 유전자의 발현 조절 기작을 밝히는 것은 복잡한 곰팡이의 형태발생 과정을 이해하는데 크게 기여할 것이다. Aspergillus nidulans에서는 다섯 개의 키틴 생합성 효소 유전자가 알려졌으며, chsA, chsB, chsC, chsD, 그리고 csmA로 명명되었다(Yanai 등, 1994; Motoyama 등, 1994; 1997; Fujilwara 등, 1997). A. nidulans의 생장과 분화과정 동안 이들의 발현양상이 어떠한지 알아보기 위하여 Northern blot 분석을 수행하였다. 우선 모든 키틴 생합성 효소 유전자들의 전사는 세포주기에 따라 조절되었다. 대체로 모든 유전자들은 Gl기에 발현량이 최대였으며, G2기에 가장 적게 발현되었으나 발현 양상에 따라 크게 두 가지 그룹으로 구분되었다. 첫번째 그룹에 속하는 chsA와 chsC는 Gl기 이후 S기에 들어서면서 발현이 감소하기 시작하여 G2 및 M기에서도 발현량이 낮게 유지되었다. 그러나 chsB, chsD 및 csmA가 속한 두번째 그룹은 S기에도 발현량이 높게 검출되었으며, G2기에 급격히 감소하였다가 다시 M기에 증가하였다. 이 결과는 균사생장시 키틴 생합성의 조절이 일차적으로 유전자들의 전사단계에서 이루어짐을 시사하는 것이다. 키틴 생합성 효소 유전자들의 차별 발현 현상은 분화과정 동안에도 발견되었다. chsA의 발현은 주로 무성분화에만 국한되어 일어난 반면, chsB 는 생장과 분화의 모든 시기에 높은 수준으로 전사가 유지되었다. chsD 와 csmA의 발현 역시 대부분의 시기에서 관찰되었으나 chsD는 무성분화 과정 중에, csmA는 유성분화 과정 중에 다소 조절되었다. 한편 chsC의 발현은 이 곰팡이의 모든 생활사 동안 키틴 생합성 효소 유전자중 가장 변화가 심했다. 무성분화 시기에 발현양상의 변화가 일어나는 chsA, chsC 및 chsD의 전사 수준은 abaA 돌연변이주에서 크게 감소하였다. EMSA 분석 결과, AbaA 단백질은 chsC의 프로모터에 존재하는 세 개의 결합부위(ARE) 모두에 강하게 결합하였다. 또한 Saccharomyces cerevisiae의 발현 시스템을 이용한 실험에서도 AbaA 단백질을 통한 chsC의 전사유도가 확인되었다. 따라서 이 결과들은 무성분화 조절 인자인 AbaA 단백질이 chsC를 비롯한 몇몇 키틴 생합성 효소 유전자들의 전자 조절을 통해 분화에 필요한 세포벽 성분의 합성을 조절함을 의미하는 것이다. 다수의 키틴 생합성 효소 유전자들과 달리, 베타-1,3-글루칸 합성 효소의 유전자는 현재까지 한 개가 알려져 있으며, fksA로 불린다. fksA의 발현은 세포주기에 따라 조절된 반면, 대부분의 시기에서는 급격한 발현수준의 변화가 일어나지 않았다. 그럼에도 불구하고, fksA의 전사는 또 다른 무성분화 조절 인자 중 하나인 StuA 단백질에 의해 조절될 것으로 보인다. 왜냐하면 fksA의 전사가 야생 균주에서보다 stuA 돌연변이주에서 변화가 심했으며, fksA의 프로모터에는 세 개의 StuA 단백질 결합 부위(StRE)가 존재하였기 때문이다. EMSA 분석 결과에서도, StuA 단백질의 DNA 결합부위는 이들 세 개의 StRE들 모두 또는 일부와 결합하였다. 유전자 파괴에 의해 ΔchsC 돌연변이주를 제조하였다. ΔchsC 돌연변이주의 키틴 생합생 효소 활성도는 야생형 균주에 비해 6배 가량 감소됨이 확인되었다. 또한 ChsC 단백질의 생화학적 특징이 일부 밝혀졌는데 이 단백질은 세포내에서 zymogen 형태로 존재하며 Mg^(2-)가 활성을 위해 필요하였다. 한편, ΔchsC 돌연변이주의 생장 속도는 야생형 균주에 비해 더 빠른 반면, 무성포자 생성률은 40% 가량 감소되었다. 게다가 이 균주를 오래 배양하면 마치 기균사 덩어리와 같은 미확인 기관의 형성이 유도되었다. 또한 chsC 유전자의 파괴는 유성분화 기관인 cleistothecium의 형성에 심각한 결함을 일으켜 돌연변이주의 경우 이 기관의 분화가 지연됨과 동시에 극히 낮은 생성률을 보였다. 따라서 chsC는 A. nidulans의 생장과 분화에 있어서 일정한 역할을 할 것으로 예상되며, 특히 유성 분화시에 중요한 역할을 할 것으로 사료된다. The temporal and spatial regulation of cell wall biosynthesis plays a decisive role in morphogenesis during fungal growth and development. Chitin and β-l,3-glucan are major structural components of the fungal cell wall and mainly provide mechanical strength of the wall. Therefore, the elucidation of the regulation mechanism of gene expression for chitin synthase and β-1,3-glucan synthase contributes to the understanding complex fungal morphogenesis. Five different chitin synthase genes (chss) have been identified in Aspergillus nidulans, and designated chsA, chsB, chsC, chsD, and csmA. To figure out the expression pattern of the chss during growth and development of A. nidulans, Northern blot analysis was performed. The transcription of the all chss showed a cell cycle-regulated pattern maximal during the G1 phase and minimal in the G2 phase. The expression pattern of chss was classified into two groups. Group one, containing chsA and chsC, showed decreasing transcription level upon entry into the S phase and no further variation during the remainder of the cell cycle. However, group two, containing chsB, chsD, and csmA, showed sharp transcription level decrease upon entry into the G2 phase and increase during the M phase. These results suggest that chitin synthesis during vegetative growth can be primarily regulated at the level of transcription. Differential expression pattern of chss was also found during development of A. nidulans. While chsA expression was detected mainly during asexual development, the elevated level of chsB transcripts was remained throughout growth and development. The expression of chsD and csmA was somewhat regulated during asexual development and during sexual development, respectively. The expression level of chsC was significantly fluctuated at all stages of the life cycle. Northern blot analysis showed that the transcription level of chsA, chsC, and chsl) was significantly decreased in an abaA mutant. Electrophoretic mobility shift assays revealed that AbaA bound tightly to all three ARES (AbaA response elements) in the chsC promoter region. Experiments with the Saccharomyces cerevisiae heterologous expression system confirmed AbaA-dependent transcriptional activation of chsC. Taken together, these data suggest that AbaA plays an important role in chitin biosynthesis during conidiophore development by controlling the transcription level of certain chitin synthase genes. In contrast to chss with multiplicity, only one gene for β-1,3-glucan synthase has been reported to date and named fksA. The fksA expression was regulated in the cell cycle, but intensive variation of transcription level was not detected during most of periods for growth and development. Regardless of the constant expression however, the transcription of fksA may be regulated by StuA. fksA transcription was more fluctuated in stwl mutant than that of in wild type and three putative StREs (StuA response elements) were found in fksA promoter. EMSAs showed that StuAbd fkion protein formed a specific complex with all or some of the three StREs. A chsC null mutant was constructed by gene disruption. Chitin synthase activity in the ΔchsC strain was found to be about 6-fold lower than that in wild- type strain. ChsC exists as a zymogenic form in vivo and Mg^(2+) is required for the activity. While the radial growth rate of the AchsC strain was faster, conidiation efficiency of the mutant was less than 40% of that of the wild type strain. Besides, long incubation induced the formation of unidentified organs like lumps of aerial hyphae. Disruption of chsC also caused severe defect in the formation of cleistothecium. Retardation and low frequency of cleistothecium development was observed in the ΔchsC mutant.

Aspergillus nidulans에서 과대 발현 시 cycloheximide에 저항성을 나타내는 chxA 분리 및 분석

양혜진 배재대학교 대학원 2008 국내석사

Cycloheximide는 진핵세포 세포질 ribosomes에 tanslation을 억제하는 항생제이다. 진핵세포의 80S리보솜의 60S 서브유닛에 작용하여 펩티드 사슬 연장에서의 전이반응을 저해함으로써 단백질 생합성을 저해하며 리보솜에서의 tRNA유리를 저해하여 폴리솜을 축적한다. 본 연구에서는 사상성 진균인 Aspergillus nidulans를 대상으로 cycloheximide의 단백질 합성 억제 기작을 자세히 알아보고자 과대발현 시 Cycloheximide에 저항성을 나타내는 유전자를 분리, 분석하였다. A. nidulans A773 균주에 A. nidulans genomic DNA library 를 형질전환 하여 cycloheximide에 저항성을 나타내는 형질전환체를 선별하였다. 그 결과 cycloheximide에 저항성을 나타내는 형질 전환체 Tf.12 1개를 선별할 수 있었다. 형질 전환체에서 genomic DNA를 수확한 후에 E. coli에 형질 전환하여 분리한 library DNA를 다시 한 번 A773에 형질 전환하여 CHX에 저항성을 나타냄을 확인하였다. Vector primer set(PUCR, PUCH)를 이용하여 insert DNA의 염기서열을 결정한 뒤 blast search를 한 결과 insert size는 약 1797bp이고, Chromosome III번에 위치하고 있었으며, 한 개의 완전한 ORF인 AN4654를 포함하고 있었다. AN4654는 581개의 amino acid를 encoding하고 있으며, 1개의 intron을 포함하고 있었다. 그리고 NLS(Nuclear Localization Signal) 790a.a, 870a.a 부분에 2개를 가지고 있었다. AN4654가 과대발현 시 CHX에 저항성을 타나내는지를 조사하기 위하여 Nitrate에 의하여 유도 될 수 있는 niiA 프로모터를 이용하여 chxA단백질을 세포 내에서 과대발현을 유도하였다. 결과 cycloheximide에서 저항성을 보이는 transformants이 나타났으며 이들은 AN4654.가 Northern분석을 통해서 과대발현 되었음을 확인하였다. AN4654의 기능을 알아보기 위하여 chxA유전자가 제거된 null mutant를 제조하였다. Delition을 위한 DNA construct는 double-joint PCR(DJ-PCR)방법으로 제조하였고, Southern analysis, PCR 분석으로 확인하였다. △chxA은 cycloheximide배지에 매우 민감함을 나타냈다. Mutagen처리 시에도 민감성을 나타내는지를 확인하기 위하여 HU, KCN, MMS에서 관찰한 결과 Cyclohecimide와는 달리 야생주와 동일하게 자라는 것을 확인 할 수 있었다. localization을 보기위해서 A. nidulans GFP vector에 cloning하여 확인하였다. Threonine으로 유도되는 alcA프로모터를 이용하여 ChxA 단백질을 세포 내에서 과대발현을 유도하여 Northern 분석을 통해서 과대발현 된 phenotype을 확인하여 현미경으로 핵의 위치를 관찰하였다. AN4654는 핵보다는 단백질 합성이 일어나는 ER에 위치하는 것으로 보였다. Cycloheximide (CHX) is an antibiotic that inhibits translation on eukaryotic cytoplasmic ribosomes. However, detailed action mechanism of CHX has not been understood. Thus, we isolated genes whose over-expression caused CHX resistancy in A. nidulans. Genomic DNA library constructed in an AMA1 based vector which replicated in cytoplasm instead of integration into the main chromosome was transformed to A773, a host strain. Transformants were selected on CM, then replicated into CM containing 5 mM CHX to isolate CHX-resistant colonies among transformants. Tf12 was selected as a CHX-resistant colony. The transformed gDNA was rescued by transformation into E. coli with genomic DNA purified in Tf12. The rescued single gDNA clone (#1) was re-transformed into A773 to demonstrate CHX-resistancy of transformants. Indeed, CHX-resistant transformants were reappeared in transformation of #1 DNA from Tf12. The inserted gDNA fragment within AMA1-vector was sequenced using a vector primer pairs. The determined DNA sequence made possible to localize the region in a specific chromosome III. By searching the A. nidulans gDNA sequence database, one full-length ORF, AN4654 was identified within the gDNA of #1 from TF12. To confirm that over-expression of the identified ORF caused CHX-resistancy in transformants, transformants with AN4654 cDNA under the nitrate inducible niiA promoter were selected and tested CHX-resistancy. Indeed, over-expression of AN4654 cDNA resulted in CHX-resistancy in transformants. So, we named an AN4654 ORF chxA. Sequencing analysis revealed that chxA ORF was 1.7Kb interrupted by 1 intron, encoding a putative polypeptide of 581 amino acids. The blastp search with ChxA did not show any amino acid sequence match except homologs among Aspergillus genus. We generated null mutant of chxA using a double-joint PCR (DJ-PCR) method and characterized its null phenotype. Disruption of chxA was confirmed by southern analysis, PCR, and northern analysis. △chxA mutants exhibited extreme CHX-sensitivity compared to wild-type. Since ChxA contains putative nuclear localization signal (NLS) sequences, ChxA-sGFP fusion protein was expressed and checked its localization in the cell. Localization of ChxA was not correlated to the nucleus stained with DAPI, indicating that ChxA is not a nuclear protein, although in some conditions nuclear translocation of ChxA might not be excluded. For the moment, ChxA seems to be located in ER. ChxA is certainly related to CHX action within the cell. However, more detailed studies will be required to understand the function of ChxA and the relationship to CHX.

Functions of CsgA in fungal development and mycotoxin production in Aspergillus spp. : Aspergillus 종의 균 성장 및 진균 독소 생성에 있어 CsgA의 기능

조혜진 경북대학교 대학원 2022 국내석사

Aspergillus 종은 주로 무성 생식을 통해 번식한다. 무성 포자의 형성 과정에는 다양한 전사인자들이 관여한다. 우리는 사전에 진행한 전사체 분석을 통해 20개의 무성 포자 특이적 전사인자들을 밝혔다. 본 연구에서 우리는 그 중 하나의 무성 포자 특이적 전사 인자인 CsgA를 발굴하였다. CsgA는 Zn2Cys6 전사 인자 중 하나로 GAL4 유사 아연-집게 DNA 결합 부위를 가지고 있다. CsgA의 기능은 모델 생물인 A. nidulans와 아플라톡신 생성균 A. flavus에서 규명하였다. A. nidulans에서 csgA 결실 돌연변이는 대조군 대비 무성 포자 생성력과 균 성장력이 증가하였다. csgA가 결실된 돌연변이는 유성 생식에 결함을 보였다. 하지만 csgA가 과발현 되었을 때 무성 포자 생성력이 감소하였고 유성 생식력은 증가하였는데, 이는 곧 CsgA가 A. nidulans의 무성 생식과 유성 생식의 균형을 조절하고 있음을 의미한다. 무성 포자에서, csgA 결실 돌연변이는 무성포자의 스트레스 내성에 영향을 미치는 트레할로스의 생합성이 증가되었다. 이에 따라 csgA 결실 돌연변이의 포자 생존 능력 또한 증가하였고, 대조군 대비 고온, 산화적 스트레스, 그리고 UV 조사에도 내성을 띄는 것을 확인하였다. A. nidulans가 생산하는 진균 독소인 sterigmatocystin의 생산량은 csgA 결실 돌연변이에서 증가하였다. A. flavus에서 AflcsgA 결실 돌연변이는 무성 포자 생성 능력은 증가하였지만 균 성장력은 감소하였다. 대조군과 비교하였을 때, 비정상적인 유성 생식 능력을 보였다. A. flavus가 생산하는 진균 독소인 아플라톡신의 생산량은 대조군 대비 AflcsgA 결실 돌연변이가 매우 낮은 것을 확인하였다. 이를 모두 종합해보면, CsgA는 A. nidulans와 A. flavus의 적합한 균 성장과 진균 독소 생성에 중요한 역할을 함을 알 수 있다. Aspergillus spp. mainly reproduce through asexual reproduction. The process of asexual spore (conidia) formation is controlled by various transcription factors. Our previous transcriptomic analysis identified twenty conidia-specific transcription factors. In this study, we characterized one of conidia-specific transcription factors CsgA which is Zn2Cys6 transcription factor containing the GAL4-like zinc-finger domain. The roles of CsgA were investigated in two Aspergillus species, the model organism Aspergillus nidulans and the aflatoxin producer Aspergillus flavus. In A. nidulans, the csgA deletion mutants showed increase in conidiation and fungal growth. Deletion of csgA exhibited defect in sexual development. Overexpression of csgA resulted in decreased conidiation and increased sexual development, suggesting that CsgA acts as a balancer between asexual and sexual development in A. nidulans. In conidia, deletion of csgA resulted in increased trehalose biosynthesis and higher tolerance to thermal, oxidative, and UV stresses. The production of sterigmatocystin increased in the csgA deletion mutant conidia than control. In A. flavus, deletion of csgA showed decrease in fungal growth, but increase in conidiation. The csgA deletion mutants exhibited abnormal sexual development and aflatoxin production in A. flavus. Overall, CsgA plays crucial roles in proper development and mycotoxin production in A. nidulans and A. flavus.