Effect of gistamine in the regulation of atrial ANP release : ANP 분비 조절에서 histamine의 역할

이단 Graduate School, Chonbuk National University 2003 국내박사

Copolymers of p-dioxanone, L-lactide and polyethylene glycol : Synthesis, properties and biomedical applications : p-dioxanone, L-lactide 와 polyethylene glycol의 공중합체 : 합성, 특성 그리고 생체재료의 응용

나라얀바타라이 Chonbuk National University Graduate School 2003 국내박사

A series of triblock copolymers, consisting of a poly(ethy1ene glycol) center block joined with two blocks of random p-dioxanone-co-L-lactide copolymers have been synthesized by ring opening polymerization of p-dioxanone (PDO) and L-lactide (LLA) initiated by the poly(ethy1ene glycol) (PEG) in the presence of Sn(Oct)_(2) catalyst. The resulting copolymers have been characterized by various techniques including ^(1)H and ^(13)C nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), Foureir transform infrared (FTIR) spectroscopy, gel permeation chromatography (GPC), inherent viscosity, wide angle X-ray diffractometry (WAXD) and differential scanning calorimetry (DSC). The conversions of PDO and LLA into the polymer has been studied in the various mole ratios and at different polymerization temperatures from the ^(1)H NMR spectra. Results of XRD and DSC showed that the crystallinity of PEG macroinitiator was greatly influenced by the composition of PDO and LLA in the copolymer. Crystallization and melting behaviors of series of the ABA type block copolymers; where A is poly(p-dioxanone) (PPDO), poly (L-lactide) (PLLA) or poly(p-dioxanone-co-L-lactide) (PPDO/PLLA) and B is poly (ethylene glycol) (PEG) block, have been studied by DSC, WAXD and polarizing microscope (PM). The effect of the A/B ratios on the melting and crystallization behaviors of the copolymers was investigated in both conditions of crystallization ie., in the melt crystallization and in the crystallization from the melt quenched specimens. Furthermore, the preliminary results based on the analysis of the crystallinity and morphology changes during the hydrolytic degradation of the copolymers, have also been discussed. Nonisothermal crystallization and melting behaviors of poly (p-dioxanone)-b-poly (ethylene glycol) (PPDP-b-PEG-) with mole ratios of 80/20 and 30/70, has been studied using DSC with various cooling rates. Crystallization behavior of each crystallizable segments of the copolymer was compared with the corresponding segment of homopolymer. The kinetics of the PPDO segments and the PEG segments in the copolymers under nonisothermal crystallization conditions were analyzed by Ozawa equation and also the crystallization results of the copolymer segments were compared with the corresponding homopolymers. Crystallization activation energy and absolute crystallinity values were estimated from the cooling scans (using Kissingers method) and fusion endotherms of the subsequent heating scans, respectively. Ability of the copolymer (PPDO/PLLA-b-PEG-) coontaining higher fraction of PEG segment to self-assemble into nanoscopic structures in aqueous solution has been determined by viscometery, dye solubilization, ^(1)H NMR spectra and dynamic light scattering. The trypan blue assay for in vitro biocompatibility of the block copolymer was carried out with NIH 3T3, CT-26 and MCF-7 cells, and P-glactosidase assay was applied to measure the transfection efficiency of the copolymer on MCF-7 breast cancer cell. Copolymer was found to have almost no cytotoxic effect and was able to promote the transfection efficiency (about three fold) in MCF-7 cells. Nanofibrous matrix of the copolymer (PPDO/PLLA-b-PEG-) has been prepared by electrospinning technique and applied to examine cell proliferation, growth, morphology, and cell-matrix interaction. The electrospun structure composed of PPDO/PLLA-b-PEG- fibers with an average diameter of 380 ㎚, median pore size 8 pm, porosity more than 80% and mechanical strength 1.4 MPa, has been found favorable for cell matrix interaction and supports the active biocompatibility of the structure. NIH/3T3 fibroblast cell seeded on the structure tends to maintain phenotypic shape and guided growth according to nanofiber orientation.

Some estimations of pluricomplex green functions : 플루리 콤플렉스 그린 함수의 평가

백진수 Chonbuk National University Graduate School 2003 국내박사

전통적으로 potential 이론은 Newton의 중력이론에 바탕을 두고 있으며 Lagrange, Laplace그리고 Legendre의 연구업적이 이 분야의 발전에 기초가 되었다. 특히, Euler는 라플라스 방정식을 처음 생각하여 유체의 흐름을 연구하였다. Potential 이론을 연구하는 과정에서 Green의 업적이 매우 중요함을 알 수 있고, Green의 정리는 이 분야의 초보적 과정에서 시발점이 된다. 19세기 중엽에 2변수의 Potential 이론이 복소해석학에 접목되었으며, 이것은 해석함수의 실수부와 허수부가 조화함수라는 것과 R^2내에서 라플라스 연산자가 양정칙 사상하에서 불변하다는 사실에 기초하고 있다. Pluripotential이론은 새로운 분야이며 여기서 다루는 다중 열조화 함수들은 Lelong과 Oka에 의해서 소개되었으며 다중 열조화 함수의 상대적 유연성은 해석함수들과 비유된다. 본 논문에서는 복소해석학의 어떤 분야에도 유용할 뿐만 아니라 pluripotential 이론의 연구에 있어서 매우 가치 있는 도구로 입증된 pluricomplex Green 함수에 관계된 성질을 연구하였다. Pluricomplex Green함수는 Laplace 연산자에 대한 전통적 Green함수와 매우 유사하고 또한 복소 Monge-Ampe're 연산자에 대한 기본해임이 잘 알려져 있다. 2절에서는 Kobayashi 계량, Lempert 함수 및 Kobayashi 거리의 개념을 다루고 Kobayashi 계량과 거리간의 관계를 설명하였다. 3절에서는 나중에 사용될 열조화 함수와 다중 열조화 함수들의 성질들을 다루었다. 4절에서는 하나의 극을 갖는 pluricomplex Green 함수와 그의 극치성을 연구하였다. 특히, 하나의 극을 갖는 pluricomplex Green 함수의 특수한 몇개의 예를 열거하였다. 5절에서는 극들을 갖는 pluricomplex Green 함수, 일반화된 Lempert 함수, 해석적 원판을 연구한다. 나아가서 일반화된 Lempert 함수가 극들을 갖는 pluricomplex Green 함수의 상계임을 증명하였다(정리 5.7). 6절에서는 극들을 갖는 pluricomplex Green 함수의 편가(정리 6.3,6.9)와 일반화된 Lempert함수의 평가(정리 6.6,6.11)을 연구한다. 더욱이, pluricomplex Green 함수와 일반화된 Lempert 함수간의 관계를 연구한다(따름정리 6.12).

Water-soluble polyimide precursor : synthesis and characterization of poly(amic acid) salt = 수용성폴리이미드 전구체의 합성과 특성 연구

양준 Graduate School Chonbuk National University 2004 국내박사

A water-soluble polyimide precursor, poly(amic acid) salt (PAD) was synthesized from pyromellitic dianhydride (PMDA) and 4,4'-oxydianiline, and its properties were investigated. The precursor was completely soluble in water up to 4 wt.%, and cast on a glass plate to prepare polyimide film of 20 ~ 35㎛ thickness after a consecutive thermal imidization process. This poly(amic acid) salt aqueous solution shows higher stability to hydrolytic degradation than conventional polyimide precursor, free poly(amic acid) dissolved in highly polar organic solvent. It was also found through FT-IR that the poly(amic acid) salt film obtained from its aqueous solution begins to be imidized at 80℃ and 95% of imidization degree can be achieved at 160℃, These features make this synthesized poly(amic acid) salt a preferred precursor for preparation of polyimide film. In this paper, the synthesis of this poly(amic acid)-dimethyl ethanol ammonium salts (PADs) with different D_(sf) (Degree of Salt Formation) was reported in details and their solubility in water based solvent was examined. It was found that the solubility of PAD in water is closely related to the D_(sf) value, the PAD with higher Dsf has better solubility in water and PAD100 (D_(sf)=100%) can be dissolved in water directly without addition of excess DMEA. Since the polyimide films were obtained from the curing of the PAD100 aqueous solution, the degrees of conversion from the salt polymer precursor to imide have been first determined by FT-IR technique. Physical properties of the thermally cured polyimide films were also presented in this study.

Discretization of nonlinear system with time-delay via taylor series : Taylor-series를 이용한 시간지연 비선형 시스템의 이산화

박지향 Graduate School Chonbuk National University 2004 국내박사

시간 지연이 존재하는 비선형 연속-시간 제어 시스템의 이산 시간 표현을 얻기 위한 새로운 이산화 알고리즘이 제안된다. 이는 Taylor series expansion과 0차 홀드 (Zero-order Hold) 가정을 기반으로 한다. 본 논문은 새로운 이산화 기법의 수학적 구조에 대해서 고려하며 시스템의 이론적 특성과 이산화에 의한 특성 사이의 중요한 연관성에 대해서 설명한다. 특히나, 평형점과 점근적 안정도와 같은 비선형 제어 시스템의 중요한 특성에 대한 이산화 효과가 검증된다. 결과적인 이산화 방식은 시간지연이 존재하는 비선형 시스템에 대해서 유한차원 표현으로 나타나며 이는 존재하는 제어기 설계 기법의 적용을 가능하게 한다. 기초적인 단일 입력 시간 지연 비선형 시스템의 이산화 표현을 시작으로 그것을 확장하여 2-입력 시간 지연, 3-입력 시간 지연 비선형 시스템에 대한 이산 시간 표현을 유도한다. 결과적으로 다중 입력 시간 지연이 존재하는 비선형 시스템에 대한 이산 시간 알고리즘을 개발할 수 있다. 비선형 시스템의 분류상 Non-affine 시스템도 있기에 이 시스템에 대한 이산 시간 표현 역시 같은 접근방법을 사용하여 다룰 수 있다. 제안된 이산화 기법의 성능은 2-DOF를 가지는 펜들륨 시스템에 대한 모의실험을 통해서 평가된다. 이 시스템은 비선형 특성을 나타내며 모의실험에서 다양한 샘플링 주기와 시간 지연 값이 고려된다.

Proteomic analysis of plasma proteins in cerebral aneurysmal patients : 프로테오믹스技法을 利用한 腦動脈瘤 患者의 血裝蛋白質 動靜

이상훈 Chonbuk National University Graduate School 2003 국내박사

뇌동맥류는 뇌내 혈관 벽이 부풀어진 것으로 그 원인은 아직 명확치 않으나, 혈관의 평활근의 약화로 유발될것으로 추정되고 있다 뇌동맥류는 증상이 다양하며, 파열시 뇌졸중과 같은 심각한 결과를 초래할 수 있기 때문에 사망률도 높다. 그러므로, 뇌동맥류의 위험성과 사망률을 감소시키기 위해서는 조기진단이 절대적으로 필요하다. 현재 계수적 감산혈관조영술, 자기공명영상 및 컴퓨터 단층촬영을 이용한 혈관조영술과 같은 영상기법이 뇌 동맥류의 진단에 사용되고 있으나, 일반인들이 정기건강검진에 이용할 수 있을 정도로 간편하지 못하다. 본 연구에서는 뇌동맥류의 진단에 좀더 간편하고 선택적으로 사용할 수 있는 진단적 표지 단백질을 찾을 뿐만 아니라, 병인단백질을 구명하기 위하여, 뇌동맥류 환자의 혈청단백질 발현양상을 프로테오믹스기법으로 대조군과 비교하였다 표본간의 편차를 줄이기 위하여 환자의 성과 나이를 맞추어 분석하였는데, 6 명의 뇌동맥류환자 혈청에서 정상인의 혈청단백질과 비교하였을 때, 7 개의 단백질이 유의하게 변동됨을 관찰하였다. 이중 3 개의 단백질이 이미 알려진 단백질이었고 나머지 4 개는 지금까지 알려지지 않은 새로운 단백질이었다. 이러한 단백질들은 뇌동맥류의 진단적 표지단백질로 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 뇌동맥류의 병태생리에도 관여할 수 있다. 이러한 프로테오믹스결과는 뇌동맥류의 진단적 표지단백질 개발 및 병태생리연구에 귀중한 정보를 제공할 것이다. A cerebral aneurysm is a ballooning-out of the wall of an artery or vein in the brain. Often this wall is weakened by disease, injury or an abnormality present at birth. They aren't always life- threatening, but serious consequences such as a stroke can result if one bursts in the brain. Thus, its early diagnosis is important if possible. Several imaging techniques, such as digital subtraction angiography, angiography using magnetic resonance imaging (MRI) or computed tomography (CT), are used to detect aneurysms. However, the etiology and definitive noninvasive diagnostic markers for cerebral aneurysm are still unclear. In order to provide a more complete picture of diagnosis or pathogenesis in cerebral aneurysm, serum proteins for alteration in their proteomes were analyzed. Quantitative proteome analysis was used to compared signals corresponding to individual proteins between serum proteins from patients with cerebral aneurysm, and those from age-matched normal subjects. In total 7 proteins which were differentially expressed in human serum from patients with cerebral aneurysm compared with normal subjects, were identified. The expression levels of four proteins were decreased in serum of cerebral aneurysmal patients, whereas the other three proteins increased. These studies show that comparative proteome analysis is a powerful method to develop important new insights into non-invasive diagnostic markers as well as pathogenic proteins in cerebral aneurysm.

Normally scattering/normally transparent 고분자 분산형 액정 모드에서 셀 제작 및 전기 광학 특성 : Cell fabrication and electro-optic characteristics for normally scattering/normally transparent polymer dispersed liquid crystal mode

김미숙 Chonbuk National University Graduate School 2003 국내석사

고분자 분산형 액정 모드는 초기 상태에 따라 두 가지로 분류 될 수 있다. 첫 번째 모드는 전압 인가 전 초기 상태가 산란되는 normally scattering (NS) 모드이며 두 번째 모드는 초기 상태가 투명한 normally transparent (NT) 모드이다. 이러한 모드에서 노광 조건과 혼합물의 비율을 달리하면 셀의 전기 광학 특성을 개선시킬 수 있다. 본 논문에서는 두 모드의 노광 조건과 혼합물의 비율을 조절해 전기 광학 특성이 우수한 고분자 분산형 액정 셀을 만들었으며 이때의 액정 밀도와 액정 방울의 크기를 살펴보았다. NS 모드에서는 LC80wt%, 노광 온도, 25℃에서 만든 셀이 전기광학 특성이 우수했다. LC40wt% 경우보다 LC80wt%인 경우가 액정의 밀도가 더 높았으며 액정 방울 크기 역시 LC 40wt% 경우보다 (2~3㎛) LC80wt%일 때 (4~5 ㎛) 더 크게 형성되었다. 즉 액정의 밀도가 높을수록 방울의 크기가 클수록 셀의 초기 산란도가 좋음을 알 수 있었다. 또한 노광 온도가 25℃인 경우가 (4~5 ㎛) 노광 온도가 70℃ 경우(3~4 ㎛)보다 더 큰 액정 방울을 형성했다. NT모드의 경우 액정의 비율(LC 50, 60, 70wt%), 노광온도(20℃, 30℃, 40℃), 노광 세기(1.3mW/㎠, 198mW/㎠)를 변화시켜 가면서 전기 광학 특성이 우수한 셀을 제작했으며 이때 역시 액정 밀도와 액정 방울의 크기를 살펴보았다. LC 70wt%, 20℃에서 198mW/㎠의 강한 노광시 전압 인가전 초기 상태가 투명하며 전압 인가후 좋은 산란도를 보이는 셀을 제작할 수 있었다. 이 조건에서는 0.2~1 ㎛의 액정 방울들이 전압 인가전 기판에 수직으로 서있기 때문에 셀의 초기 투명도가 좋으며 액정의 밀도가 높기 때문에 전압 인가시 산란도 역시 매우 우수했다.

Role of Ubiquitin Fusion Gene In Drug Induced Apoptosis In Hepatoma Cells : 간암세포 약물유도성 apoptosis에서 ubiquitin fusion gene의 역할

한학길 Chonbuk National University Graduate School 2003 국내박사

c-jun은 다양한 자극에 의하여 발현이 증가하는데 신경계의 정상적인 발달과정에서 일어나는 apoptosis 뿐만 아니라 여러 병리적 상황에서도 발현이 증가하며 세포배양실험에서도 세포의 사망과 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 conditioning ischemia에서 살아남은 세포와 축삭이 절단된 망막신경세포 혹은 적색척수신경세포가 재생될 때도 증가하므로 c-jun이 세포의 생존과 사망에 어떠한 역할을 하는지 명확하지 않다. 이에 수컷 Sprague-Dawley를 대상으로 c-jun에 대한 AS ODNs을 투여하여 c-Jun의 발현을 억제함으로써 c-Jun이 KA에 의한 발작과 해마의 세포손상에 미치는 영향을 연구하여 다음과 같은 결과를 얻었다. c-jun에 대한 AS ODNs을 투여하여 c-Jun의 발현이 억제되어도 KA 투여 직후에 발생하는 비정상적인 행동이나 발작의 발생율 및 발작의 단계에는 유의한 차이가 없었으며 발작간 및 발작뇌파도 의미있는 차이가 없었다. 그러나 첫 번째 4단계 발작이 일어나기까지 걸린 시간은 VE군에 비하여 AS군에서 통계적으로 유의하게 연장되었으므로 c-Jun의 발현이 증가하면 발작의 진행을 촉진시키는 것으로 사료된다. KA를 투여한 후 24시간 뒤에 해마 CA_3의 세포손상을 비교한 결과 NS군과 VE군에 비하여 AS군에서 유의하게 감소되었기 때문에 c-Jun이 세포손상을 일으키는데 관여하는 것으로 사료된다. c-Jun이 흥분성 신경세포 손상에 연관되어 있으므로 약물을 투여하여 c-jun/c-Jun 신호전달 체계를 차단하면 발작, 허혈 혹은 외상에 의한 흥분독성 신경세포 손상을 감소시킬 수 있을 것이다. The activation of c-Jun protein is known to occur in the process of programmed cell death in many developmental and pathologic processes. As c-jun knockout animals die in utero, it has been difficult to demonstrate the causal role of c-jun in cell death. Antisense oligodeoxynucleotides (AS ODNs) can suppress protein expression specifically, allowing the test of hypothesis that activation of c-Jun protein leads to programmed cell death in a model of hippocampal excitotoxicity. Stainless steel cannulae were stereotaxically implanted into the right lateral ventricle in adult male Sprague-Dawley rats under ketamine/xylazine anesthesia. Skull screws served as EEG recording electrodes. Five days later, 8 nmols (dissolved in 8 p1 of artificial cerebrospinal fluid, aCSF) of ODNs, AS to c-jun, were injected into the right lateral ventricle over 4 min through the cannula 3 times at 12 hours intervals. Nonsense (NS) ODNs and aCSF (VE) served as controls. Four hours after the last injection of ODNs or aCSF, 0.5 ㎍ of kainic acid (KA) was injected into the right lateral ventricle through the cannula and the behavior of animals and EEG was monitored for 4 hours. Animals were sacrificed at 0, 4, and 24 hours after KA injection for c-Jun and c-Fos protein quantitation in hippocampus by western blot and immunohistochemistry. For western blot, anterior 3mm of septal hippocampi were collected. Nissl stain at 24 hours after KA injection was analyzed to assess neuronal damage at the CA_(3) area by consensus among 3 blinded observers. Neuronal damage score was by assigned on a 0-3 grading scale (0= no damage, 1=mild, 2= moderate and 3= severe neuronal damage). Most of animals exhibited abnormal behaviors such as running, jumping, fast rolling and staring, within 1-2 min after KA injection. AS group showed significant longer time in the latency to the onset of first stage 4 seizure than VE group (p<0.05), but there were no significant differences in the incidence and severity of seizures, and EEG pattern among the three groups (p>0.05). c-Jun protein expression (standardized with actin expression) by western blot was consistently lower in AS group than NS and VE group at all time points. But expression of c-Fos was not suppressed by AS ODNs to c-jun. By immunohistochemistry, suppression of c-Jun protein expression was maximal in the septa1 hippocampus (closest to the ICV cannula) of the AS group at all time points compared with NS and VE group. By Nissl stain, KA induced neuronal damage was seen in the CA3 region. AS group (n=5> showed statistically significant, the least amount of neuronal damage with equivalent damages in NS (n=5) and VE group (n=5) (AS vs NS, p<0.05; AS vs VE, p<0.05; NS vs VE, p>0.05; Mann-Whitney U). c-Jun protein expression was suppressed with AS ODNs to c-jun and resulted in protection from KA induced hippocampal neuronal damage. These findings in uiuo provide strong support for the causal role of c- Jun in excitotoxic neuronal injury in hippocampus. Pharmacological manipulation of the c-Jun/c- Jun signaling cascade may lead to a novel therapeutic approach to reduce excitotoxic neuronal injury in epilepsy, stroke or head trauma.

Role of inositol 1,4,5-triphosphate receptor in angiotensin Ⅱ induced contraction of rabbit clitoral cavernosal smooth muscle : Angiotensin II에 의한 토끼 음핵 해면체 평활근의 수축에서 inositol 1,4,5-triphosphate 수용체의 역할

이순옥 Chonbuk National University Graduate School 2003 국내박사

발기부전은 40대 이상의 남성과 여성의 30-50%에서 발생하는 중요한 질환이다. 음핵해면체는 성적 자극을 위한 중요한 발기 기관이다. 해면체 평활근의 수축을 초래하는 물질의 힘이 이완을 일으키는 물질의 힘보다 강할 때 발기부전이 발생하게 된다. 수축을 일으키는 system에 해당되는 renin-angiotensin system(RAS)의 주요 대사물질인 angiotensin (ANG) Ⅱ를 비롯한 ANG family는 type 1 수용체를 통한 해면체 평활근에 강력한 수축작용을 초래하여 성기능 장애를 일으킬 수 있는 대표적인 물질이다. ANG Ⅱ는 octapeptide hormone으로써 중요한 혈관수축물질이며, AT1 수용체를 통해 음경과 음핵 해면체 평활근의 긴장도를 증가시킨다. ANG Ⅱ가 AT1 수용체에 결합하게 되면, G-protein을 통해 phospholipase C (PLC)를 활성화시키고, 이어 phosphatidylinositol이 가수분해되어 inositol triphosphate (IP₃)와 diacylglycerol(DAG)가 생성된다. IP₃는 sarcoplasmic reticulum (SR)으로부터 Ca^2+를 유리하거나 또는 세포 밖에서 Ca^2+을 유입시켜 세포 내 Ca^2+의 양을 증가시킨다. 한편, DAG는 보조인자 phosphatidylserine과 Ca^2+의 영향으로 PKC를 활성화시킨다. 세포내 증가된 Ca^2+은 calmodulin과 더불어 myosin light chain (MLC) kinase를 활성화시키고, 이는 MLC를 인산화시켜 평활근의 수축을 일으키는 것으로 알려져 있다. 반면에, 이러한 신호체계는 해면체 평활근에서는 지금까지 알려지지 않았다. 따라서, 이 연구에서는 체중 2.0-2.5 kg의 뉴질랜드 화이트계 암컷 토끼를 이용하여 ANG Ⅱ유도 음핵해면체 평활근의 긴장도 변화에 있어 IP₃수용체의 역할을 구명하기 위해 IP₃ 수용체 억제제인 2-aminoehtoxydiphenl borate (2-APB)와 xestospongin C (XeC)을 이용하여 organ chambar 실험을 하였다. 그 또한 PLC 억제제인 2-Nitro-4-carboxyphenyl N, M-diphenylcarbamate (NCDC) 와 U-73122, L-type Ca^2+통로 차단제인 verapamil과 nifedifine, 그리고 PKC 활성 억제제인 chelerythrine과 staurosporine이 이 연구에 사용되었다. 그 결과 ANG Ⅱ에 의한 수축력이 PLC억제제, L-type Ca^2+통로 차단제에 의하여 감소되었고, IP₃수용체 차단제인 2-APB와 XcC에도 용량 의존적으로 유의하게 억제되었다. PKC 활성 억제제인 chelerythrine과 staurosporine에도 ANG Ⅱ 유도 수축력을 감소시켰으며, 특히 비선택적 PKC 활성 억제제인 staurosporine은 용량 의존적으로 그 수축력을 억제하였다. 이상의 모든 결과는, ANG Ⅱ에 의한 음핵해면체 평활근의 수축은 L-type Ca^2+통로를 통한 세포 외 Ca^2+의 유입과 PLC-IP₃신호체계에 의한 SR로부터 세포내로의 Ca^2+의 유리로 인하여 세포 내 Ca^2+농도의 증가에 의하여 일어나며, 또한 PKC 활성에 의한 Ca^2+유입 통로의 활성화가 관여되어 나타남을 암시하였다. The tone of clitoral cavernosal artery and smooth muscle is regulated by the balance between the release of the vasoconstrictors and smooth muscle relaxants. Female sexual dysfunction is a highly prevalent entity affecting 30-50% of American women. The clitoris is an important erectile organ for sexual arousal. Decrease in clitoral blood flow by medication is associated with arousal disorder in women. Angiotensin (ANG) Ⅱ, an octapeptide hormone, is an active component of the renin-angiotensin system (RAS). ANG Ⅱ is an improtant vasoconstrictor and increases penile and clitoral cavervosal smooth muscle (CSM) tone via type I ANG Ⅱ (ATI) receptor. ANG Ⅱ binds to AT1 receptor and stimulates G-protein mediated activation of phospholipase C (PLC), leading to phosphatidylinositol hydrolysis and formation of inositol triphosphate (IP_(3)) and diacylglycerol accumulation (DAG). IP_(3) stimulates release of Ca^(2+) from sarcoplasmic/endoplasmic reticular stores. DAG, with cofactors phosphatidylserine and Ca^(2+), activates protein kinase C (PKC). However, the system has not been known in a clitoral smooth muscle contraction so far. Thus, the purpose of the present study is to investigate intracellular signaling of ANG Ⅱ in clitoral smooth muscle contraction. The role of IP_(3) receptor in ANG Ⅱ-induced rabbit clitoral smooth muscle contraction was examined using organ chamber. PLC inhibitors, 2-Nitro-4-carboxyphenyl N,N- diphenylcarbamate (NCDC), U-73122, 2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB) and xestospongin C (XeC), to modulate IP_(3) receptor, L- type Ca" channel blockers, verapamil and nifedifine and PKC inhibitors, chelerythrine and staurosporine were used. The ANG Ⅱ-induced contraction (that is, from 140±13.5 to 53.4±6.9, N=8) was attenuated by NCDC in a dose-dependent manner (100 μmole/L, from 115.9±10.0 to 24.2±3.2, p ) 0.05; 1mmole/L, from 92.0±8.2 to 15.3±3.2, p (0.01). ANG Ⅱ-induced contraction was significantly inhibited by 2-APB (100 μmole/L, from 84.1±7.7 to 17.5±1.9, p (0.05; 300μmole/L, from 36.2±4.7 to 12.7±1.7, p (0.001) and effect of 2-APB disappeared at fast by washing. ANG Ⅱ-induced contraction was significantly inhibited by XeC (3 p mole/L, from 115.5±12.7 to 18.4±4.3, p (0.05; 10 μmole& from 98.6±8.0 to 18.4±2.1, p (0.001). Verapamil and nifedifine significantly inhibited ANG Ⅱ-induced contraction. Chelerythrine attenuated the ANG Ⅱ-induced contraction. Staurosporine significantly inhibited the ANG Ⅱ-induced contraction. In conclusion, ANG Ⅱ-induced contraction requires extracellular Ca^(2+) entry through L-type calcium channels. ANG Ⅱ-induced contraction is mediated by an activation of IP_(3) receptors and also the PKC-activated Ca^(2+) entry.

Growth-modulating Effect of Bioactive Component Isolated from Caesalpinia sappan toward Human Intestinal Microorganisms : 소목 (Caesalpinia sappan) 에서 분리한 5-Hydroxy-1,4-Naphthoquinone의 인간 장내미생물에 대한 생리활성

Lim, Mi Youn Graduate School Chonbuk National University 2005 국내석사

식물체에 존재하는 장내세균총 개선 성분을 탐색하기 위하여, 장미목 콩과식물인 소목 (蘇木) 메탄올 추출물을 5종의 장내세균 Bifidobacterium bifidum ATCC 29521, B. breve ATCC 15700, Clostridium perfringens ATCC 13124, Escherichia coli ATCC 11775 및 Lactobacillus casei ATCC 27216에 대한 생육억제활성을 여지확산법과 분광학적 방법을 이용하여 검정하였다. 생육억제활성은 사용균주와 시료 농도에 따라 달리 나타났다. 소목 메탄올 추출물은 20 과 10 ㎎/disk의 농도에서 C. perfringens에 대하여 매우 강한 생육억제활성을 보인 반면, E. coli에서는 약한 생육억제활성을 보였다. 소목 메탄올 조추출물의 C. perfringens의 유해균에 대한 강한 생육억제활성 결과를 토대로, 소목 메탄올 조추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물을 사용하여 순차 용매분획 하였다. 분리 획분들의 C. perfringens에 대한 생물검정 결과, 에틸아세테이트 획분에서 가장 강한 생육억제활성을 보였다. 장내세균에 대한 선택적 억제활성을 나타낸 에틸아세테이트 획분을 각종 크로마토그래피를 이용하여 생육억제성분을 분리·정제하였다. 분리되어진 물질을 여러 가지 분광학적 분석방법 (EI-MS, ¹H-NMR, ^(13)C-NMR) 으로 확인해 본 결과, 생육억제성분은 phenol성 물질 중 naphthoquinone 계열의 일종인 juglone (5-hydroxy-1,4-naphthoquinone, C_(10)H_(6)O₃) 으로 동정되었다. Juglone의 장내세균에 대한 생육억제활성은 화합물 농도와 사용균주에 따라 다양하게 나타났다. Juglone은 5 와 2 ㎎/disk의 농도에서 C. perfringens (++++) 와 L. casei (+) 의 생육을 억제하였고, 0.5 와 0.25 ㎎/disk의 농도에서는 C. perfringens (++) 의 생육을 억제하였다. 또한, B. bifidum, B. breve 및 E. coli의 생육에는 아무런 영향을 끼치지 않았다. C. perfringens에 대한 juglone의 구조 활성 관계를 알아보기 위해 naphthoquinone의 유도체인 5-hydroxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone, 1,4-naphthoquinone 및 1,2-naphthoquinone와 비교실험 한 결과, 소목에서 분리ㆍ정제한 juglone은 5 와 2 ㎎/disk에서 C. perfringens에 대해서 강한 생육억제활성을 보였고, 5-hydroxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone는 위의 농도에서 중간 생육억제활성을 나타내었다. Juglone과 5-hydroxy- 2-methyl-1,4-naphthoquinone은 B. bifidum, B. breve 및 E. coli의 생육에는 아무런 영향이 없었다. 1,4-Naphthoquinone과 1,2-naphthoquinone은 C. perfringens에 대하여 5, 2, 1, 0.5 및 0.25 ㎎/disk의 농도에서 강한 생육억제활성을 보였을 뿐만 아니라 다른 균주에 대해서도 다양한 생육억제활성을 나타내었다. 특히 1,4-naphthoquinone은 5, 2 및 1 ㎎/disk에서 B. bifidum, B. breve 및 L. casei에 대해 강한 생육억제활성을 나타내었고, E. coli에 대해서는 5 ㎎/disk에서 강한 생육억제활성을 보였다. 1,2-Naphthoquinone은 5, 2 및 1 ㎎/disk에서 B. bifidum 및 B. breve에 대해 중간 생육억제활성을, E. coli 및 L. casei에 대해서는 약한 생육억제활성을 보였다. 수산기가 없는 1,4-naphthoquinone과 1,2-naphthoquinone은 C. perfringens 뿐만 아니라 B. bifidum, B. breve, E. coli 및 L. casei에 대해서도 농도에 따라 다양한 생육억제활성을 보인 반면, 수산기가 있는 juglone과 5-hydroxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone은 C. perfringens에 대해서만 선택적인 생육억제활성을 나타내었다. 이로써 C. perfringens의 선택적인 생육억제활성은 수산기의 유무와 관련이 있을 것으로 추측할 수 있었다. 반면 juglone과 위의 naphthoquinone 유도체의 B. bifidum, B. breve 및 L. casei에 대한 생육촉진활성 생물검정 결과, 유익균의 생육에는 아무런 영향이 없었다. 결론적으로, 본 연구에서는 소목에서 분리된 juglone이 in vitro 내에서 인간 장내 유해균인 C. perfringens에 강한 생육억제활성을 가지고 있음을 확인하였다. 그러므로, juglone의 인간 장내 유해균에 대한 생육억제활성은 천연물유래의 선택적인 생육조절제로써 clostridia같은 장내 유해균에 의해 유발되는 질병의 예방에 이용될 수 있을 것이며, 앞으로 juglone의 선택적 생육조절활성을 이용하여 장내정화제의 활용 검정을 위한 임상실험이 수행되어야 할 것이다. The methanol extract of Caesalpinia sappan heartwood was tested for the growth effects toward five human intestinal microorganisms (Bifidobacterium bifidum ATCC 29521, Bifidobacterium breve ATCC 15700, Clostridium perfringens ATCC 13124, Escherichia coli ATCC 11775, and Lactobacillus casei ATCC 27216) using paper disk agar diffusion method and spectrophotometric method. In our primary study, the methanol extract of C. sappan significantly (++++) inhibited the growth of C. perfringens at 20 and 10 ㎎/disk. Even at 5 ㎎/disk, strong (+++) inhibition was observed with C. perfringens. In the growth response of E. coli, C. sappan showed weak (+) inhibition at 20, 10, and 5 ㎎/disk. In the test with beneficial bacteria, the growth of B. breve was not inhibited by C. sappan. However, C. sappan inhibited the growth of B. bifidus and L. casei at 20 and 10 ㎎/disk. The methanol extract of C. sappan was sequentially partitioned with hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol, and water because of its potent activity of C. sappan extract against C. perfringens. Among the five fractions, the strong growth inhibitory activity against C. perfringens was observed on ethyl acetate fraction. Purification of the biologically active constituent from ethyl acetate fraction was done by using silica gel chromatography and recycling preparative high performance liquid chromatography. The structure of growth inhibiting component was characterized by ¹H-NMR, ^(13)C-NMR, and mass spectrum. As the results, the compound was identified as juglone (5-hydroxy-1,4-naphthoquinone, C_(10)H_(6)O₃), a kind of naphthoquinone. The growth inhibiting activity of juglone against five human intestinal bacteria was examined. The growth responses varied according to the chemical dose and bacterial species tested. Juglone showed strong inhibition against C. perfringens at 5 and 2 ㎎/disk, and moderate inhibition at 1, 0.5, and 0.25 ㎎/disk, respectively. Furthermore, juglone showed no growth inhibition against E. coli. At 0.5 and 0.25 ㎎/disk, juglone moderately inhibited the growth of C. perfringens without adverse effect on the growth of beneficial bacteria such as B. bifidum, B. breve, and L. casei. Structure-activity relationship of juglone and naphthoquinone derivatives has been made. Juglone had strong growth inhibition against C. perfringens at 5 and 2 ㎎/disk. 5-Hydroxy-2-methyl-1,4- naphthoquinone had moderate growth inhibition against C. perfringens at 5 and 2 ㎎/disk, whereas juglone and 5-hydroxy-2-methyl-1,4- naphthoquinone had no growth inhibition against B. bifidum, B. breve, and E. coli. However, 1,4-naphthoquinone and 1,2-naphthoquinone had strong growth inhibition against C. perfringens at 5, 2, 1, 0.5, and 0.25 ㎎/disk. In the test with B. bifidum, B. breve, and L. casei, 1,4-naphthoquinone had strong growth inhibition at 5, 2, and 1 ㎎/disk. 1,2-Naphthoquinone had moderate growth inhibition against B. bifidum and B. breve at 5, 2, and 1 ㎎/disk. These results indicate that hydroxyl functional group of naphthoquinones such as juglone and 5-hydroxy-2-methyl-1,4-natphthoquinone seems to give selective growth inhibiting activity against C. perfringens. Growth promoting activity was tested in juglone and naphthoquinone derivatives toward B. bifidum, B. breve, and L. casei. They showed no promotive response toward B. bifidum, B. breve, and L. casei on Gy&ouml;rgy and RCM broth. In conclusion, these results indicate that C. sappan heartwood-derived juglone has inhibitory effect in vitro against specific harmful bacteria in the human intestine. The inhibitory action of juglone against C. perfringens may be considered as prospective therapeutics for the treatment of diseases caused by harmful bacteria such as clostridia. Furthermore, juglone may be developed as lead compound. Further work is necessary to establish whether this activity is exerted in vivo after consumption of C. sappan by humans.