화학적 돌연변이원성에 대한 유산균의 항돌연변이 효과

정종욱 전남대학교 대학원 2010 국내석사

유산균은 대표적으로 가장 많이 사용되고 있는 probiotics로써 장운동 조절, 병원성 세균의 억제, 소화 흡수의 촉진, 변비 설사 방지 등의 영양생리적인 건강 증진과 더불어 발효유제품, 자연발효식품, 사람이나 동물의 소화관, 가축의 사료 및 제약 분야에서 다양하게 사용되고 있다. 최근에는 항암효과, 혈중 콜레스테롤 저하, 면역증강 효과 등의 효능이 보고되면서 광범위하게 연구가 진행되고 있다. 이 중 항돌연변이 및 항암작용에 관한 연구가 활발해지면서 인체에 무해하면서 식품으로 쉽게 섭취함으로써 발암물질의 활성을 저해하거나 무독화 시키는 효과는 식품 산업 분야에서 발전 가능성이 매우 높은 부분으로 부각되고 있다. 본 실험은 치즈, 김치, 분변, 유제품 등의 다양한 원천에서 분리되어진 24종의 유산균의 항돌연변이 활성을 비교하여 항돌연변이 활성이 우수한 균주를 선발하고 항돌연변이 활성 물질을 규명하고자 수행하였다. 유산균의 항돌연변이 효과는 Maron과 Ames의 방법에 따라 histidine 요구 균주인 Salmonella Typhimurium TA100 균주를 이용하였으며 돌연변이 유발 물질로는 4-Nitroquinoline1-oxide(4-NQO), N-Methyl-N'-nitro- N-nitrosoguanidine(MNNG), 2-Amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline (IQ)를 이용하여 진행하였으며, 24종의 유산균 세포질 성분 물질을 시료로 하였다. 돌연변이 물질인 4-NQO에 대한 돌연변이 억제활성은 Lactobacillus casei KCTC 13086, L. paracasei ssp. paracasei 7710 및 L. helveticus 1042 균주에서 62.10, 62.10 및 33.60%로 각각 나타났으며, MNNG에 대한 돌연변이 억제활성은 Leuconostoc mesenteroides KCCM 35471, Lactobacillus plantarum KCCM 11322, Lactococcus lactis ssp. lactis PS6-S 균주에서 23.99, 23.37 및 38.78%로 각각 나타났다. 또한 IQ에 대한 돌연변이 활성은 Leuconostoc mesenteroides KCCM 35471, Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 7710, Lactobacillus plantarum CS14, Lactococcus lactis ssp. lactis PS6-S 균주에서 53.09, 33.76, 34.54 및 38.40%로 각각 나타났다. 유산균 세포질에서 유래된 항돌연변이 물질은 Trypsin을 처리하였을 때 항돌연변이 활성이 소실되는 것으로 보아 단백질성 물질로 추정되었다. 유산균세포질 시료를 membrane filtration(3 KDa Cut-off)로 여과한 결과 filtrate에서 활성이 있었고 이를 저분자량 전기영동을 수행한 결과 항돌연변이 활성물질은 약 762 Da의 분자량을 지니는 peptide 인 것으로 추정되었다. 항돌연변이 활성 peptide는 아미노산 서열분석결과 NH2-Xaa-Leu-Glu-Xaa-Lys-Lys-Ala-Glu- Xaa-Ile-Thr-Thr로 확인되었다.

벼(Oryza sativa) 뿌리의 초기 발달에 관련된 돌연변이체 및 유전자의 검색

황인용 단국대학교 2006 국내석사

식물의 뿌리는 물과 영양분의 흡수, 개체의 지지, 호르몬의 합성과 영양분의 저장의 기능을 가진다. 또한, 다양한 자극과 스트레스를 인지하여 줄기로 신호를 전달하기도 하여 개체 전체의 생육을 제어하는데 크게 영향을 미친다. 이런 뿌리의 구조적인 특징은 환경적, 유전적인 배경에 의해서 결정된다. 최근, 쌍떡잎식물의 모델식물인 애기장대 (Arabidopsis thaliana)의 돌연변이체를 통한 연구가 활발히 이루어지고 있으나, 주요작물인 벼의 뿌리는 애기장대와 근계의 구조나 유전학적으로 다른 점이 많아 애기장대와 비교하여 연구하는 것은 한계가 있다. 그래서 Ac/Ds 전이인자를 삽입하여 돌연변이를 유발한 벼의 돌연변이체 검색을 통하여 주근이 결손인 돌연변이체와 또 다른 표현형을 가진 돌연변이체로 관근의 길이와 수가 결손이 있는 대표적인 두 가지의 뿌리 특이적인 돌연변이체 후보를 얻어낼 수 있었다. 이 중 주근에 이상이 있는 돌연변이체 후보의 성체의 잎을 채취하여 엽록소 양의 증가를 확인하였다. 하지만 주근의 결손과 관련된 유전자의 확보는 할 수 없었으며 열매를 맺지 않아 다음세대의 표현형을 확인할 수 없었다. 한편으로는, 주근과 관근에 특이적으로 발현하는 유전자를 DEG Discovery system에 의뢰하여 2개의 주근 특이적인 유전자와 1개의 관근 특이적인 유전자를 발견하여 염기서열 분석을 통하여 우선적으로 염색체 상의 위치를 확인하였다. 또한, 환경적인 요소들이 뿌리발달에 미치는 영향을 알아보기 위해 NaCl을 처리하여 염분 스트레스에 따른 벼의 뿌리발달과 가뭄에 저항성을 가진 단백직 인산화효소 형질전환체에 대한 염분 저항성을 실험하였으나 오히려 염분 스트레스에 형질전환체가 더 민감하게 반응한다는 것을 확인하였다. Plant root systems absorb of water and nutrient, synthesize plant hormones, anchor plants and transport environmental stimuli to the shoot. The function of root is closely correlated with the morphology. The root architecture is defined by several parameters such as length, number and dimension. The characters of root structure are determined environmental and genetic factors. Recently, some important breakthroughs in the research of root development have been achieved in Arabidopsis as a dicot model plant. However, there is a limitation in directly applying the data from Arabidopsis to rice root system, because of the differences in the architectures of root system and genetic background between dicot and monocot plants. Therefore, we screened root-specific developmental mutants from Ds-tagged rice population. The selected mutants could be classified into two major groups, one with defects in the primary root and the other in the crown root. We selected mutant candidates are propagated on a test field of the Rura Development Adminstration in Milyang. In a mutant candidate, which were selected as a primary root-specific mutant, revealed color changes to dark green in adult leaves. However, changes in chlorophyll content was not observed. The candidate was fruitless, making impossible to analysis the next generation. On the other hand, we found primary root- and one crown root-specific genes by applying DEG discovery system (Seegene). Regulation of the gene by environmental factors, e.g., salt stress, is under investigation. I tested the responses of a drought-resistant transgenic rice harboring foreign protein kinase to salt-stress to analysis the response of rice to multiple stress.

ENU 돌연변이 진전 마우스 뇌조직절편의 조직학적 분석과 Agtpbpl유전자의 Yeast two hybrid construct 제작

박영숙 劑州大學校 大學院 2004 국내석사

본 연구는 N-ethyl-N-nitrosourea(ENU) 돌연변이에 의해 생산된 전신 떨림 표현형을 나타내는 진전(tremor) 돌연변이 마우스와 뇌세포 사멸 증상을 나타내는 자연발생 돌연변이인 purkinje cell degenerations(pcd) 마우스의 표현형 유발에 관련된 분자유전학적 기전의 이해를 위해 이들 마우스의 뇌 조직에 대한 형태학적 이상 및 뇌세포 사멸 현상 등에 대한 관찰을 목적으로 수행되어졌다. 제1장에서는 유전자 기능을 대량으로 분석하는 방법 중의 하나로 ENU를 주사하여 생산된 인공돌연변이 생쥐들 중 진전 표현형을 가지는 돌연변이 마우스의 조직학적 특성을 분석하였다. 진전 마우스의 뇌 조직에 대하여 진전 증상과 관련될 것으로 추측되는 뇌세포 사멸 증상, 신경세포돌기의 신경수초형성 이상, 뇌구조의 발생학적 이상 등의 존재 여부를 관찰하기 위해 뇌 조직 절편에 대한 조직학적 분석 및 소뇌의 퍼킨지신경세포(purkinje cell)에 대한 면역 조직학적 분석을 수행하였다. 전반적인 뇌 조직의 구조면에서는 대뇌피질(neocortex), 후구(olfactory bulb), 해마(hippocampus), 시상(thalamus), 소뇌(cerebellum)등을 비롯하여 관찰 가능한 모든 부분에서 조직의 발생학적 또는 형태학적 이상을 나타내는 증거인 신경세포층 형성부전, 주요 nuclei의 형성 부전, picnotic cell의 존재 등을 발견할 수 없었다. 또한 LFBCV(luxol fast-blue cresyl violet) 염색에 의해 식별 가능한 신경수초(myelination)의 결핍, 주요 신경교련(neuronal cammissure) 및 신경로(neuronal tract)의 이상 등도 발견할 수 없었다. 본 연구를 통해서 진전 표현형을 가지는 돌연변이 마우스의 뇌 조직에 대한 형태학적 이상의 관찰에서는 대조구로 사용된 정상 마우스와의 차이점들을 발견 할 수 없었다. 따라서 진전돌연변이 마우스의 세포생물학적 수준에서의 표현형 규명과 전신 떨림 현상의 원인규명을 위해서는 진전 마우스에서 돌연변이를 일으킨 유전자의 규명을 위한 유전학적 연구가 추가적으로 진행되어야 할 것으로 생각되어진다. 제 2장에서는 purkinje cell degeneration(pcd) 마우스 모델을 이용하여 뇌세포 사멸에 대한 기전을 밝히는 연구가 수행되었다. Pcd 마우스는 뇌신경세포 특히 퍼킨지신경세포가 죽어서 그 숫자가 감소하여 뇌신경계 이상을 보이는 마우스로 agtpbp1 유전자의 돌연변이에 의해 pcd 마우스의 이상 증상들이 나타나는 것으로 최근에 밝혀졌다. 하지만 아직까지는 agtpbp1 유전자의 역할에 대해서는 명확하게 밝혀진 바가 없다. 따라서 제 2장에서는 단백질간의 상호작용을 분석하는 연구 기법인 yeast two hybrid 분석을 통해 pcd 마우스의 이상증상 유발유전자인 agtpbp1유전자와 상호작용하는 다른 유전자의 발굴을 통해 agtpbp1 유전자의 기전을 밝히기 위해 수행되었다. Yeast two hybrid 분석을 하기 위한 첫 단계로써 agtpbp1 유전자를 5'단편, 3'단편, full-length(전장형) 등의 3가지 형태로 구분하여 yeast two hybrid 분석에 필요한 binding domain(BD)을 포함하고 있는 pGBKT7 vector에 subcloning하여 yeast two hybrid 실험을 위한 bait construct를 제작하였다.

가시오갈피의 항돌연변이 및 항산화효과

박정섭 又石大學校 大學院 2003 국내석사

가시오갈피 뿌리, 줄기, 잎의 메탄올 추출물 및 그 분획물에 대하여, Ames test 및 DPPH를 이용한 항돌연변이원성과 항산화성을 검토하였다. S. typhymurium TA98과 TA100에 있어서 10종의 직 · 간접변이원에 대한 가시오갈피의 항돌연변이원성과 S. typhimurium TA102, TA104에 있어서 산화적 돌연변이원인 H_(2)O_(2), t-BOOH에 대한 돌연변이 억제효과 그리고 DPPH를 이용한 전자공여능 측정을 통한 항산화효과에 대한 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 10종의 직 · 간접변이원에 의한 S. typhimurium TA98의 돌연변이에 있어서 가시오갈피 뿌리, 줄기, 잎의 80% methanol 추출물은 1-NP, daunomycin, AFB_(1), 2-AF에 대해서 돌연변이 억제효과를 나타내었으며, 단 daunomycin에 대해서는 가시오갈피 뿌리 80% methanol 추출물만 돌연변이 억제효과를 나타냈다. 2. 10종의 직 · 간접변이원에 의한 S. typhimurium TA100 돌연변이에 있어서 가시오갈피 뿌리, 줄기, 잎의 80% methanol 추출물은 1-NP과 AFB_(1)에 대해서 돌연변이 억제효과를 나타내었다. 3. S. typhimurium TA98에 있어서 돌연변이 억제효과를 나타낸 1-NP, daunomycin, AFB_(1), 2-AF은 가시오갈피 분획물 중 대부분 클로로포름 분획물에서 용량 의존적으로 돌연변이 억제효과를 나타내었다. 단 AFB_(1)에 대해서는 클로로포름뿐만 아니라 부탄올 분획물에서도 50% 내 · 외의 돌연변이 억제효과를 나타내었다. 4. S. typhimurium TA100에 있어서 돌연변이 억제효과를 나타낸 1-NP, AFB_(1)은 가시오갈피 분획물 중 대부분 클로로포름 분획물에서 용량 의존적으로 돌연변이 억제효과를 나타내었다. 5. S. typhimurium TA102에 있어서 산화적 돌연변이원인 H_(2)O_(2)에 대해서는 가시오갈피 뿌리와 줄기 80% methanol 추출물이 돌연변이 억제효과를 나타내었으며, t-BOOH에 대해서는 가시오갈피 뿌리 80% methanol추출물이 돌연변이 억제효과를 나타냈다. 이에 따른 용매 분획물에 있어서 H_(2)O_(2)과 t-BOOH에 대해서 모두 클로로포름 분획물에서 돌연변이 억제효과를 나타내었다. 돌연변이원인 H_(2)O_(2)와 t-BOOH에 대한 S. typhymurium TA102의 돌연변이에 있어서 가시오갈피 뿌리와 줄기 80% methanol추출물은 H_(2)O_(2)에 대해서, 가시오갈피 뿌리 80% methanol 추출물은 t-BOOH에 대해서 돌연변이 억제효과를 나타내었으며, 그에 따른 용매 분획에 있어서는 모두 클로로포름 분획물에서 용량 의존적으로 돌연변이를 억제하였다. 6. DPPH를 이용한 전자공여능 측정은 가시오갈피 뿌리, 줄기, 잎의 80% methanol 추출물 중 잎에서 EC_(50) 26.8로 가장 낮았고, 각 부위의 추출물 분획물에 있어서는 부탄올 분획물이 가장 낮은 EC_(50)을 나타냈으며, 그중 잎의 부탄올 분획물이 EC_(50) 24.1로 가장 낮았다. The methanol extracts from different parts of Eleutherococcus senticosus Maxim were investigated for antimutagenic and antioxidative effects in the Ames test and free radical scavenging test. Antimutagenic activities of the extracts from root, stem, and leaves of E. senticosus were determined against known mutagenic substances such as 4-nitroquinoline-1-oxide(4NQO), Sodium Azide(NaN_(3)), 4-nitro-1, 2-phenylene-diamine (4NOPD), Aflatoxin B_(1)(AFB_(1)), 3- amino-1,4-dime-thyl-5H-pyrido[4,3-b]indole(Trp-P-1), 2-Nitrofluorene(2-NF), N-Methyl-N-Nitro-N-Nitrosoguanidine(MNNG), Daunomycin (DM), 1-Nitropyrene (1-NP), 2-aminofluorene(2-AF), and oxidative mutagens (tert-butyl hydroperoxide; t-BOOH, H_(2)O_(2)), Using the Ames test. None of the extracts tested with Salmonella typhimurium strains TA98 and/or TA100 was found to modify the mutagenic effects of 4NQO, 4NOPD, NaN_(3), MNNG, 2-NF. The mutagenic activities of 1-NP and AFB_(1) toward both TA98 and TA100, however, were markedly inhibited by around 40% and 80%, respectively, by every extract. In addition, the extracts showed inhibition of mutagenicity elicited by indirect acting mutagens, Trp-P-1 (around 60%) and 2-AF (around 70%) for S. typhymurium strain TA98, while no antimutagenic activity was found on S. typhymurium strain TA100. In case of daunomycin, a frameshift mutagen, a suggestive antimutagenic response was observed on TA98 with 20% inhibition rate only in the presence of root extract. The methanol extracts were re-extracted with chloroform, butanol, and water. The chloroform fraction at the concentration of 300 ㎍/plate was found to inhibit significantly the mutagenicity elicited by 1-NP, AFB_(1), Trp-P-1, 2-AF, and daunomycin for both TA98 and TA100 in a dose-dependent manner. The antimutagenic effects against mutations induced by oxidative mutagens were observed only wllen tile root extract was treated with Salmonella typhimurium TA102, showing inhibition rate of 26% and 22% against t-BOOH and H_(2)O_(2), respectively. Neither stem nor leaf extract showed antimutagenic activity toward both TA102 and TA104. As in the case above, the suppressive compounds were localized in chloroform fraction. Free radical scavenging test was used in order to explore the antioxidant capacity of E. senticosus methanol extract. Leaf extract and butanol fraction were found to possess the highest antioxidant effect among the extracts and fractions, showing RC_(50) 26.8 ㎍/plate and 24.1 ㎍/plate, respectively.

Cyanobacterium synechocystis sp. PCC 6803 돌연변이체를 이용한 광계Ⅰ의 구조와 기능에 관한 연구

김수현 全南大學校 1995 국내박사

광계I의 구조와 기능 연구를 하기 위해 cassette mutagenesis를 이용하여 Synechocystis sp. PCC 6803을 돌연변이 시켰다. Chloramphenicol acetyl transferase 유전자가 삽입된 Synechococcus 7002 psaB 유전자를 가지고 S.6803을 형질전환시켜 psaB 유전자를 불활성화함으로서, 광계에 이상이 생긴 것으로 보이는 돌연변이주를 얻었다. 예상외로, 야생형의 청록색과는 다른 색을 지닌 다양한 돌연변이주들이 얻어졌는 데, 이들을 색깔별로 황록색, 귤색, 진녹색, 녹색, 그리고 감녹색의 5집단으로 나눈 다음, 각각 그중 대표적인 돌연변이주 B2, B17, D1, G1, G2 를 선택하여 특성을 조사하여 보았다. 돌연변이주들은, 일반적인 광합성 돌연변이주의 특성으로 알려진 바와 같이 광독립영양적으로 자라지 못하였으며, carotenoids의 양은 야생형의 80∼130 %로 대체적으로 일정한 편이었으나 엽록소 α의 양은 야생형의 40∼52 %정도로 상대적으로 적은 양을 가지고 있었다. 최소한 전체 엽록소 α 의 90 % 이상이 광계I에 있는 것을 생각하여 볼 때, 50 % 정도의 엽록소 α의 감소는 광계I에 이상이 발생한 것을 추측하게 하여 주었다. 보다 정량적인 색소량 측정과 이들 색소의 주 구성 성분을 알아보기 위하여, 세포를 90 % methanol로 추출한 색소 액을 흡광 spectrum과 역상 high-performance liquid chromatography를 실시한 결과, 야생형의 경우 세포당 엽록소 α가 최소한 전체 색소의 75 %를 차지하였고, 나머지는 carotenoids로서 β-carotene이 9 %, xanthophyll인 zeaxanthin이 11 %를 차지하고 있었다. 전자 전달로 본 광합성 율에 있어서도 세포당 광계I의 활성은 야생형의 약 26∼60 %에 불과하였다. 항체를 이용한 광계I의 immunoblot 분석에 있어서는 core polypeptides인 PsaA/PsaB 복합체는 돌연변이주, 특히 B2는 약하게 나온 반면, 주변 단백질인 PsaC와 PsaD는 거의 야생형과 같은 수준으로 감지되었다. 77K에서 435 nm로 엽록소 α를 excitation 하였을 때, F725는 돌연변이주에서 야생형의 약 50 % 이하로 peak크기가 감소되었고, F685나 F695중의 하나 또는 둘 모두가 소실되어 있으면서, 효율적인 전자 전달이 이루어지지 않고 있음을 알 수 있었다. 이는 whole cell을 590 nm로 phycobilin을 excitation하였을 때 더욱 뚜렸하게 나타나, 광계II에서 광계I으로의 전자 전달 율이 반 정도로 감소하였음을 알 수 있었다. 한편, 돌연변이주 (B2, B17, G1, 그리고 G2) 를 77K에서 435 nm로 엽록소 α를 excitation 할 때, 새로운 F678 이 나타났다. 역시 실온에서 435 nm로 엽록소 α를 excitation 하였을 때도 이 peak이 나타난 것으로 보아, 가장 먼저 excitation되는 엽록소 α가 결합되어 있는 단백질이 야생형과는 다른 형태로 존재할 가능성이 있다고 사료된다. 이 peak이 새로운 엽록소 α 결합 단백질, 아니면 기존의 단백질이 돌연변이로 인하여 일부 분해되거나 변형된 형태로부터 나오는 것인지는 자세한 조사가 필요할 것으로 보인다. 야생형과 돌연변이주 G1으로 부터 광계I을 분리하여 전기영동하여 보자, G1에서 PsaL 단백질이 소실된 것으로 나타났는 데, 이는 PsaB 단백질의 이상으로 인해 PsaL 단백질이 결합하지 못하고 분해됨으로서 보이지 않은 것으로 보인다. 야생형으로 부터 순수 분리한 chromosomal DNA를 가지고 돌연변이주를 형질 전환시키자 광종속영양적으로만 성장이 가능하였던 돌연변이주들 중 일부 (D1, G1, 그리고 G2) 가 광독립영양적인 성장을 하기 시작했다. 앞으로, 돌연변이주들이 보인 이같은 특성들이 어디서 기인한 것인지를 DNA의 cloning등을 통하여 규명할 예정이다. The cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 performes oxygenic photosynthesis in a manner to that in higher plants. The reaction center of photosystem I (PSI) is composed of a heterodimer of homologous polypeptides, PsaA and PsaB. To investigate the structure and function of PSI, cartridge mutagenesis technique was used to inactivate the psaB gene which encodes subunit It (PsaB protein) of PSI. Mutant strains carrying mutations at the subunit Ib were generated by transforming wild type cells with cloned DNA, pOV300 in which psaB gene of Synechococcus 7002 was interrupted by a gene conferring chlorarnphenicol resistance. Unexpectidly, many mutants displayed various color in a culture state were obtained. They were divided into five groups according to their colors, yellow-green, orange, dark-green, green and greenish-brown. Among them, representive mutant, B2, B17, D1, G1, and G2, of each group were selected for further dissection. Mutant cells does not grow photoautotrophically, which is common characteristics displayed by photosystem mutants. Biochemical analysis revealed that the mutant had reduced amount of chlorophyll α, while amounts of carotenoids were almost normal. Considering that ratio of PSI and PSll in wild type is 5∼9:1 and more than 95 % of chlorophyll α is located in PSI, decrease of chlorophyll α to half suggests mutation at PSI. To investigate pigment composition and amount of wild type and mutants more quantitatively, whole cells were extracted with 90 % methanol, following reverse phase liquid chromatography. In case of wild type, chlorophyll α occupied at least 75 % of total pigment of cell and the others were two carotenoids, 9 % of β-carotene and 11 % of zeaxanthin. Photosynthetic rates according to oxygen evolution also decreased to 26∼60 % compared to wild type, when normalized to equal cell number. Immunodetection analysis against several components of PSI showed that mutants had reduced amount of core polypeptide, PsaA/PsaB, but a normal range of peripheral protein, PsaC and PsaD. To determine fluorescence characteristics of chlorophyll, 77K fluorescence emission spectra were measured upon excitation 435 nm (exciting chlorophyll). Wild type showed ratio of 5:1 between F725 and F685 or F695, and it means effcient energy transfer from PSII to PSI. However, F725 height of mutants was decreased to 50 %, approximately, of wild type. Upon 590 nm excitation (exciting phycobilin), cells of wild type and mutants clearly showed three fluorescence emission maxima. But energy transfer between phycobilisomes, PSII and PSI in the mutants appeared to be less efficient than in the wild type. On the other hand, new peak at F678 was appeared in mutants (B2, B17, G1, and G2) on excitation 435 nm at 77K. Also the F678 was appeared at fluorescence emission at room temperature. It was possible that firstly excited chlorophyll binding protein may have different form from wild type. Further study is needed to find out whether this peak emitted from novel chlorophyll binding protein, or partially digested or modified form of existing protein because of mutation. PsaL protein was absent in G1 when purified photosystem I of both wild type and G1 were electrophoresed. It looks that PsaL protein did not bind to core complex of photosystem I and degraded because of mutation in PsaB. To find mutated sequence of DNA, mutants were transformed using chromosomal DNA of wild type, and photoautotrophic transformants appeared on BG 11 plate without glucose after 7∼10 days. We will examine cause of characteristics of mutants by DNA cloning, to study structure/function relationship and biogenesis of PSI.

한국인 윌슨병 환자에서 ATP7B 유전자 돌연변이 특성

김보영 연세대학교 대학원 2010 국내석사

두경부 편평세포암종에서 염색체3번 단완의 세포증식 억제 유전자와 돌연변이 효과에 대한 연구

이동진 고려대학교 대학원 2011 국내박사

이 연구에서 두경부암 발생의 유전적 배경을 밝히고자 편도암 조직에서 염색체 3번 단완에 위치한 유전자들의 체세포 돌연변이(somatic mutation) 여부를 조사하였고, 돌연변이가 있는 부위에 이형접합소실(loss of heterozygosity)이 동시에 발생하였는지를 확인하였다. 또한 형질주입(transfection) 실험을 통하여 이러한 체세포 돌연변이가 세포증식 억제 기능 소실과 관련이 있는지 확인하였다. 염색체 3번 단완에 위치한 유전자들 중 암 발생과 관련하여 이전에 돌연변이가 보고되었던 총 13개의 유전자를 대상으로 분석하였고 체세포 돌연변이 여부는 직접 염기서열분석(direct sequencing)을 시행하여 관찰하였다. 이형접합소실 발생여부는 돌연변이가 발생한 종양 조직과 정상조직을 Affymetrix 10K SNP array를 이용하여 분석하였다. 형질주입 실험은 인간 인두암 세포주(human pharyngeal cancer cell line)와 mammalian expression vector를 이용하였고, 세포주만 배양한 군, empty vector를 형질주입한 군, mutant EPHA3를 형질주입한 군, wild type EPHA3를 형질주입한 군 등 네 군으로 나누어서 세포의 증식 정도를 비교 분석하여 다음과 같은 성적을 얻었다. 1. 세 개의 새로운 체세포 돌연변이가 확인되었으며(각각 1/30, 3.3%), 네 개의 SNP 유전자 다형성, 다섯 개의 새로운 유전자 다형성이 관찰되었다. 세 가지 체세포 돌연변이는 ALS2CL 유전자에서는 c1830 위치에서 G가 A로 돌연변이 되었고, EPHA3 유전자에서는 c946 위치에서 A가 G로 돌연변이 되었으며, CMYA1 유전자에서는 c5573 위치에서 G가 A로 돌연변이 되어 있었다. 2. SNP array를 이용하여 이형접합소실이 발생한 부위를 확인한 결과 세 가지 체세포 돌연변이가 발생한 부위 모두에서 같은 위치에 이형접합소실이 발생하였음을 확인하였다. 3. 형질주입 후 세포 증식 정도를 비교한 결과, 다른 세 군에 비하여 wild type EPHA3를 형질주입한 군에서 세포 증식 정도가 유의하게 저하되었다. 이상의 실험 결과로 EPHA3, CMYA1, ALS2CL이 새로운 암 억제 유전자의 가능성이 있음을 직접 염기서열 분석과 SNP array 분석을 통하여 확인하였다. 또한 EPHA3 유전자의 wild type을 인간 인두암 세포주에 형질주입 하였을 때 세포 증식이 억제되는 것을 확인하였는데, 이는 EPHA3 유전자에 체세포 돌연변이가 발생 함으로서 세포 증식 억제 기능을 소실하게 되는 것을 의미한다. 이러한 결과는 향후 두경부 편평세포암 동물 모델을 만들거나, 두경부 편평세포암 조기 진단 및 유전자 치료에 기여할 수 있을 것으로 생각된다.

治癌中草藥의 突然變異 誘發 및 突然變異 誘發抑 制 效果에 關한 硏究

이현철 전남대학교 대학원 1982 국내박사

Salmonella tyohimurum 變異菌株中 監基置換型 mutagen을 檢索하는 TA100, TA1535와 frameshift mutagen을 檢索하기 위한 TA97, TA98 및 TA1538 變異菌株들을 試驗菌으로 하고, Arochlor 1254를 投與한 rat liver로부터 製造된 "S-9"을 使用하여, Ames의 salmonell/microsome mutagenicity test에 따라 漢方에서 癌治療에 쓰이는 10種의 治癌中草藥을 供試하여 이들의 突然變異誘發能과 突然變異抑制效果를 實驗, 觀察하였다. 各各 2g씩 deionzed water에 넣고 5㎖의 水溶液으로 加溫濃縮시킨 治癌中草藥들의 試驗菌株들에 對한 最低抑制稀釋培數는 1:8以下이었으며 紫草根을 除外한 모든 試料는 突然變異誘發試驗중 生菌數의 變化에 影響을 주지 않았다. 蜈蚣은 TA97, TA100, TA1535에서 弱한 突然變異誘發能을 나타내었고, 그 外의 治癌中草弱인 薏苡仁, 瞿麥根, 天花粉, 山澤蘭, 紫草根, 天南星, 莪朮, 山芝麻, 鬼剪羽等은 變異誘發效果가 없었다. 瞿麥根, 山澤蘭, 鬼剪羽은 監基置換型 突然變異誘發因子인 N-methyl-N'-nitro-N'-nitrosoguanidine(MNNG)에 依해 일어나는 TA100과 TA1535 變異菌株의 突然變異誘發을 상당히 抑制하였고 이는 鬼剪羽과 山澤蘭에서 보다 强하였으며 瞿麥根과 貴箭羽의 突然變異誘發抑制效果는 投與量의 增加에 따라 漸次 增加하였다. The mutagenicity and the antimutagenicity of ten species of herbae used to treat cancers in Chinese medicine by Salmonella/microsome mutagenicity test using TA97, TA98, TA100, TA1535, and TA1538 tester strains were investigated. Scolopendra centipede was weakly active in reversion of the frameshift mutation in S.typhimurium TA97 strain and the base-pair substitution in TA100 and TA1535 strains. Other herbae such as Coix lachryma, Dianthus superbus, Tricanthoshse kirilowii, Eupatorium formosanum, Lithospermum erythrorhizon, Arisaema japonicum, Curcuma zedoaria, Helicteres angustifolia, and Euonymus sieboldianus did not show any of the mutagenic potential, regardless of the metabolic activation with rat hepatic microsomal fraction. Dianthus superbus, Eupatorium formosanum, and Euonymus sieboldianus exhibited suppressive activities on microbial mutagenesis of N-methyl-N'-nitro-soguanidine, a base-pair substitution mutagen, in TA1535 and TA100 tester strains. The antimutagenic activities of Dianthus superbus and Euonymus sieboldianus appeared to be dose-dependant.

위암 유전자형과 라이보형을 디지털 코드한 네트워크 모델에 관한 연구

박성진 인제대학교 일반대학원 2016 국내박사

이백 여종 이상의 질환 집합인 암은 유전자 질환이다. 암 세포의 누적된 돌연변이에서 암 발생을 유도하는 돌연변이와 다른 유전자 돌연변이로부터 유도된 돌연변이를 구분하는데 어려움이 있으며, 임상적으로 동일 암종간에도 상이한 암은 환자별로 적절한 치료제를 선택하는데 어려움이 따른다. 이에 이 연구는 동일한 표현형을 보이는 위암 환자 군집(cluster)을 나누고 해당 군집에 맞는 치료제 후보 물질을 발굴하는데 활용할 수 있는 모델을 구축하고자 했다. 이 목적을 달성하기 위해 이 연구에서는 TCGA (The Cancer Genome Atlas) 프로젝트에서 유래한 위암 환자의 RNA-Seq, miRNA-Seq으로 측정한 전사체 발현량과 체세포 돌연변이 데이터를 연구 재료로 하였고 다음 네 과정을 거쳐 환자를 군집하는 신호전달 네트워크 모델 구축을 시도하였다. 첫째, 위암에서 중요한 Wnt 신호전달 경로에 참여하는 유전형 (genotype)인 mRNA와 라이보형 (ribotype)인 miRNA의 발현량을 디지털 코드화 하여 동일한 이진 상태를 가지는 환자 그룹을 나누었다. 둘째, 각 그룹에 속하는 환자 수를 개수하고 환자 샘플 수가 가장 많은 이진 상태 그룹을 Group prevalent라 명명하였고 이 그룹을 암 발생에 중요한 유전자인 TP53 돌연변이 상태에 따라 TP53WT과 TP53MUT 그룹으로 나누었다. 셋째, Group prevalent의 TP53WT과 TP53MUT 그룹간 돌연변이 상태와 관계있는 유전자들을 통계적 방법으로 발굴하였다. 넷째, 두 그룹간 돌연변이 발생 차이가 유의하고 가장 크게 나타난 NRXN1의 돌연변이 상태에 따라 Group prevalent의 TP53MUT 그룹에 속하는 환자를 NRXN1 돌연변이 상태에 따라 다시 나누었다. 이렇게 나눈 그룹의 임상적, 암생물학적 표현형과 컴퓨터 모의 실험을 통해 반응하는 약물 화합물을 각 그룹별로 비교하였다. 연구 방법은 전사체 발현량 디지털 코딩과 Fisher’s exact test, 암 세포주 약물 반응 컴퓨터 모의 실험 등의 통계적 방법 및 기계 학습 기법을 활용하였다. 이 모델의 성취는 이 모델이 분류한 Group prevalent의 NRXN1WTTP53MUT그룹과 NRXN1MUT-TP53MUT 그룹이 임상적, 암생물학적 표현형 분류와 약물 반응성 차이가 유의한지 여부를 통계적 방법으로 평가했으며, 그 결과는 다음과 같다. 1. Group prevalent의 NRXN1WT-TP53MUT 그룹과 NRXN1MUT-TP53MUT 그룹에 속하는 환자 대상으로 Molecular subtype, Race, Copy number alteration cluster, CIMP category, MSI status, Lauren class 표현형을 조사했고 Lauren class를 제외한 다섯 가지 표현형이 유의하게 다른 조성을 보였다. 2. RNA-Seq으로 유전자 발현량 데이터가 공개된 열한 개 위암 세포주로 Group prevalent의 NRXN1WT-TP53MUT 그룹과 NRXN1MUT-TP53MUT 그룹으로 분류한 세포주 그룹을 대상으로 컴퓨터 모의 실험 결과 각기 다른 화합물들에 유전체 발현량이 반응하였다. 이상의 결과를 종합할 때, 이 연구에서 구현한 모델이 다른 표현형을 보이는 위암 환자들을 군집했으며, 이들 그룹간 유전자 발현량이 바뀌는 화합물질이 서로 다른 것을 보였다. 따라서 이 연구에서 시도한 암 발생에 중요한 신호전달 경로에 참여하는 유전형과 라이보형 유전자들을 디지털 코드화하여 환자를 분류하는 신호전달 네트워크 모델은 실효성이 있다고 판단하였다. 앞으로 전사체 발현량 디지털 코딩 기법이 생물학적 맥락에 맞는 기법을 개발하고 이 모델에 적용함으로써 환자 맞춤형 치료제 발굴과 선택에 효과적인 접근 방법론으로 활용할 수 있을 것이라 기대한다. This dissertation identified GC (gastric cancer) patient subgroups with different clinico-molecular phenotypes and drugs that change gene expression levels reversely. And this research suggested the signal transduction model based on digital coded genotype and ribotype in gastric cancer for classifying therapeutical patient groups and discovering drugs. To reach these goals, mRNA-miRNA gene expression and somatic mutation dataset of stomach adenocarcinoma patients from TCGA (The Cancer Genome Atlas) project were reviewed and analyzed. The model performed following steps. First, the edge detection algorithm based binary transformation function was applied to mRNA and miRNA gene expression dataset according to the Wnt signal pathway that takes an attention its important role in GC development, then GC samples were clustered according to digitally coded statuses. Second, one group was distinguished as “Group prevalent” which has the most samples among these clusters. And according to mutation status of TP53 that plays the most important role in cell’s life, the “Group prevalent” was divided into two groups, the TP53WT group and the TP53MUT group. Third, the Fisher’s exact test was applied to all somatic mutation dataset to discover genes that have relevance to the TP53’s mutation status. And finally, TP53MUT group of the “Group prevalent” was separated into two groups upon NRXN1’s mutation status. The NRXN1 was the most different mutational occurrences and significant statistically between the TP53WT and the TP53MUT groups. I inspected clinical and molecular phenotypes of the NRXN1MUT-TP53MUT group and the NRXN1WT-TP53MUT group. The in-silico simulation was performed to discover chemical compounds, which change gene expression level reversely, upon GC cell lines classified into two groups that are similar gene expression patterns to the TP53MUT group in “Group prevalent”. This research showed results as follows: 1. The NRXN1MUT-TP53MUT and the NRXN1WT-TP53MUT group patients showed significant differences statistically among five clinicomolecular phenotype categories (molecular subtype, race, copy number alteration cluster, CIMP category, and MSI status but not Lauren class). 2. The drug candidates of the NRXN1MUT-TP53MUT GC cell lines were different to NRXN1WT-TP53MUT GC cell lines. The above results suggested that there were significant difference phenotypes between the NRXN1MUT-TP53MUT group and the NRXN1WT-TP53MUT group clustered by this model. Limiting to the in-silico experiment, however, two groups response to different drugs. Therefore, this model showed effectiveness identifying therapeutic target patient subgroups and finding drug candidates for GC. Consequently, to improve this model making use of discovering GC drugs, it is necessary to explore reasonable digital coding methods of transcriptomic data that agreed with the biological context.

大麥에 있어서 化學的 突然變異 誘發과 變異體 特性에 關한 硏究

김시주 建國大學校 大學院 1992 국내박사

化學的 突然變異 誘超劑를 利用한 보리 突然變異 誘起方法을 究明하여 品種育成의 基礎資料로 活用코자, 國內 보리品種에 對하여 突然變異 誘起劑處理에 따른 M_(1)의 生理的 反應, M_(2)의 葉緣素缺乏突然變異體 出現 및 誘起된 形態的突然變異體에 對한 特性을 檢討한 試驗結果를 要約하면 다음과 같다 1. M_(1) 種予의 出現速度및 出現率에 있어서 세品種 모두 Sodium Azide 處理는 4.5mM까지, Diethyl Sulfate는 20mM까지 Ethyl Methane Sulfonate는 10mM의 處理에서 出現速度 및 出現率이 크게 떨어지지 않았다. 2. M_(1)의 幼苗生長 및 稔實率에 있어서도 Sodium Azide는 4.5mM까지, Diethyl Sulfate는 20mM 까지, Ethyl Methane Sulfonate는 10mM의 處理에서 세品種 모두 無處理에 比해 크게 떨어지지 않았다. 3. M_(2)의 葉緣素缺乏 突然變異體 出現은 모든 處理區에서 Viridis와 Albina가 많았고, Xantha, Viridoalbina, Striata, Tigrina, Zonata 等이 出現되었으며, 處理濃度가 높을수록 變異體의 種類가 多樣하며 出BE率이 增加하는 傾向이었다. 4. 葉緣素缺乏 突然變異率은 品種間에 多少 差異는 있었으나 處理 濃度가 높아짐에 따라 增加하였으며 藥劑別로는 Sodium Azide와 Ethyl Methane Sulfonate 處理에서 높았고 品種別로는 藥劑의 種類에 따라 多少 差異는 있었으나 무둥쌀보리가 가장 높았고 冬보리1號, 斗山29號의 順이었다. 5. 葉綠索缺乏 突然變異率은 M_(1)의 稔實率과 密接한 關係가 있었으며, 稔實率이 낮을수록 突然變異率은 增加하는 傾向을 보였다. 6. M_(2)의 形態的突然變異體의 類型은 低濃度處理에서 多樣하였으나 出現頻度는 高濃度 處理에서 높은 傾向을 보였다. 7. M_(2)의 形態的突然變異 誘起率은 M_(1)의 稔實率및 M_(2)의 葉綠素突然變異率과 密接한 關係가 있으며, 稔實率이 낮을수록 葉綠素突然變異率이 높을수록 形態的突然變異率이 높은 傾向을 보였다. 8. M_(2)에서 誘起된 形態的 突然變異 形質은 모든 處理에서 稈形質突然變異및 이삭形質突然變異가 가장 많이 誘起 되었으며 特性別 突然 變異 誘起는 短稈이 가장 많았고 glossy sheath, 早熟의 順이었다. 또한 色彩突然變異는 S. Azide 處理에서 많이 誘起되었고 熟期 突然變異는 DES 處理에서 많이 誘起되어 形質別로 藥劑의 特異性을 보였다. 9. 有用한 短稈突然變異 系統은 S. Azide 處理後代에서 가장 많이 選拔 피었으며 濃度別로는 高濃度處理에서 많이 選拔 되었다. 品種別로는 冬보리1號에서 選拔效率이 가장 높았고 무등쌀보리, 斗山29號의 順 이었다. 10. 基他形質로서 冬보리1號에서는 細葉, 多節稈, 細得, 匍匐型, 黃緣 色體, 短芒, 無葉耳, 褐色稈 等 이었고, 斗山29號에서는 密穗型, 短芒, 多分枝型, 無葉耳, 黃綠色體 等이었으며, 무등쌀보리에서는 黃色體, 褐色釋, 多節間, 長穗 等의 突然變異 系統이었다. 11. 새로운 褐色稈突然變異系統이 冬보리1號의 Sodium Azide 3.0mM 處理와 무등쌀보리의 Sodium Azide 4.5mM, Diethyl Sulfate 20mM 및 Ethyl Methane Sulfonate 10mM 處理에 의해 誘起되었다. This study was carried out to obtain an information on the optimum treatments of chemical mutagens in mutation breeding of barley and search for the morphological mutants useful incrop improvement programs. Three Korean barley cultivars, "Dongbori 1", "Doosan 29" and "Mudenungsalbori", were treated with Sodium Azide (S. Azide) Diethyl Sulfate(DES) and Ethyl Methane Sulfonate(EMS). They were tested for the growth inhibition in the subsequent M_(1) generation, and for chlorophyll deficiency and morphological mutatin in the M_(2) generation. the results obtained are summarized as follows. The emergence speed and rate of M_(1) Seeds of all cultivars were not significantly affected by the treatments of S. Azide, DES and EMS at concentrations lower than 4.5, 20 and 10mM, respectively. Early seedling growth and fertility in M_(1) plants were not also inhibited by the applied concentrations in all three cultivars. Among the mutant type of chlorophyll-deficiency, Viridis and Albina were the most frequent ones observed in M_(2) plants. Xantha, Viridoalbina, Striata, Tigrina, Zonata were also observed with low frequencies. There were varietal variations in the occurrence of chlorophyll-deficient types, all of which could be observed in high frequencies with high mutagen dosages. S. Azide and EMS were especially effective in chlorophyll mutagenesis. Of the cultivars tested, "Mudeung-ssalbori" was the most susceptible to mutagens, followed by "Dongbori 1" and "Doosan 29". The induction rate of chlorophyll-deficient mutants was significantly correlated with the fertility rate in M_(1) plnats. A higher mutation rate was observed with a lower grain fertility. Morphological mutations in M_(2) plants occurred in high frequencies by high mutagen dosages whereas a higher number of variants by mutation was observable in low dosages. The induction frequency of morphological mutation in M_(2) platns was also found to be closely corelated with the rates of chlorophyll mutation and grain sterility in M_(1) plants, where a higher frequency was associated with higher chlorophyll mutation and grain sterility. Charaters of dwarfness, glossy sheath and earliness were the most frequent mutants in M_(2) generations of all three cultivars. Culm and spike mutants were the most frequently induced irrespective of the treatments and clutivars. However, some morphological characters were specific to chemical mutagens : color mutants induced frequently by the teratment of S. Azide while maturity mutants by DES. Semi-dwarf mutants were easily selected by the treatment of S. Azide in all three cultivars and they occurred in a higher frequency by high dosages. Of the cultivars tested, "Dongbori 1" was the most frequent variety producing dwarf mutatns, followed by "Mudeungssalbori" and "Doosan 29". Other induced characters were narrow leaves, multi nodes, slender culm, prostrated stature, short awns, ligulelessness, brown culms and yellowish green leaves in "Dongbori 1", whereas compact spikes, short awns, multibranches, ligulelessness and yellowish green leaves were found in "Doosan 29". Yellowish green leaves and brown culms as well as multi nodes and long spikes were also observed in "Mudeungsallbori". Brown straw induced in "Dongbori 1" by 3.0mM S. Azide and in "Mudeungssalbori" by 4.5mM S. Azide, 20mM DES or 10mM EMS was the first case of observation in the mutagenesis study.