포유 동물 난자 성숙 과정과 배 발생 과정에서의 Ca2+-channel의 동정까지

배인하 한국발생생물학회 2012 한국발생생물학회 학술발표대회 Vol.31 No.-

1966년 석사 과정에서부터 포유류에서 난자 성숙 과정이 어떻게 일어나는가 하는 것이 연구의 시작이었고, 80년 이후부터는 난자 성숙과 배 발생에 관련된 calcium 대사 연구를 하였다. 이 과정에서 자연히 세포 내로 Ca2+가 유입(Ca2+-influx)되는 요인을 밝혀야 했고, 그러다 보니 포유동물의 난자 성숙과 Ca2+-influx의 통로가 되는 Ca2+-channel을 연구하게 되었다. 1990년 후반부터는 포유동물의 난자 및 배에서 Ca2+-channel에 대한 연구를 주 테마로 하였다. 당시에는 이 분야의 논문이 그리 많지 않았으며, 따라서 세계 어느 연구실보다 이 분야에서 pioneer leader였다는 자부심을 가지고 2004년 8월 성진여자대학교 정년퇴임 시까지 연구하였다. 포유동물의 난자 성숙 과정에서 아미노산인 glutamine이 에너지원(energy source)로 쓰이며, protein 합성의 주 재료가 된다는 점을 밝혔는데, 이는 난자 성숙 과정에서 아미노산이 에너지 원으로 쓰이고 있음을 처음으로 밝힌 논문이었다(Bae and Foote, 1975). 이후 Batta와 Kundsen(1980), Burgoyne 등(1979)이 luteinizing hormone(LH) surge 후 cumulus cell enclosed 난자에서는 Ca2+ 농도의 급격한 증가가 일어나는 반면, folliclar fluid 내의 Ca2+ 농도가 감소하였음을 보인 연구 결과를 토대로 Bae(1981)과 Bae와 Channing(1985)에서 calcium on이 난자 성숙에 매우 중요한 역할을 한다는 것을 처음으로 보고하였다. 그 이전의 Tsafriri와 Bar-Ami(1978)과 Leibfried와 First(1979)는 Ca2+ion이 난자성숙과는 무관하다고 주장하였으나, 이는 실험 과정에서 배양액 내 Ca2+ 농도 계산이 잘못되었음을 증명하였다(Bae and Channing, 1985). 포유동물 난자를 체외에서 배양하면 자발적인 성숙(spontaneous maturation)이 일어나지만, 양서류나 불가사리는 progesterone이나 1-methyladenosine을 처리해야 난자 성숙이 일어난다. 그러나 포유동물의 난자라도 in vivo에서는 LH surge 후 난자 성숙이 시작된다는 점에서 보면 난자 성숙을 방해하는 무엇인가가 있을 것이라는 추정이 가능하고 난자 성숙 억제 물질(oocyte maturation inhibitor, OMI)을 찾아내는 것이 생식생리학 분야에서는 아주 커다란 문제로 부각되어 왔다. Tsafriri, Pomerantz와 Channing(1976)의 논문을 시작으로 많은 연구자들이 이를 연구하였고, 미국 내분비학회에서도 이들을 Gugenheim award를 수여하여 노벨의학상 수상 후보에 오를 것이라는 소문이 자자했다. 또한 미국 생식학회(SSR)에서는 제 1회 연구 논문상, Baltimore에서는 Great Baltimore Women Scientist로 선정되어 상을 받는 등 일약 전국적인 spot light를 받았다. 이 당시 본인 역시 OMI에 대해 이들과 달이 1975년부터 면역학적인 방법으로 접근하였으나, 연구 속도가 느려 1981년에 겨우 논문 하나를 발표하였다. Fast-moving protein과 slow-moving protein의 두 가지 다른 protein이 serum 내에는 없고 follicular fluid 내에 있으며, 생쥐 난자 성숙을 방해하고 있음을 밝혔다(Bae 등, 1981). 이보다 앞서 1979년 4월에 Dr. Channing 실험실에 합류하였는데 당시 Dr. Channing group이 발표한 OMI은 실험적 오류에 의해 생긴 결과였음을 밝혔고, 1980년 이후 Dr. Channing lab에서는 OMI에 대한 논문은 더 이상 발표되지 않았으며, Dr. Channing은 1985년에 암으로 세상을 떠났다. 포유류 배 착상 전 발생과정 중 일어나는 compaction 현상과 부화(hatching) 과정에서도 Ca2+가 필수적임을 보고하였다(Bae 등, 1994, 1996). 생쥐 난자 성숙과 포배기까지 배 발생에 Ca2+는 지대한 영향을 미치고 있지만 정작 Ca2+ion이 어떻게 난자나 배의 세포질 내로 들어 오느냐하는 Ca2+-channel에 대한 연구는 거의 없었다. 일반적으로 Ca2+-channel는 근육, 신경 조직 등에서는 많은 연구가 이루어졌지만, 포유동물의 난자 내 배에서의 연구는 거의 알려진 것이 없었다. 물론 근육이나 신경조직처럼 재료 구하기가 쉬우나, 포유동물의 난자와 배는 양적으로 재료를 구하기가 힘들다는 것도 원인 중에 하나이다. 예로 직경이 80um인 생쥐 난자 3,400개를 모아야 직경이 1.2mm인 개구리 난자의 체적이 되며, 3,400개의 난자를 모으려면 34명의 숙련된 technician이 생쥐 다섯 마리로 1시간이상 걸려 100개의 난자를 모아야 한다는 것이다. Okamoto 등(1977), Bae(1981), De Felici와 Siracusa(1982) 등이 포유동물 난자막에서 Ca2+-channel의 존재를 암시하였으나, Yoshida(1982)가 처음으로 방사성 동위원소 45Ca2+를 사용하여 Ca2+-channel의 존재를 확인하였으나, 어떤 type의 Ca2+-channel인지 밝히지는 못했다. 당시 한국에서는 45Ca2+를 사용하려면 방사능 취급 자격증을 갖고 있어야 하는 어려움으로 Ca2+-channel에 대한 연구를 시작하지 못하였다. 이후 Ca2+-channel에 대한 항체가 생산되자 본인은 항체를 이용한 면역학적 접근으로 생쥐 난자와 배에서 Ca2+-channel에 대한 연구를 시작하였다. 생쥐 난자 성숙 중에 일어나는 membrane potential이 변하는 것은 Na2+-channel을 통한 membrane potential 변화가 일어나는 것이 아니고 Ca2+-channel을 통해 Na2+의 이동이 일어나고, 이로 인해 membrane potential이 변하는 것임을 Yoshida(1983)이 증명하였다. 또한 Yoshida(1986), Peres(19987), 그리고 Blancato and Sayler(1990) 등 역시 Ca2+-channel의 존재를 증명하였으나, 어떤 type의 Ca2+-channel인지 밝히지는 못했다. 포유동물의 난자 및 배에서 Ca2+-channel를 밝힌 연구로는 Bae 등(1998, 1999a and b), Day 등(1998), Mattioli 등(1998), Emerson 등(2000) 등이 전부다. 이 중 Day 등(1998)은 생쥐 배에서 voltage dependent T-type Ca2+-channel을, Mattioli 등(1998)이 voltage dependent P/Q-type Ca2+-channel을, Emerson 등(2000)이 생쥐 2-세포배에서 voltage dependent L-type Ca2+-channel의 존재를 증명하였다. 본인은 Bae 등(1998, 1999a와 b)에서 생쥐 난자에 존재하는 P/Q-type, N-type, L-type의 voltage dependent Ca2+-channel이 존재함을 밝혔으며, Lee 등(2004)에서는 생쥐 난자 체외 성숙 중 성숙이 저해된 난자는 위의 네 가지 voltage dependent Ca2+-channel이 발현되고 있지 않으며, 이로 인해 난자 성숙이 일어나지 못한 것으로 보이며, 이는 생식 생리학의 난제 중 하나인 OMI의 원인 중 한 가지를 밝혀냈다는 점에서 큰 의의가 있다 하겠다.

포유류 난자의 성숙

배인하 성신여자대학교 기초과학연구소 1995 基礎科學硏究誌 Vol.14 No.-

생물의 세계에서 생명의 유지현상에는 세포내 여러 가지 대사과정을 통해 이루어지고 있다. 물론 세포의 분열도 이런 세포내 대사과정의 한가지에 속한다. 세포분열이 일어나려면 여러 가지 현상이 유발되는 대사과정이 일어난다. 우선은 하나의 세포가 분열을 하려면 세포크기가 커지고 그 다음 핵막의 소실, 염색체의 변화, 염색체의 이동, 방추사의 형성 및 소실, 핵분열, 세포질 분열, 또 이 세포질 분열에는 막대한 양의 여러 가지 세포내 소기관의 증식과정이 있는 후라야 된다.

체외에서 성숙시킨 토끼난자의 발생능력에 관한 연구

배인하,Bae, In-Ha 대한생식의학회 1985 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.12 No.2

1) Rabbit follicular oocytes from preovulatory follicles were cultured for 12 hr in vitro and fertilized in vivo by transferring the oocytes to the first foster-mother. 2) Two youngs were bron from transferred embryos from the first foster-mother to the second foster-mother. This demonstrates that in vitro cultured follicular oocytes are normal and they can develop into normal young born when transferred to the foster-mother. 3) A simple chemically defined culture medium, salt sol. with glutamine (2mM), which was developed by Bae and Foote(1975) proves fully good enough for rabbit follicular oocyte culture. We call this B-F medium. 4) Twelve hours culture in vitro of the rabbit follicular oocyte may be a proper culture time for further development.

Detection of Proteins from Porcine Follicular Fluid and Their Effect on the Maturation of Mouse Oocytes in vitro

배인하,황성윤,정순오,조완규,Bae, In-Ha,Hwang, Sung-Yun,Chung, Soon-O,Cho, Wan-Kyoo The Korean Society for Reproductive Medicine 1981 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.8 No.1

면역학적인 방법을 사용하여 가돈 여포액내의 특이단백질의 존재여부와 이들을 추출하여 난자성숙에 미치는 영향을 조사한 결과 다음과 같았다. 1. 가돈 혈청 및 혈장에는 존재하지 않는 면역학적으로 특이한 두 단백질이 가돈 여포액내에서 검출되었다. 2. 이들 두 단백질은 전기영동적으로 각각 fast alpha-I globulin 과 beta-globulin 의 이동성을 나타냈다. 3. 이들 두 단백질은 생쥐 여포난자의 성숙을 억제시켰다. 본 실험의 결과로 미루어 가돈 여포액내에는 난자성숙을 억제시키는 특이단백질이 존재하는 것으로 사료된다. It has been already suggested that specific macromolecules in follicular fluid produced by granulosa cells may play a role in suppressing further meiotic maturation of the oocytes. In general, the search for specific macromolecules in follicular fluid using immunological methods has not been rewarding. These studies were designed, by applying more effective immunological methods than conventionally employed, (l) to identify whether some unknown macromolecules are present in the porcine follicular fluid or not, and (2) to clarify the relationship between the oocytes and the specific macromolecules in the follicular fluid. The results obtained were as follows; (1) porcine follicular fluid contained two specific proteins, which were not present in pig plasma and serum. (2) each of two proteins showed electrophoretically fast alpha-globulin and beta-globulin mobilities. (3) these proteins seemed to have inhibitory effect on the maturation of mouse oocytes in vitro. From these results, it can be assumed that pig follicular fluid contains specific proteins which seem to be intra-follicular inhibitor(s) of oocyte maturation.

In Vitro Fertilization and Embryo Transfer Program과 한국에서의 문제점

배인하,정순오,Bae, In-Ha,Jeong, Sun-O 대한생식의학회 1985 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.12 No.1

최근 몇년전부터 한국에서도 In Vitro Fertilization - Embryo Transfer Program(IVF-ET)에 대한 논의가 있어왔다. 현재 몇몇 종합병원 및 개인 산부인과 의원에서 수십명의 난관 유착환자를 위한 IVF가 시도되었으나 아직까지, 한건도 성공되었다는 보고는 없다. 몇 십명이 실험적 모델로 제공되었으나 한 건의 성공사례도 없었다는 것은 문제점이 있는 것이 분명하며 이러한 한국에서의 문제점을 시설 문제와 전문가 또 IVF 과정에서의 technical problem들을 종합해서 다루어 보고져 하는 것이 본 논의의 주제임을 먼저 밝혀둔다.

Calcium Uptake in Mouse Oocyte Matured in Vitro

배인하,장보영,Bae, In-Ha,Chang, Bo-Young The Korean Society for Reproductive Medicine 1989 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.16 No.1

배양중인 생쥐 난자의 성숙에 미치는 배양액 내 calcim의 영향을 알아보기 위하여 1.71mM $Ca^{2+}$을 처리한 배양액과 $Ca^{2+}$이 존재하지 않는 배양액에서 난자를 배양하여 불꽃 원자 흡수 분광 광도계를 이용하여 배양된 난자의 $Ca^{2+}$농도를 측정하였다. 1) $Ca^{2+}$처리한 배양액에서 배양된 cumulus-cell이 제거된 (denuded oocyte)난자들은 시간이 지남에 따라 $Ca^{2+}$농도가 높게 나타났고, 2) $Ca^{2+}$처리하지 않은 배양액에서는 denuded난자는 3시간째 배양될때 부터 $Ca^{2+}$양이 줄어 들었다. Cumulus-enclosed난자는 $Ca^{2+}$존재하에서는 GVBD가 일어났다고 생각되는 4시간까지 계속 증가를 보인 반면 $Ca^{2+}-free$에서는 배양되지 않은 난자와 거의 차이가 없게 나타났다. 3) 핵막붕괴가 일어난 후부터 15시간까지 배양시컸을 때에는 CEO와 denuded oocyte에서 공히 $Ca^{2+}$의 농도는 다시 증가된 상태로 계속 되었다. 이런 결과로 미루어 보아 난자 성숙시 부터 성숙과정이 끝날때가지 exteral $Ca^{2+}$이 요구되고 있음을 증명해 주고있다. 그러나 이러한 세포질내의 $Ca^{2+}$및 bound calcium이 난자 성숙시부터 어떤 역활을 하고 있는 기작에 대해서는 좀 더 연구가 있어야겠다.

Electric Stimulation(음이온 pad)이 생쥐난자의 성숙 및 수정난의 난할에 미치는 영향

배인하,박원,최성미,김문규,Bae, In-Ha,Park, Won,Choi, Sung-Mi,Kim, Moon-Kyoo 대한생식의학회 1996 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.23 No.3

In the present study, mouse follicular oocytes and 2-cell embryos(late -zygote stage embryos included) were cultured on the electric pad for electric stimulation in the culture incubator. In addition, follicular oocytes and embryos were tested for maturation and development under higher temperature condition($39^{\circ}C$).Mouse follicular oocyte maturation were not affected by anion electric stimulation and there is no significant difference in GBVD and MI between the control and experiment group after 4hr culture. In the embryo culture, it was found that more morula and blastocyst were found in the electric stimulation group rather than the control(96hr). This may seem to be caused with cytoplasmic $Ca^{2+}$ transient rise by electric stimulation(anion pad). On the other hand higher temperature incubation ($39^{\circ}C$) on the anion pad caused all the embryos degenerated within $12h{\sim}24hr$ culture. This was quite different from large animal embryos(bovine, pig, sheep), in which beneficial effect of high temperature incubation for oocyte maturation and embryo development were found.

배양된 생쥐여포에서 $Ca^{++}$ Uptake에 대한 Gonadotropin의 영향

배인하,강신해,Bae, In-Ha,Kang, Shin-Hae 대한생식의학회 1991 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.18 No.2

The present study was undertaken to clarify the role of calcium ion as a factor for the maturation of follicle-enclosed mouse oocytes. Follicles were isolated with two sharp needles under a stereomicroscope from mouse(ICR) ovaries which were treated PMSG 5 IU 45 hours previously. Isolated follicles were cultured for 14-16 hours in an organ culture system at $37^{\circ}C$, 5% $CO_2$ in air and in a 100% humidified incubator by treatment of hCG, EDTA and $^{45}Ca^{++}$. Culture medium was Modified Hank's Balanced Salt Sol. (MHBS) and addition of hCG (human chorionic gonadotropin) was made into two doses level 0.4 IU and 0.8IU from the stock sol. and also $^{45}Ca^{++}$ was treated in the culture medium. To explain the role of calcium, calcium chelating agent EDTA was treated to the culture of the mouse follicle-enclosed oocytes. Two observations were made in the present study; nucleus phase and $^{45}Ca^{++}$ uptake into the oocyte. HCG induced oocyte maturation in the follicle about two folds as much as the control group, whereas there is no difference in oocyte maturation between 0.4 IU and 0.8 IU of hCG. Optimum level of hCG seems to be 0.4 IU/ml in the mouse follicle culture. HCG stimulated $^{45}Ca^{++}$ uptake into the oocyte of the follicles by two folds. $^{45}Ca^{++}$ uptake in the control group is about 2.5 folds in comparison of the EDTA(1.71mM) treated group. However, calcium uptake in the EDTA treated groups tends to increase depending on the decrease of EDTA concentration. These observations suggest that firstly, hCG stimulates maturation of the oocyte of the follicle, secondly, $Ca^{++}$ influx is induced by hCG and thirdly, $Ca^{++}$ influx by the treatment of EDTA decreases as a dosage-dependent process. This $Ca^{++}$ uptake may take place by the changes of permeability which was induced by hCG treatment. That is, $Ca^{++}$ influx may trigger the resumption of oocyte maturation. It is further necessary in the future study how this $Ca^{++}$ uptake is induced by hCG and increases permeability of the follicle and oocyte.

생쥐 난자성숙에 미치는 $Ca^{++}$ Ionophore와 $Ca^{++}$ Channel Blocker의 영향

배인하,김현숙,김문규,Bae, In-Ha,Kim, Hyun-Sook,Kim, Moon-Kyoo 대한생식의학회 1992 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.19 No.2

The present study was examined to clarify the role of calcium ion as a factor for the maturation of mouse oocytes. Follicles and cumulus-enclosed oocytes were isolated with two sharp needles under a stereomicroscope from female mouse (ICR) ovaries which were treated PMSG 5 IU 45-46 hours previously. Isolated follicles and cumulus-enclosed oocytes were cultured for 14-16 hours in an organ culture system at $37^{\circ}C$, 5% $CO_2$ in air and 100% humudified in incubator. MHBS was the basic medium used from which A23187, verapamil, $NiCl_{2.}$ $6H_2O$ and $LaCl_{3.}$ $7H_2O$ were added depending on the experimental groups. In follicle- or cumulus-enclosed oocytes wre cultured in these differently treated media. Following results were obtained from the present study. 1. The calcium ionophore A23187 directly or indirectly seems to stimulate GVBD of follicle-enclosed mouse oocytes. Increasing concentration of ionophore A23187 1ed to an increase in oocytes degeneration from the cumulus-enclosed mouse oocytes. 2. The organic $Ca^{++}$ channel blocker, verapamil does not induce GVBD of follicle-enclosed mouse oocytes. Specially, higher dose of 1 mM verapamil induced GVBD of follicle-enclosed mouse oocytes. However, cytoplasm of GVBD oocytes in 1 mM verapamil treated groups appeared shrunk. In the cumulus-enclosed oocytes, polar body formation was reduced in verapamil treated groups and degeneration increased. Verapamil inhibit oocyte maturation (polar body formation). 3. The $Ca^{++}$ inhibitor, Nickel ($NiCl_{2.}$ $6H_2O$) inhibits maturation of the follicle-enclosed oocytes. In the cumulus-enclosed oocytes the progression to MII (PB formation) was reduced and degeneration of mouse oocytes increased as the concentration of $Ni^{++}$ increase. The results indicates that nickel act as an inhibitor of calcium. 4. The $Ca^{++}$ inhibitors, Lanthanum ($LaCl_{3.}$ $7H_2O$) has shown different effect from that of nickel. In follicle-enclosed oocytes, 0.01mM lanthanum induced maturation of mouse oocytes. Polar body formation was reduced in the cumulus-enclosed oocytes all lanthanum treated group.

포유류의 난자성숙과 성숙과정에서 $Ca^{2+}$의 영향과 그 작용시기

배인하,Bae, In-Ha 대한생식의학회 1994 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.21 No.3

Follicular oocytes were released from the graafian follicles of ovaries from 3-4 weeks old mice. The spontaenous maturation of these follicular oocyes was inhibited by the treatment of dbcAMP and progesterone and these oocytes were cultured for 2-8hr in the Modified Hank's balanced salt solution(MHBS). Ethylenediaminetetraaceticacid(EDTA) and calmoudulin antagonist, trifluoperazine (TFP) were treated to the culture medium in order to investigate whether these chemical agents inhibit calcium uptake into the oocyte and oocyte maturation. $^{45}Ca^{2+}$, 10-${\mu}$Ci/ml was added to the culture medium during the culture period. $^{45}Ca^{2+}$uptake into the oocytes was examined whether and when various kind of oocyte maturation inhibiting agents inhibit or stimulate the influx of calcium into oocytes. Dibutyryl cAMP and progesterone decrease $^{45}Ca^{2+}$uptake into the oocytes and synergistic inhibiting effect of dbcAMP and progesterone was prominent at much lower dosages. Calcium uptake into oocytes seems to be higher during first 2 hour culture period rather than next 4hr culture. After 8hr culture, calcium uptake level of the oocytes which GVBD already took place gradually approached to the level of those which were maintained at GV by the treatment of dbcAMP and progesterone. However, $^{45}Ca^{2+}$uptake into the GV maintained oocytes did not change at all even after 8hr culture period. In addition, calcium chelating agent, EDTA inhibited calcium uptake into oocytes as well as nuclear maturation of oocytes. Lower dosage used in the present study did not inhibit calcium uptake as well as oocyte maturation.