Virginiamycin 생산유도에 관여하는 Virginiae Butanolide C(VB-C) 및 Receptor의 기능

김현수,현지숙 한국미생물학회 1997 미생물학회지 Vol.33 No.2

Virginiamycin(VM) 생산 유도에 관여하는 virginiae butanolide C(VB-C)및 receptor의 기능을 명확히 규명하기 위해 S. virginiae로부터 NTG및 hydroxylamine 처리를 통해 두 개의 변이주를 분리하였으며, VM을 생산하는 균중에서 VB, receptor를 모두 생산하지 않는 S. ostreogriseus와, receptor는 생산하나 VB를 생산하지 않는 S. graminofaciens를 대상으로 하여 유도능의 관계를 검토하였다. 분리한 S. virginiae mutant N-25와 H-05는 VB가 receptor보다 먼저 생산되는 특성을 나타내었으며, VM 생산시기가 현저히 지연되었다. 이는 S. virginiae 모균주에서 receptor가 생사노디기 이전에 합성 VB-C를 첨가하였을 때 VM 생산이 억제되는 것과 같은 현상인것으로 판단되었다. 한편, VM 생산균인 S. ostreogriseus 및 S. graminofaciens는 모두 VB를 생산하지 않으며 합성 VB-C 첨가에 의한 유도능을 검토한 결과, receptor를 생산하지 않는 S. ostreogriseus의 경우 VM 생산이 억제되는 반면, receptor를 생산하는 S. graminofaciens의 경우에는 VM 생산이 촉진되었다. 이들 결과에서 볼 때, VM 생산 촉진에 VB가 필수적이며 VB의 신호전달에 따른 VM 생산 촉진 효과는 반드시 receptor의 존재하에서 일어난다고 사료되었다. S. graminofaciens의 경우 합성 VB-C 첨가에 의해 생산된 하생물질을 HPLC를 이용하여 분석한 결과, 항생물질 생산량이 증가하였으며, 새로운 항생물질 생상 유도도 가능한 것으로 시사되었다. Streptomyces virginiae produces a set of autoregulators termed virginiae butanolide A-E(VB-A-E) which trigger virginiamycin production, and possesses a high-affinity virginiae butanolide receptor. To elucidate the functions of VB-C and VB-C receptor, we isolated two mutants from S. virginiae by N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine and hydroxylamine. The characteristics of the mutants showed that the producing time of antibiotics was very delayed due to a slower production of VB-C receptor than that of VB. In S. ostreogriseus(VB', receptor -) and S. graminofaciens(VBU, receptor+), which produce the virginiamycin, the addition of synthetic VB-C repressed the production of antibiotics in S. ostreogriseus but induced tbe production in S. graminofaciens. HPLC analysis of S. graminofaciens suggested that the VB-C might have an ability to induce the production of virginiamycin and other antibiotics. These results imply that the VB-C has an ability to trigger the production of other secondary metabolites as well as virginiamycin under VB-C receptor existence.

Virginiamycin 생산유도에 관여하는 Virginiae Butanolide C(VB-C) 및 Receptor의 상관관계

김현수,현지숙,유대식 한국미생물생명공학회 ( 구 한국산업미생물학회 ) 1996 한국미생물·생명공학회지 Vol.24 No.1

S. virginiae에서 virginiamycin 생산촉진에 관여하는 호르몬성 물질인 Virginiae butanolide C(VB-C) 및 receptor의 유도기구를 규명하기 위해, NTG 처리에 의해 분리한 3종류의 변이주를 사용하여 유도능의 관계를 검토하였다. 분리한 3가지 변이주 중 No.1은 VB-C, receptor 및 항생물질 생산 지연, No.3은 receptor 대량생산, No.4는 VB-C 결손, receptor 및 항생물질 생산시기 지연 등의 특성을 나타내었다. 이들 변이주의 합성 VB-C 첨가에 의한 유도능의 특징은, No.1의 경우 receptor 생산시기 지연으로 인한 항생물질 생산 억제, No.3의 경우 다량의 receptor 생산으로 인한 유도 초기 항생물질의 양적 증가가 나타났으며, No.4의 경우 적당한 양의 receptor를 생산함에 따라 정상적인 유도능을 가졌음이 시사되었으나 VB-C 결손으로 인한 항생물질 생산량의 감소 및 생산시기 지연 등의 특성도 함께 나타내었다. 또한 이들 변이주가 생산한 항생물질의 향균 spectrum 및 HPLC 분석 결과, virginiamycin M 또는 S의 생산량의 변화 및 유도체 혹은 새로운 항생물질의 생산 가능성, 그리고 VB-C에 의한 VM-M 및 S의 특이적인 유도가 시사되었다. 이들 결과로부터 virginiamycin 생산 촉진을 위해서는 VB-C가 필수적이며, receptor 존재시에 VB-C의 신호 전달에 따른 항생물질 유도가 일어난다고 판단된다. 또한 앞으로 VB-C^+, receptor^- 및 VB-C^-, receptor^- 등의 변이주가 분리되어 다양한 변이주에 대한 유도능의 검토가 이루어져야 한다고 사료되며 VB-C같은 2차 대사산물 생산 촉진인자의 다양한 할용이 기대된다. Virginiae butanolide C(VB-C) is one of the butyrolactone autoregulators, which triggers the production of virginiamycin in Streptomyces virginiae. To further understand the mechanism of virginiamycin induction, we isolated three mutants from S. virginiae by N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) treatment. The characteristics of the three mutants were confirmed as follows: the mutant No.1 delayed the production of the VB-C, receptor and antiiotics; the mutant No. 3 hyperproduced receptor; the mutant No. 4failed to produce the VB-C. The addition of synthetic VB-C couldn't induce the production of antibiotics in the mutant No.1 due to delayed production of receptor, could provoke the production of larger amount of antibiotics than parental wild type strain in the mutant No.3 due to the presence of large amount of receptor, and could induce production of very small amount of antibiotics in the mutant No.4 due to the absence of VB-C. Antimicrobial spectrum and HPLC analysis of the mutant No.1 and No.3 suggested that the VB-C might have a specific ability to induce the production of virginiamycin M and S. These results imply that the VB-C has an ability to trigger the production of virginiamycin under receptor existence in S. virginiae.

Streptomyces virginiae가 생산하는 Virginiae Butanolide C( VB-C ) 결합단백질의 결합활성에 미치는 일반적 특성

김현수 한국산업미생물학회 1992 한국미생물·생명공학회지 Vol.20 No.3

Streptomyces virginiae가 생산하는 virginiamycin 생산 유도인자(virginiae butanolide C, VB-C) 결합 단백질의 ligand(VB-C)와의 결합활성에 미치는 일반적인 성질을 검토한 결과, 본 VB-C 결합단백질은 막성분을 제외한 세포질에 90% 이상 존재하며, 최적 pH는 7.0인 것이 입증되었다. KCl 존재하 약 15%의 결합활성이 증대되었으며, Mo^6+ 이온 존재시 60%의 결합활성 저하를 보였다. Chelating reagents(EDTA, EGTA, 8-hydroxy quinoline-5-sulfonic acid) 존재시 30∼55% 결합활성 저해를 보였으며, SH기 보호제(mercaptoethanol, dithiothreitol, thioglycerol) 첨가의 경우 3∼20%의 결합력 저하를 보인 반면, pretease inhibitor인 PMSF 존재시에 17%의 결합활성 증대를 나타내었다. 또한 nucleotides(GMP, cAMP) 및 phosphatase(alkline, acid phosphatase) 공존하의 경우 5∼20%의 결합활성 증가를 나타내었으며, 인산화, 탈 인산화 반응에 의한 signal 전달기구 가능성과 함께 앞으로 원핵세포의 2차 대사산물 생산계의 새로운 기구 해명이 기대되고 있다. Virginiae butanolide (VB) is an autoregulator which triggers virginiamycin production in Streptomyces virginiae. VB-C binding protein activity was investigated under various additives. The VB-C binding protein was almost fully observed in soluble fraction (>90%) and the binding activity was optimum at pH 7.0. The VB-C binding activity was increased about 15% in 0.5 M KCl, whereas decreased about 60% in 20 mM Mo^6+. Chelating reagents (ethylenediamine tetraacetic acid, ethyleneglycol bis(2-aminoethylether) tetraacetic acid, 8-hydroxyquinoline) and SH protecting reagents (mercaptoethanol, dithiothreitol, thioglycerol) inhibited the VB-C binding activity about 30∼55% and 3∼20%, respectively. Serine protease inhibitor (phenyl methane sulfonyl fluoride), nucleotides (guanosine 5'-monophosphate, adenosine 3',5'-cyclic monophosphate), and phosphatases (alkaline, acid phosphatase) increased the VB-C binding activity about 17%, 6∼20%, and 4∼13%, respectively.

Virginiamycin 생합성 유도인자 Virginiae Butanolide C에 의한 2차 대사산물 생산의 유도

김현수,강선영 한국산업미생물학회 1994 한국미생물·생명공학회지 Vol.22 No.5

S. virginiae 유래의 virginiamycin 생합성 유도인자인 VB-C를 이용하여 다른 방선균인 S. longwoodensis(lysocellin 생산균)를 대상으로 하여 2차 대사산물생산 유도능을 검토하였다. 본 배양 0시간 및 5시간째에 합성 VB-C를 100 ng/㎖의 농도로 첨가시 약 2~6시간의 항생물질 생산시기와 본배양 0시간에 VB-C 첨가시 2~4시간의 색소의 생산 시기가 단축되었다. 또한 VB-C 유도에 의해 생성된 항생물질의 HPLC분석 결과, 새로운 항생물질의 유도가 시사되었다. VB-C 첨가시 균사내 총 단백질 pattern을 SDS-PAGE로 분석한 결과, 미첨가시에 비해 2차 대사산물생산에 관여한다고 예상되는 새로운 단백질의 생산 및 몇 몇 단백질 양의 증가가 확인되었다. 또한 VB-C의 signal 전달에 관여한다고 추정되는 VB-C에 특이적인 결합 단백질의 존재가 확인되었다. 따라서 본 연구의 결과는 미생물 호르몬인 VB-C의 signal이 처음으로 다른 VB류 생산 방선균에서도 전달되어 2차 대사산물 생산을 촉진하는 새로운 유도기능의 확인과 silent gene의 발현에 따른 새롭고 다양한 항생물질을 2차 대사산물로서 생산 유도할 수 있는 가능성을 시사하였다. Virginiae butanolide C(VB-C) is one of the butyrolactone autoregulators, which triggers the production of virginiamycin in streptomyces virginiae. Streptomyces longwoodensis was selected as a test strain to investigate new VB-C functions. When 100 ng/㎖ of the synthetic VB-C was added into the culture at 5 hour and 0 hour, the initial production time of antibiotics and a dark blue pigment were shortened by 4∼6 hours and 2∼4 hours, respectively. HPLC analysis revealed the production of several new antibiotics by VB-C addition. In the SDS-PAGE analysis of the total protein from mycelium several new protein bands showed up and the amounts of certain protein bands increased in the presense of VB-C. The existence of specific VB-C binding protein was confirmed from S. longwoodensis in relation to VB-C signal transduction. These results suggest that the VB-C might have an ability to induce the production of secondary metabolites in Streptomyces longwoodensis.

Virginiamycin 생합성 유도인자 Virginiae Butanolide C에 이한 Erythromycin 생산 유도

김현수,성림식,Kim, Hyun-Soo,Seong, Lim-Shik 한국생물공학회 1999 KSBB Journal Vol.14 No.6

Streptomyces virginiae 유래의 virginiamycin 생합성 유도인자인 VB-C를 이용하여 다른 방선균에의 항생물질 생산 유도 기능을 검토하였다. Erythromycin 생산균인 Streptomyces erythraeus를 공시균주로 사용하였으며, VB-C 결합 receptor 유전자가 포함된 plasmid(pARS 701, 9 kb)를 공시균주에 도입하여 transformant로 사용하였다. Parent와 transformant 모두 유도인자인 VB류를 생산하였으며, VB-C의 signal 전달에 관여하는 결합 단백질의 존재가 확인되었다. Parent는 본배양 0, 20, 44시간째에 합성 VB-C 300 ng/ml를 첨가시 초기 항생물질 생산시기가 약 8시간 이상 단축되었다. Transformant는 본배양 44시간에 첨가시 6시간 이상 항생물질 생산시기가 단축되었고 항생물질 생산량도 증가되었으며, parent에 비해 B. subtilis에도 강한 항균력을 나타내었다. 또한 항균 spectrum은 parent보다는 transformant가 생산한 항생물질의 항균호과가 더 큰 것으로 나타났으며, VB-C를 첨가한 경우 미첨가 경우보다 넓은 항균 spectrum을 보였다. 이들 결과에서 공시균인 S. erythraeus에서 VB signal 전달에 따른 항생물질 생산유도가 입증되었으며, VB-C receptor gene의 도입에 따른 발현과 함께 VBs의 유도, 항생물질의 생산시기의 단축 및 생산량의 증가가 예상됨에 따라 다양한 Streptomyces sp. 균주를 대상으로 항생물질의 대량생산을 비롯한 새로운 2차 대사산물 생산에의 응용이 예상되었다. Virginiae butanolide C(VB-C) is one of the butyrolactone autoregulators, which triggers the production of virginiamycin in Streptomyces virginiae. In order to investigate the function of VB-C as inducer in other strains, Streptomyces erythraeus was used as a test strain(parent). VB-C binding receptor gene was introduced into S. erythraeus(transformant) and the production of VBs and specific VB-C binding protein were analysed in parent and transformant. When 300ng/ml of the synthetic VB-C was added at 0, 20, 44 h cultivation of the parent and at 44 h cultivation of the transformant, the initial production times a antibiotics were shortened by more than 8 and 6 h, respectively. The transformant showed strong antibiotic activity against B. subtilis. These results suggest that the VB-C might have an ability to induce the production of secondary metabolites in S. erythraeus.

Virginiae Butanolide C 결합단백질의 신호 전달기구에 대한 연구

김현수 한국미생물학회 1992 미생물학회지 Vol.30 No.3

Virgiamycin 생산 우도 인자인 virginiae butanolide C(VB-C)의 전달기구 해명을 위한 기초적 연구로서 receptor성 VB-C 결합단백질의 recycle 가능성 및 인산화가능성을 검토하였다. 배양 시간에 따른 [$^{3}$H] $VB-C_{7}$ 와의 결합활성은 virginiamycin 생산중지와 함께 증대되어 VB-C 결합단백질의 recycle 이 추정되었으며, S. virginiae 의 genome DNA 공존시 40-50% 의 결합 활성 저하로부터 DNA 와 결합에 의한 signal 전달가능성과 $\lambda-^{32}P$ ATP 에 의해 분자량 36, 000 의 VB-C결합단백질이 인산화된 결과로부터 인산화를 통한 signal 전달가능성이 시사되었다. Virginiae butanolide C (VB-C) binding protein binds to virginiamycin inducing factor and the protein may function as a possible pleiotropic signal transducer. To further understand signal transducing mechanism, some properties of VB-C binding protcin were investigated. VB-C binding activity was gradually increased during 60 hrs incubation: whereas the amount of produced VBs was not changed. However. VB-C hinding activity was decreased by 30-5096 in the presence of genome DNA. The binding protein could he phosphorylated by [$\gamma-^{32}\textrm{P}$] ATP. These results suggest that the DNA binding and phosphorylation may be involved in signal transducing mechanism.