국내 승인 LM면화의 자연환경 모니터링을 위한 multiplex PCR 개발

조범호,설민아,신수영,김일룡,최원균,엄순재,송해룡,이중로,Jo, Beom-Ho,Seol, Min-A,Shin, Su Young,Kim, Il Ryong,Choi, Wonkyun,Eum, Soon-Jae,Song, Hae-Ryong,Lee, Jung Ro 한국식물생명공학회 2016 식물생명공학회지 Vol.43 No.1

면화(cotton)는 섬유를 수확하고, 면실유는 식용으로 가공 후 남은 것은 다시 사료로 이용되어 다방면으로 다양하게 활용되는 작물이다. LM 면화는 옥수수, 대두, 캐놀라와 달리 아시아권(중국, 인도 등)에서 가장 많이 재배되고 있으며, 우리나라는 2013년까지 세계 1위의 LM 면실(사료용) 수입국이며, 세계 4위의 면실박 수입국으로 해마다 증가하는 LM 면화의 수입량과 맞물려 유통 및 소비과정에서의 비의도적으로 유출 가능성이 증가함에 따라 LM 면화의 자연생태계 위해성 평가 및 안전관리가 요구된다. 본 연구에서는 국내 수입 승인 LM 면화 6개 이벤트(MON15985, MON531, GHB614, LLCOTTON25, MON88913, MON1445)의 동시증폭 검출법(multiplex PCR)을 개발하여 보다 신속하고 명확한 검출기법을 확립하고자 하였다. 최적 multiplex PCR 반응 조건은 2개 LM 면화 이벤트 MON15985 (214 bp), MON531 (270 bp)와 4개 LM 면화 이벤트 GHB614 (119 bp), LLCOTTON25 (164 bp), MON88913 (276 bp), MON1445 (389 bp)가 한번의 반응에 명확하게 검출되는 최적 반응 조건 및 primer 반응 농도의 조절을 통해 서로 다른 생성물 크기로 명확히 구분되도록 하였고, 최적 primer 농도는 반응액 최종농도 0.2~0.66 pmol로 primer 쌍 마다 각각 다른 최적 농도 조합의 cocktail을 만들어 활용하였다. Duplex PCR 반응 조건은 초기 $95^{\circ}C$ 5분 반응 후, $95^{\circ}C$ 15초, $55^{\circ}C$ 20초 15회 반응하고, 다시 $95^{\circ}C$ 15초, $60^{\circ}C$ 20초 25회 반응하였을 때 최적 검출이 이루어졌고, tetraplex PCR 반응 조건은 $95^{\circ}C$ 5분 반응 후, $95^{\circ}C$ 15초, $60^{\circ}C$ 20초 50회 반응하였을 때 최적 검출이 이루어졌다. 본 연구에서 개발된 multiplex PCR 검출법은 국내 수입 유통 LM 면화의 자연환경 모니터링에 활용함에 있어 요구되는 연구인력, 시간 및 비용을 보다 효율적으로 개선하는데 적용될 수 있을 것으로 사료된다. The growth area of living modified (LM) cotton has steadily increased every year, since its first commercialization in 1996. Development of environmental risk assessment tools and techniques for LM cotton is required for ecosystem safety. We therefore developed multiplex PCR assays for simultaneous detection of two (MON15985, MON531) and four (GHB614, LLCOTTON25, MON88913 and MON1445) LM cotton events approved in Korea, with event specific primer pairs. The PCR reactions were optimized by using event specific primers of six LM cottons at various concentrations. The reactions allows amplification of estimated amplicons of MON15985 (214 bp), MON531 (270 bp), GHB614 (119 bp), LLCOTTON25 (164 bp), MON88913 (276 bp), and MON1445 (389 bp) from multiplex PCR reactions. The multiplex PCR assay developed allowed that two annealing steps (15 cycles at $55^{\circ}C$ and 25 cycles at $60^{\circ}C$) were performed for amplification of distinguished two LM cottons, and only one annealing step (50 cycles at $60^{\circ}C$) was necessary for tetraplex PCR. Primer extension step of all PCR reactions was skipped for time-effective amplification. Our methods suggest that two multiplex PCR assays can be cost-effective and a rapid diagnostic tool for environmental LMO monitoring of six LM cottons.

신규 수입 승인 6개 유전자변형작물의 검출기법 개발

설민아,조범호,최원균,신수영,엄순재,김일룡,송해룡,이중로,Seol, Min-A,Jo, Beom-Ho,Choi, Wonkyun,Shin, Su Young,Eum, Soon-Jae,Kim, Il Ryong,Song, Hae-Ryong,Lee, Jung Ro 한국식물생명공학회 2017 식물생명공학회지 Vol.44 No.1

일반적으로 유전자를 재조합하는 생명공학기술이 널리 이용되고 있는 것은 유전자변형 작물 분야이다. LM 제품에 대한 의존도가 높아짐에 따라 한국에서는 LMO의 안전성에 대한 우려가 지속적으로 증가하고 있다. 따라서, 우리는 자연환경 내 비의도적으로 방출된 LMO를 판별할 수 있는 검출기법을 확립하였다. JRC 정보를 토대로 6개 LM 이벤트(캐놀라 1, 옥수수 1, 콩 4개)의 유전자를 검출할 수 있는 PCR 조건을 확립하였다. 각 LM 시료에서 genomic DNA를 분리하였고, 이벤트 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 실험을 수행하였다. 또한 자체적으로 확립된 검출법에 의해 모든 LMO의 이벤트 특이적 유전자가 검출되었다. LM 유전자의 삽입 위치를 분석하기 위해 PCR 생성물을 이용하여 염기서열을 분석하였다. 이 결과는 LM 이벤트의 특이적인 유전자를 효율적으로 검출할 수 있음을 나타낸다. 게다가 본 연구결과 확립된 검출기법은 자연환경 내 LM 작물의 모니터링 및 사후 관리에 활용될 것이다. Living modified crops are genetically modified living organisms and are widely used in biotechnical research and desired goods. As the reliance on LM products, concerns about safety of LMOs have been continuously increased in South Korea. We established the detection methods for unintentional released LMOs in environmental conditions. To detect six LM event genes of 1 canola, 1 maize and 4 soybeans, PCR conditions were based upon consideration of the Joint Research Centre information. Genomic DNAs were isolated from LM samples and PCR analysis were performed using each event-specific primer pair. Event-specific genes of all events were efficiently recognized by our methods. To investigate the insertion site of LM genes in each genome, we verified PCR product sequence by DNA sequencing. These results suggest that the LM event-specific gene amplification can be efficiently developed. In addition, our detection method is fit for monitoring and post-management of LM crops in the environment.

자연생태계 모니터링을 통한 glyphosate와 glufosinate-ammonium에 저항성을 가지는 유전자변형 캐놀라의 발견

신수영,조범호,문정찬,이중로,최원균,설민아,김미정,송해룡,Shin, Su Young,Jo, Beom-Ho,Moon, Jeong Chan,Lee, Jung Ro,Choi, Wonkyun,Seol, Min-A,Kim, Mi-Jeong,Song, Hae-Ryong 한국식물생명공학회 2016 식물생명공학회지 Vol.43 No.4

식품용 및 사료용 유전자변형작물은 매년 국내에 수입이 되고 있으며 유전자변형 캐놀라는 중요한 수입 작물 중의 하나이다. 유전자변형작물의 국내 재배는 허용되고 있지않지만 수입양은 매년 증가하고 있는 실정이다. 본 연구에서는 2009년부터 2013년까지 전국 9개 도를 대상으로 국내 수입된 유전자변형 캐놀라의 자연생태계 내 유출 정도를 파악하고자 모니터링을 실시하였다. 모니터링 조사는 항만, 사료공장, 축산농가, 운송로, 축제지 주변을 대상으로 실시하였다. 채집된 유전자변형 캐놀라 의심시료는 DNA에 기반을 둔 방법과 단백질에 기반을 둔 방법으로 분석하였다. 총 1850개 지점 조사에서 총 595개의 의심시료를 발견하였으며 6개의 유전자변형 캐놀라를 확인하였다. 국내 수입 승인된 단일이벤트 T45, MS8, RT73, Rf3, Topas 19-2의 primer를 사용한 PCR반응을 통해 2개의 glyphosate 저항성을 가지는 이벤트와 4 개의 glufosinate-ammonium에 저항성을 가지는 이벤트를 확인하였다. 본 연구를 통해 자연환경 모니터링 연구가 자연생태계 내의 유전자변형작물의 비의도적 유출을 예방하기 위해 매우 유용하다는 것을 알 수 있으며 사후관리를 수행하기 위한 기초자료를 구축하는데 활용될 것으로 사료된다. Living modified (LM) crops are imported each year to South Korea as food and feeds, LM canola being one of the imported crops. The cultivation of LM crops is not permitted in South Korea but the import of these crops is increasing. In this study, we surveyed the environmental risk of imported LM canola at 9 provinces, from March 2009 to June 2013. Monitoring of canola was conducted around feed factories, roadsides, harbors, farmhouses, and flower festival regions. From the total of 595 canola samples collected from 1850 monitoring sites, we identified 6 LM canola samples. The LM canola samples were subjected to protein and DNA based analysis. PCR analyses using approved 5 single event primers (T45, MS8, RT73, Rf3 and Topas 19-2) revealed that two crops were glyphosate-resistant LM canolas, and four were glufosinate-resistant LM canolas. This study suggested that environmental monitoring is a useful research tool to manage LM crops unintentionally introduced into the environment in South Korea. This result can be used as a basis for future post-management of canola crops.

2014년 경기지역 유전자변형 옥수수 모니터링 및 발견현황

신수영,문정찬,최원균,김일룡,조범호,이중로,Shin, Su Young,Moon, Jeong Chan,Choi, Wonkyun,Kim, Il Ryong,Jo, Beom-Ho,Lee, Jung Ro 한국식물생명공학회 2018 식물생명공학회지 Vol.45 No.1

국내에서 LM 작물의 재배는 승인 된 바 없으나 식품용 및 사료용으로 LM 작물이 수입되고 있으며 LM 작물의 국내 수입량은 꾸준히 증가하고 있는 추세이다. 본 연구는 2014년 경기 지역의 LM 옥수수 유출여부를 모니터링 하기 위해 수행되었으며 채집된 의심시료는 단백질 검정 분석법과 중합효소 연쇄반응을 통해 분석하였다. 경기 지역의 항만, 운송로, 사료공장 및 축산농가 등 총 169개 지점을 조사하였고 총 44개의 LM 옥수수 의심시료를 채집하였다. 단백질 검정 분석법으로 4개의 양성반응 시료를 확인하였고 동일지점의 시료는 혼합하여 총 3개의 시료에 대해 프로모터 스크리닝과 이벤트 특이적 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응을 실시하여 의심시료 모두 LM 옥수수로 확인하였다. 본 연구의 결과는 국내 자연환경에서 LM 옥수수의 유출 현황 파악과 자연 생태계로 LM 옥수수의 유출을 예방하기 위해 자연생태계 모니터링이 매우 중요하다는 것을 뒷받침한다. In South Korea, LM crops are not allowed to grow locally, but have been allowed to be imported as food and feed purposes. Currently, the typical LMO imports are continuously increasing in the region of South Korea. In 2014, we carried out a review of the environmental release monitoring of LM maize (Zea mays L.) in Gyeonggi-do of South Korea, and analyzed volunteer samples using strip test kits and polymerase chain reaction (PCR) methods. We thereby collected 44 volunteers of released LM maize in 169 locations around ports, from roadsides, feed factories and stockbreeding farmhouses. We found 4 positive samples at 3 sites using strip test kits. Based on the PCR analysis, the LM maize plants were found using event-specific primers. These results suggested that our monitoring is necessary to detect the presence of released LM maize in the natural environment of South Korea.

한국산 고지질 미세조류 Botryococcus의 분포 및 생장 특성

신상윤 ( Sang Yoon Shin ),조범호 ( Beom Ho Jo ),이형관 ( Hyung Gwan Lee ),오희목 ( Hee Mock Oh ) 한국환경생물학회 2013 환경생물 : 환경생물학회지 Vol.31 No.4

한국산 고지질 Botryococcus를 확보하기 위해 시료채취를 하였고, 실험실에서 Botryococcus sp.를 분리하였다. 분리된 Botryococcus sp.는 현미경으로 그 크기와 형태를 관찰하였고, 분자적 동정을 위해 18S rRNA gene과 ITS region의 염기서열을 분석함으로써 Botryococcus sudeticus J2로 명명하였으며, 생태학적 특성 연구를 위해 문헌조사를 통해 국내의 Botryococcus 속의 분포를 조사를 실시하였다. 동정된 B. sudeticus J2의 생리적 특성 분석을 위해 배양실험을 수행하였고, 생장률과 바이오매스 생산성 그리고 광합성효율을 측정하였다. 또한 바이오디젤 생산을 위한 조류주로서의 가치를 판단하기 위해 총 지질함유량과 지방산 조성을 분석하였다. B. sudeticus J2의 생태적, 생리적 연구 후 2배의 광량과 2% CO2 조건에서 배양을 수행함으로써 최적 배양조건을 탐색하고자 하였다. 분리된 B. sudeticus J2는 비교를 위한 B. braunii UTEX 572보다 높은 바이오매스 생산성과 지질생산성을 보였으나 바이오매스 생산을 위한 다른 후보 미세조류에 비해서는 낮은 생장률을 보였다. 따라서 바이오디젤 생산을 위한 조류로 B. sudeticus J2를 활용하기 위해서는 본 연구에서 밝혀진 광저해에 대한 내성에 초점을 맞추어 최적 배양을 위한 광조건을 탐색하는 연구가 필요하다. Recently, sustainable production of biofuel using algal biomass is being pursued because of its enormous potential. First and foremost, securing superior strains to develop an efficient production system for algal biodiesel through screening or genetic improvement of microalgae is necessary. The genus of Botryococcus is regarded as one of the superior microalgae for biodiesel production due to its ability to accumulate high amounts of lipids and hydrocarbons. However, its low growth rate is a bottleneck for large-scale production and commercialization. The purpose of this study is to obtain indigenous Botryococcus strains which possess high lipid content and biomass productivity. The Botryococcus sp. was isolated from the Seobu Reservoir in Jeju Island and identified as Botryococcus sudeticus J2 by comparative analysis of 18s rRNA gene and ITS regions. The biomass productivity and lipid content of B. sudeticus J2 were 0.116 g L-1 day-1 and 40.1% of dry wt., respectively. This was higher than the value of B. braunii UTEX 572, which is widely regarded as a superior strain among Botryococcus species. The relatively high growth rate of B. sudeticus J2 was achieved under a light intensity of 240 μmol photons m-2 s-1 with ambient air spargingwhen compared to 120 μmol photons m-2 s-1 with 2% CO2 supply. In summary, it is likely that the isolated B. sudeticus J2 can be used for the mass cultivation and biodiesel production.

유전자변형생물체(Living Modified Organisms, LMOs)의 자연생태계 위해성 평가심사 현황 및 신기술 개발에 따른 향후 과제

최원균 ( Won Kyun Choi ),조범호 ( Beom Ho Jo ),설민아 ( Min A Seol ),엄순재 ( Soon Jae Eum ),박준형 ( Jun Hyung Park ),송해룡 ( Hae Ryong Song ) 한국국제농업개발학회 2014 韓國國際農業開發學會誌 Vol.26 No.3

Living Modified Organisms (LMOs) and derived feed products are subject to a risk assessment and regulatory approval before entering the market in South Korea. In this process, the role of the National Institute of Ecology (NIE) is to assess any possible risks that the use of a LMO may pose to the environment. The scientific risk analyses are carried out by Expert Panel on LMOs which consists of 15-20 scientific experts from LMO-associated research institutes and universities. The applications from a LMO-producing company are throughly assessed by the Panel in accordance with Annex 10-1 attached in the Law on Transboundary Movement of LMO, and then the Panel decides whether declared conflicts require further scientific explanations. Modern developments of New Plant Breeding Technologies (NPBTs) make ambiguous and difficult to define whether or not LMOs derived from NPBTs fall within or outside the legislations for LMO. Actually, Japan has recently concluded that the maize DP-32138-1 derived from Seed Production Technology (SPT, developed by DuPont) is not subject to legislations for LMOs and will consider if products developed by NPBTs are within or outside the LM legislations on a case-by-case basis. However, the occurrence of unintended effects associated to the use of NPBTs can not be ruled out. Therefore, now is the right time not only to build up the update version of Annex 10-1 to cover the lack of current risk assessment criterions but to think about unknown adverse effects with NPBTs through both international and national LMO working group experts.

한국산 Botryococcus braunii (Trebouxiophyceae)의 분리 및 계통분류학적 분석

이승훈 ( Seung Hoon Lee ),이찬희 ( Chan Hee Lee ),조범호 ( Beom Ho Jo ),안치용 ( Chi Yong Ahn ),김한순 ( Han Soon Kim ),오희목 ( Hee Mock Oh ) 한국환경생물학회 2012 환경생물 : 환경생물학회지 Vol.30 No.1

Abstract - Recently, energy security is one of the most important world-wide issues. Biodiesel derived from microalgae has received much attention as a renewable bioenergy. The green colonial alga, Botryococcous braunii, is characterized by the ability to produce and accumulate large amounts of hydrocarbons and fatty acids. In this study, we have isolated 5 strains of B. braunii from Korean surface waters using a microcapillary-pipetting method and identified them by morphological features and phylogenetic analysis of the 18S rRNA gene. Phylogenetic analysis indicates that 5 strains of B. braunii are placed in the class of Trebouxiophyceae, and strains belong to race A type producing hydrocarbons which are alkadienes and alkatrienes. In addition, we need further studies to find out optimal growth conditions for producing biodiesel.