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막투과성 변화로 인한 대황의 Candida albicans에 대한 항진균 활성
이흥식,김연희,Lee, Heung-Shick,Kim, Younhee 한국미생물학회 2014 미생물학회지 Vol.50 No.4
Candida albicans는 면역력이 약화된 환자의 표재성에서 전신적 감염까지 다양한 부위에서 감염을 유발시킬 수 있는 기회 감염적 병원성 진균이다. C. albicans는 효모형에서 균사형으로 변환될 수 있으며 이 때 바이오필름을 형성할 수 있다. 바이오필름과 관련된 C. albicans의 감염은 일반적으로 통상적인 항진균제에 대해 내성을 보이므로 새로운 항진균제에 대한 개발이 절실하다. 대황(Rheum undulatum)은 전통적으로 한국과 중국에서 하제나 소염제로 사용되는 약용 식물이다. 본 연구의 목적은 R. undulatum이 캔디다증 환자로부터 분리한 C. albicans 바이오필름 형성 균주에 대한 바이오필름 형성 억제효과와 이에 대한 항진균 활성 기작을 알아보는 것이다. R. undulatum (0.098 mg/ml)은 12종의 바이오필름 형성 임상균주의 캔디다 바이오필름을 $49.4{\pm}6.0%$ 감소시켰고 C. albicans의 폴리스티렌 표면으로의 부착을 억제시켰다. CFDA, AM과 propidium iodide로 이중 염색한 결과 R. undulatum은 C. albicans의 세포막을 손상시켰으며 propidium iodide와 neutral red로 염색하여 공초점 레이저 현미경과 위상차 현미경으로 관찰한 결과 C. albicans의 세포용해를 야기함을 관찰할 수 있었다. Crystal violet 흡수율 실험으로 R. undulatum에 의한 세포막 투과성의 변화를 관찰하였다. 따라서 R. undulatum은 세포막의 손상과 세포막의 투과성 변화로 야기된 세포의 용해와 관련된 항진균 활성이 C. albicans의 바이오필름 형성을 억제하는 것으로 보여진다. 본 연구의 결과는 R. undulatum이 바이오필름과 관련된 캔디다의 감염을 치료하고 제거하기 위한 천연물 기반 항진균제 개발에 대한 좋은 후보물질임을 보여준다. Candida albicans is an opportunistic and the most prevalent fungal pathogen that can cause superficial and systemic infections in immunocompromised patients. C. albicans can promote the transition from budding yeast to filamentous form, generating biofilms. Infections associated with C. albicans biofilms are frequently resistant to conventional antifungal therapy. Therefore, the development of more effective antifungal drugs related with biofilm formation is required urgently. The roots of Rheum undulatum have been used for medicinal purposes in Korea and China traditionally. The aim of present study was to evaluate the effect of R. undulatum extract upon preformed biofilms of 12 clinical C. albicans isolates and the antifungal activities. Its effect on preformed biofilms was evaluated using XTT reduction assay, and metabolic activity of all tested strains was reduced significantly ($49.4{\pm}6.0%$) at 0.098 mg/ml R. undulatum. The R. undulatum extract blocked the adhesion of C. albicans biofilms to polystyrene surfaces, and damaged the cell membrane integrity of C. albicans which was analyzed by CFDA, AM, and propidium iodide double staining. It caused cell lysis which was observed by Confocal laser scanning and phase contrast microscope after propidium iodide and neutral red staining, respectively. Membrane permeability was changed as evidenced by crystal violet uptake. The data suggest that R. undulatum inhibits biofilm formation by C. albicans, which can be associated with the damage of the cell membrane integrity, the changes in the membrane permeability and the cell lysis of C. albicans.
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단삼에 의한 Candida albicans 바이오필름 발달의 억제
이흥식 ( Heung-shick Lee ),김연희 ( Younhee Kim ) 한국미생물생명공학회(구 한국산업미생물학회) 2019 한국미생물·생명공학회지 Vol.47 No.3
Candida albicans는 기회감염을 유발하는 주요한 병원성 진균 중의 하나이다. 캔디다증 치료과정에서 항진균제에 대한 내성이 흔히 발견되는데, 그 이유는 Candida가 바이오필름을 형성할 수 있기 때문이다. 이전의 연구에서 우리는 단삼(Salvia miltiorriza)의 에탄올추출물이 세포막의 투과성을 변화시키고 세포벽 합성을 저해하여 항캔디다 활성을 나타냄을 밝혔다. 본 연구에서는 10개 C. albicans 임상균주가 형성한 초기단계의 바이오필름을 대상으로 XTT 환원분석법으로 대사활성을 측정하니, 78 μg/ml 단삼 에탄올추출물에 의해 바이오필름의 대사활성이 평균 51.3% 감소되었다. C. albicans 세포들이 폴리스티렌 표면에 부착하거나 germ tube를 형성하는 과정에서의 단삼 에탄올추출물의 영향을 현미경으로 분석하니, 39 μg/ml 단삼 에탄올추출물에 의해 부착된 세포의 밀도는 현저하게 감소하였으나 germ tube 형성은 거의 억제하지 못했다. 단삼 에탄올추출물이 C. albicans SC5314 세포의 균사에 특이적인 유전자 발현에 미치는 영향을 qPCR로 분석한 결과, EAP1은 34.7% (p < 0.001), ALS1은 45.0% (p < 0.001), ALS3는 48.1% (p < 0.001), ECE1은 21.3% (p = 0.006) 억제하였다. 결론적으로 단삼의 에탄올추출물은 초기단계의 C. albicans 바이오필름 발달을 효율적으로 저해하며, 이는 EAP1, ALS1, ALS3 유전자의 발현억제에 따른 세포부착 억제와 관련이 있다. 더불어 단삼 에탄올추출물의 C. albicans 세포막 기능저해와 세포벽 합성억제에 의한 구조변화 또한 세포부착단계에서의 바이오필름 발달억제에 기여할 것으로 추정된다. Candida albicans is an opportunistic human pathogen that causes infections. Candidiasis is often related to antifungal resistance because the pathogen has the ability to form biofilms. In a previous study, we found that the Salvia miltiorriza ethanol extract demonstrated anticandidal activity by altering membrane permeability and inhibiting the cell wall synthesis in C. albicans. Our results here demonstrate that 78 μg/ml of the S. miltiorriza extract significantly diminished the early stage biofilms formed by 10 clinical C. albicans isolates by 51.3%; this was analyzed by 2,3-Bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide salt (XTT) reduction assay. The effect of the S. miltiorrhiza extract on the adhesion of C. albicans cells to polystyrene plates and germ tube formation was examined via microscopic investigation. Although the density of the adhered cells was remarkably reduced up on incubation with 39 μg/ml S. miltiorrhiza extract, germ tube formation by C. albicans was rarely affected. Quantitative real-time PCR analysis showed that the S. miltiorrhiza extract downregulated the expression of C. albicans hypha-specific genes, EAP1 by 34.7% (p < 0.001), ALS1 by 45.0% (p < 0.001), ALS3 by 48.1% (p < 0.001), and ECE1 by 21.3% (p = 0.006), respectively. Our data suggest that the S. miltiorrhiza ethanol extract significantly inhibited the early stage of biofilm formation by C. albicans by interfering with cell adhesion, by downregulating EAP1, ALS1 and ALS3, and presumably by modifying the cell wall and membrane structure.
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김용재,이흥식,하운환,Kim, Yong-Jae,Lee, Heung-Shick,Ha, Un-Hwan The Microbiological Society of Korea 2012 미생물학회지 Vol.48 No.3
이 연구의 목적은 코리네형 균주(Corynebacterium glutamicum)에 존재하는 acyltransferase 유전인자의 발현에 관여하는 autoinducer에 대한 정보를 얻기 위해 다양한 종류의 균주에서 얻은 세포배양액(cell-free culture fluids)을 처리하여 발현에 미치는 효과를 조사하는 것이다. 다양한 배양시간동안 얻은 Agrobacterium tumefaciens의 세포배양액은 acyltransferase의 발현을 전혀 증가시키지 못하는 것으로 관찰되었다. 반면 AI-1과 AI-2를 분비하는 것으로 알려진 Vibrio harveyi BB120($AI-1^+$, $AI-2^+$)을 지수성장기까지 배양시켜 얻은 세포배양액은 acyltransferase의 발현을 증가시키는 것으로 관찰되었다. 이들 autoinducer가 미치는 효과를 조사하기 위하여 돌연변이 균주인 MM77 ($AI-1^-$, $AI-2^-$)과 BB152 ($AI-1^-$, $AI-2^+$)를 사용하여 조사한 결과, 이들 균주에서 얻은 세포배양액은 BB120와는 달리 acyltransferase의 발현을 증가시키지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과로 보아 acyltransferase의 발현은 AI-1에 의한 효과로 보이며, 이를 확인하기 위해 V. harveyi BB152와 같이 AI-2만을 분비하는 것으로 알려진 Escherichia coli ($AI-1^-$, $AI-2^+$)를 사용하였다. 하지만 E. coli 세포배양액은 acyltransferase의 발현을 증가시키는 것으로 관찰되었다. 이들 결과는 코리네형 균주에 존재하는 autoinducer는 기존에 알려진 형태의 신호분자와 차이가 있을 것이며, 코리네형 균주외에 V. harveyi와 E. coli에도 존재하여 종간 상호작용(interspecies communication)에 관여할 것으로 보인다. Autoinduction is mediated by signaling molecules known as autoinducers (AIs) that are produced, released and detected by bacterium itself. We recently reported that Corynebacterium glutamicum possesses an autoinduction system which secretes autoinducers during the stationary-phase of growth, triggering the expression of acyltransferase gene. However, it is still not clear what may act as autoinducers for the autoinduction in C. glutamicum. In this study, we compared the inducing effects of cell-free culture fluids obtained from a number of microbes including Agrobacterium tumefaciens, Vibrio harveyi, and Escherichia coli. Fluids from A. tumefaciens did not increase the expression of acyltransferase, whereas fluids from V. harveyi BB120 ($AI-1^+$, $AI-2^+$) did. Interestingly, the expression was increased by the fluids obtained from the early exponential-phase culture of BB120. Furthermore, this induction was not observed by the fluids from autoinducer mutants of V. harveyi MM77 ($AI-1^-$, $AI-2^-$) and BB152 ($AI-1^-$, $AI-2^+$). Unlike the effect shown by BB152, fluids from E. coli ($AI-1^-$, $AI-2^+$) still induced the acyltransferase expression. Taken together, these results suggest that C. glutamicum autoinducers seem to be unidentified molecules which do not belong to AI-1 or AI-2.
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Corynebacterium ammoniagenes에서 purF 유전자의 조절 및 이에 특이적인 조절 단백질의 분리
이석명,김연희,이흥식,Lee, Seok-Myung,Kim, Youn-Hee,Lee, Heung-Shick 한국미생물학회 2009 미생물학회지 Vol.45 No.3
Corynebacterium ammoniagenes의 purF 유전자의 발현을 purF의 프로모터 추정 부위에 cat 유전자를 융합시킨 transcriptional fusion 플라스미드를 제작하여 분석하였다. 유전자 purF는 adenine과 guanine에 의해 20~30%의 전사 저해효과를 나타내지만, hypoxanthine에는 저해를 받지 않는 것으로 나타났다. 또한 purF의 발현은 대수기중반에 최대에 달한 후 정체기 후반부까지 일정한 것으로 나타났다. 동시에, C. glutamicum에서 사용되는 강력한 프로모터인 $P_{180}$이 Escherichia coli의 $P_{tac}$보다 C. ammoniagenes에서 모든 성장 단계에서 40~50%의 향상된 프로모터 활성을 나타내었고 대수기 후반부에 최고 활성에 달해, C. ammoniagenes의 연구에도 활용 가능함을 확인하였다. DNA-affinity purification에 의해 C. ammoniagenes의 purF 프로모터에 결합하는 단백질로서 C. glutamicum의 Crp-family transcriptional regulator (NCgl0120)와 상동성이 높은 단백질을 검출하였다. 이 단백질은 크기가 40.1 kDa으로서 PAGE에서 관찰된 단백질 크기와 일치하였다. 이에 상응하는 C. ammoniagenes의 단백질은 400개의 아미노산으로 구성되어 있고, 42 kDa의 단백질을 만들며, pI는 4.9일 것으로 추정되었다. 이는 기존에 알려져 있는 E. coli 및 Bacillus subtilis의 PurR과 각각 14.1%, 15.8%의 아미노산 상동성을 보여, PurR과는 다른 종류의 단백질일 것으로 여겨진다. The expression of Corynebacterium ammoniagenes purF was analyzed by utilizing a plasmid carrying a cat gene fused to the purF promoter region. Adenine and guanine repressed the expression of the purF gene by 20~30% but hypoxanthine did not exert such repressive effect. The expression purF was maximal at the late log phase and remained constant throughout the stationary phase. Promoter $P_{180}$ which was developed in C. glutamicum was also functional in C. ammoniagenes, achieving maximal activity at the late log phase. The promoter outperformed Escherichia coli $P_{tac}$ promoter by 40~50% level. DNA-affinity purification identified a protein which could bind to the promoter region of the purF gene. The protein showed high similarity to the CRP-family transcriptional regulator encoded by NCgl0120 in C. glutamicum. The size of the screened protein agreed with the expected protein size from the ORF NCgl0120. The corresponding gene in C. ammoniagenes encoded a 42 kDa polypeptide composed of 400 amino acids with expected pI of 4.9. The encoded protein showed 14.1% and 15.8% identity with E. coli and Bacillus subtilis PurR, respectively, suggesting that the isolated protein might be a novel type of regulatory protein involved in the regulation of purine metabolism.
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Corynebacterium glutamicum의 sigH 유전자의 분리 및 기능분석
김태현,김형준,박준성,김연희,이흥식,Kim Tae-Hyun,Kim Hyung-Joon,Park Joon-Sung,Kim Younhee,Lee Heung-Shick 한국미생물학회 2005 미생물학회지 Vol.41 No.2
유전자 lacZYA가 aces 유전자의 프로모터 하단에 연계된 $(P_{aceB}-lacZYA)$ 리포터 플라스미드를 함유하는 Escherichia coli를 이용하여 glyoxylate bypass를 매개하는 유전자중하나인 aceB의 발현을 조절하는 것으로 여겨지는 Corynebacterium glutamicum클론들을 색판독에 의해 분리하였다. 이 중 한 개의 클론을 선택하여 분석할 결과 이 클론을 함유한 E. coli는 리포터 플라스미드에서 발현되는 $\beta-galactosidase$의 활성 이 약 $40\%$ 감소하였고 이는 클론에서 발현되는 단백질이 aceB프로로터에 작용함에 기인한 것으로 판단되었다. 서열분석결과 ORF1과 ORF2의 두 개의 인접한 ORF가 발견되었고 이중 ORF2가 reporter plasmid의 $\beta-galactosidase$의 활성 감소에 직접적으로 기여함을 알 수 있었다. ORF1은 206아미노산으로 구성된 23,218 Dalton의 단백질을 발현하는 것으로 여겨졌고, 유사성 분석결과 ECF-type에 해당되는 RNA polymerase의 sigma factor를 암호화하는 것으로 보여 sigH로 명명하였다. 유전자 sigH의 기능을 밝히기 위해 gene disruption technique을 이용하여 sigH 유전자가 기능을 하지 못하는 돌연변이 균을 제작하였으며 이 균주는 야생형에 비해 성장속도가 저하됨을 관찰하였다. 또한 변이균은 oxidative stress를유발하는 pumbagin둥에 대해서도 민감성을 나타내었다. 이들 결과는, 유사성 분석결과에서도 볼 수 있듯이 sigH유전자가 세포성장과정 중 처하게 되는 각종 stress중 특히 oxidative stress에 대한 대응과 관련되어 발현될 수 있음을 암시한다.상관관계는 공간적인 범위가 10$\times$10km 이하인 경우에 높게 나타났다. 하지만 공간범위가 그 이상이 될 경우에는 그 내부에서 나타나는 다양성으로 인해 통계적인 상관성이 현격하게 낮아지는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 지역 및 국가 단위의 환경변화모델에서 모델의 공간적인 구성범위가 일정한 수준을 넘으면, 그 내부에서 발생하고 있는 다양성이 급격하게 증가하여 지표피복변화의 원인과 결과를 정확하게 파악하기 힘들게 된다는 것을 의미한다. 10$\times$10km의 공간적인 범위는 농업생산이 위주가 되는 사바나 지역에서는 주로 개별 마을이 차지하고 있는 공간적인 범위와 대체적으로 일치한다. 따라서 사바나 지역에서 나타나는 지표피복변화의 다양성을 고려하면서 보다 정확하게 모형화하기 위해서는 마을단위에서 나타나는 지표피복변화과정이 최소의 모델단위가 되어야 함을 시사한다. 아니라 다른 방법으로 영향을 미치고 있다는 것을 알 수 있었다., 계절별로는 여름철에 강수가 집중됨으로서 습성강하물 침착량이 총량적으로 증가하였으며, 그 값은 $SO_4^{2-}\;2.118g/m^2/season,\;NO_3^-\;1.509g/m^2/season,\;Cl^-\;2.185g/m^2/season,\;NH_4\;^+\;1.096g/m^2/season$로. 나타났다. 계절별 잎의 평균 pH의 변화는 봄 pH $5.9\pm0.5$, 여름 pH $5.5\pm0.4$, 가을 pH $5.1\pm0.3$을 나타내었고, 엽중 수용성 황함량의 계절별 평균값은 봄 $0.012\pm0.004\%$, 여름 $0.012\pm0.002\%$, 가을 $0.020\pm0.007\%$ 수준을 보이고 있다. 수피 내 함유되어 Corynebacterial clones which exert regulatory effects on the expression of the glyoxylate bypass genes were isolated using a reporter plasmid carrying the enteric lacZ fused to the aceB promoter of Corynebacterium glutamicum. Some clones carried common fragments as turned out by DNA mapping technique. Subcloning analysis followed by the measurement of $\beta-galactosidase$ activity in Escherichia coli identified the region responsible for the aceB-repressing activity. Sequence analysis of the DNA fragment identified two independent ORFs of ORF1 and ORF2. Among them, ORF2 was turned out to be responsible for the aceB-repressing activity. ORF1 encoded a 23,216 Da protein composed of 206 amino acids. Sequence similarity search indicated that the ORF may encode a ECF-type $\sigma$ factor and designated sigH. To identify the function of sigH, C. glutamicum sigH mutant was constructed by gene disruption technique and the sigH mutant showed growth retardation as compared to the wild type strain. In addition, the mutant strain showed sensitivity to oxidative-stress generating agent plumbagin. This result imply that sigH is probably involved in the stress response occurring during normal cell growth.
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Corynebacterium glutamicum에서 분리된 프로모터를 이용한 메치오닌 생합성 유전자의 조절해제
박수동,박익현,최종수,김일권,김연희,이흥식,Park Soo-Dong,Park Ik-Hyun,Choi Jong-Soo,Kim Il-Kwon,Kim Younhee,Lee Heung-Shick 한국미생물학회 2005 미생물학회지 Vol.41 No.4
Corynebacterium glutamicum에서 promoter-probe vector인 pSK1Cat을 이용해 분리된 프로모터를 함유하는 단편들 중 가장 높은 활성을 나타낸 $P_{19}$ 단편에 대한 심도 있는 분석을 수행하였다. Subcloning을 실시하여 프로모터 활성을 지닌 DNA 영역을 180 bp로 압축할 수 있었고 $(P_{180})$, 이를 C. glutamicum의 균주개량 측면에서 그 활용성을 분석하였다. C. glutamicum에서 메치오닌 생합성에 관여하는metX유전자의 메치오닌에 의한 repression을 해제시키기 위하여 metX유전자의 promoter를 $P_{180}$ promoter로 교체하였고 $(P_{180}-metX)$, $P_{180}-metX$를 C. glutamicum에 도입하여 발현되는 homoserine acetyltransferase 활성을 다양한 성장조건에서 측정하였다. MB 영양배지에서 배양하는 경 우 $P_{180}-metX$를 함유는 균주는 wild type보다 약 24배 높은 homoserine acetyltransferase 활성을 나타내었다. Tac 프로모터에 연계하는 경우 $(P_{tac}-metX)$, 약 13배의 활성 증가만이 관찰되었다. 최소배지에서 배양한 후 분석한 결과, $P_{180}-metX$에서의 발현양상은 배지에 첨가된 methionine에 의해 영향받지 앓음을 확인하였는데, 이는 $P_{180}$ 단편이 생합성 유전자의 derepression에 의한 아미노산 생산균의 개량에 효율적으로 이용될 수 있음을 의미한다. $P_{180}-metA$를 라이신 생산균에 도입하는 경우 최대 약 0.8g/l의 메치오닌이 생산됨을 확인하였다. A transcriptionally active fragment $(P_{19})$ isolated by utilizing the promoter-probe shuttle vector pSK1Cat was analyzed. By subcloning analysis, the 180 bp region $(P_{180})$ responsible for the activity was determined. Transcriptional fusion of the C. glutamicum metX gene to $P_{180}\;(P_{180}-metX)$ resulted in a 24-fold increase in MetX activity in a complex medium, while a 13-fold increase was observed with the $P_{tac}$ promoter. Additionally, the expression conferred by $P_{180}$ was not affected by methionine added to the growth medium, suggesting that the $P_{180}$ clone is useful for the deregulated expression of biosynthetic genes in C. glutamicum during amino acid fermentation. Introduction of $P_{180}-metX$ into a lysine-producing C. glutamicum resulted in the production of methionine to 0.8 g/l.
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