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DNA 추출법에 따른 혐기소화조 미생물 군집 분석 결과 비교
신주희(Juhee Shin),김영백(Youngback Kim),신승구(Seung Gu Shin) 대한환경공학회 2021 대한환경공학회지 Vol.43 No.1
목적: DNA 추출 방법에 따른 혐기소화조 시료의 미생물 군집 분석 결과를 비교한다. 방법: 실규모 중온 혐기소화조 시료를 동일 볼륨으로 소분하였다. DNA 추출법으로는 국내에서 많이 사용하는 제품 중 미국 MP Biomedicals사의 FastDNA spin kit for soil, 한국 GeneAll사의 Exgene stool DNA mini kit, 그리고 한국 Bioneer사의 AccuPrep genomic DNA extraction kit의 세 종류를 사용하였다. 박테리아의 경우 V3-4, 고세균의 경우 V4-5 region에 해당하는 16S rDNA amplicon을 제작한 뒤, 일루미나 iSeq 100 장비로 염기 서열을 분석하였다. 미생물 군집 분석을 위해서 quality filter를 거친 유효한 read만을 얻은 뒤, OTU clustering을 하여 RDP classifier를 이용해 계통 분석(taxonomic assignment)하였다. 결과 및 토의 : Weighted UniFrac distance로 군집 결과를 시각화한 결과, 박테리아와 고세균 모두 사용한 세 가지 kit에 따라 군집 구조 차이를 보였으며, 특정 군집들은 DNA 추출 방법에 따라 존재 비율의 차이가 크게 나타났다. 예를 들어, soil kit은 Proteobacteria 문에 대한 추출 효율이 다른 추출법에 비해 낮고, Thermotogae에 대해서는 높은 것으로 나타났으며, stool kit은 이와 반대의 경향성을 보였다. 고세균의 경우, genus 중 Methanomethylovorans와 Methanosarcina가 DNA 추출법의 영향을 특히 많이 받는 것으로 나타났다. 결론: 미생물 군집 결과는 DNA 추출 방법에 영향을 받았다. 동일 선상의 실험에서 미생물 군집을 비교하려면 반드시 동일한 DNA 추출 방법을 사용해야 한다는 것을 확인하였다. Objectives : This study was performed to compare three commercial kits for the extraction of genomic DNA from anaerobic digestate for subsequent iSeq 100 sequencing and microbial community analysis. Methods : A full-scale mesophilic biogas plant was sampled, and made into aliquots of identical volumes to extract DNA using three commercial kits: FastDNA spin kit for soil (MP Biomedicals, USA), Exgene stool DNA mini (GeneAll, South Korea) and AccuPrep genomic DNA extraction kit (Bioneer, South Korea). To analyze the microbial communities in the purified DNA, 16S rDNA amplicon sequencing (V3-4 region for bacteria and V4-5 region for archaea) was performed on the Illumina iSeq 100 platform. Quality filtered sequence reads were OTU-clustered for taxonomic assignment conducted using the RDP classifier on-line. Results and Discussion : The microbial community structure visualized on the NMDS plot using the weighted UniFrac distance revealed that both bacteria and archaeal communities have phylogenetic differences depending on the DNA extraction kit used. In addition, the abundance of certain microbial populations was significantly different among the DNA extraction methods. For example, Proteobacteria was the least abundant using the soil kit, while this phylum was the most abundant when the stool kit was used. However, in the case of Thermotogae, this tendency was vice versa. The abundance of archaeal genera Methanomethylovorans and Methanosarcina was also affected by DNA extraction methods. Conclusions : The microbial populations analyzed by 16S based sequencing were affected by DNA extraction methods. To compare microbial community changes in the identical set of research, one DNA extraction method should be chosen and used consistently for the whole experiment.
항바이러스제 처리와 경정배양에 의한 배(Pyrus pyrifolia L.) '만수'의 Apple stem grooving virus 무병화
조강희,신주희,김대현,박서준,김세희,천재안,김미영,한점화,이한찬,Cho, Kang Hee,Shin, Juhee,Kim, Dae-Hyun,Park, Seo Jun,Kim, Se Hee,Chun, Jae An,Kim, Mi Young,Han, Jeom Hwa,Lee, Han Chan 한국식물생명공학회 2016 식물생명공학회지 Vol.43 No.3
본 연구는 Apple stem grooving virus (ASGV)에 감염된 배 (Pyrus pyrifolia L.) '만수'의 기내배양 식물체를 이용하여 효과적인 배 바이러스 무병화 기술을 알아보고자 수행하였다. 식물체의 경정조직을 잘라 열처리($37^{\circ}C$), 한냉처리($4^{\circ}C$), 항바이러스제인 ribavirin을 단독 또는 복합처리하였다. 처리기간은 2, 4, 8주였으며 ribavirin 농도는 20과 $40mg{\cdot}L^{-1}$이었다. 바이러스 제거율은 Reverse transcription polymerase chain reaction 분석으로 확인하였다. 신초 생존율은 2주간 한냉처리, 항바이러스제 단독처리와 한냉처리와 항바이러스제가 복합처리된 그룹에서 100%로 높았고 열처리에서 33.3%로 가장 낮았다. 단독으로 ribavirin을 처리한 그룹은 처리기간이 길수록 신초 생존율이 감소하는 경향이었다. ASGV 제거율은 2주간 ribavirin $40mg{\cdot}L^{-1}$ 농도로 처리한 그룹과 열처리와 ribavirin을 복합처리한 그룹에서 100%로 높았다. 한냉처리한 그룹의 바이러스 제거율은 16.7%로 가장 낮았으나 한냉처리와 ribavirin을 복합처리한 그룹에서는 43.3%로 향상되었다. 모든 처리에서 처리기간이 길수록 바이러스 제거율은 증가하였다. 본 실험을 통해 배 ASGV 제거에는 경정배양과 더불어 항바이러스제인 ribavirin을 $20mg{\cdot}L^{-1}$ 농도로 4주간 처리하거나 $40mg{\cdot}L^{-1}$ 농도로 2주간 단독처리만으로도 효과적으로 무병화가 가능할 것으로 판단되었다. In this study, in vitro-cultured 'Mansoo' pear (Pyrus pyrifolia L.) plants infected with Apple stem grooving virus (ASGV) were used for testing the efficiency of the virus elimination methods. The shoot tips cut from infected plants were treated by thermotherapy ($37^{\circ}C$), cold therapy ($4^{\circ}C$), chemotherapy with ribavirin, and combination of these methods. Treatment periods were 2, 4, and 8 weeks, and concentrations of ribavirin were 20 and $40mg{\cdot}L^{-1}$. The efficiency of ASGV elimination was evaluated by reverse transcription polymerase chain reaction. The shoot survival rate was the highest at 100% after cold therapy, chemotherapy, and combination of two methods, while the rate was the lowest at 33.3% after thermotherapy for 2 weeks. The shoot survival rate after chemotherapy decreased gradually as the treatment period was prolonged. The ASGV elimination rate was the highest at 100% after ribavirin treatment at a concentration of $40mg{\cdot}L^{-1}$ and combination of ribavirin treatment and thermotherapy for 2 weeks, whereas the ASGV elimination rate after cold therapy was the lowest at 16.7%. However, the efficiency of ASGV elimination was enhanced up to 43.3% by the combination of cold therapy and ribavirin treatment. The efficiency of ASGV elimination for all treatments was increased as the treatment period was prolonged. Based on these results, we suggest that ribavirin treatment at a concentration of $20mg{\cdot}L^{-1}$ for 4 weeks or at a concentration of $40mg{\cdot}L^{-1}$ for 2 weeks combined with shoot tip culture was efficient for the elimination of ASGV from pear.