중간엽줄기세포 장기배양에서 dexamethasone의 세포증식효과

송인환(In-Hwan Song),김성용(Seong-Yong Kim) 대한체질인류학회 2007 대한체질인류학회지 Vol.20 No.4

인체의 항상성은 세포의 재생, 분화 그리고 사망의 균형 속에 유지된다. Dexamethasone은 중간엽줄기세포의 분화유도제로 오랫동안 사용되어 왔음에도 불구하고 이 세포의 증식과 세포자멸사에 대한 연구는 빈약한 실정이다. 중간엽줄기세포의 증식, 분화, 그리고 자멸사 사이의 균형에 미치는 dexamethasone의 영향을 알아보고자 세포를 dexamethasone을 첨가한 군과 첨가하지 않은 군으로 나누어 3주간 배양하였다. 이 기간 동안 매주마다 세포수, DNA양, 분열세포수 자멸사세포수 그리고 alkaline phosphatase 검사를 하였다. 초기에는 dexamethasone을 처리한 군에서 DNA와 세포수가 낮았으나 3주째는 역전되었다. 세포분열은 두 군에서 차이를 보이지 않았음에도 불구하고 세포자멸사는 dexamethasone을 첨가한 군에서 유의하게 낮았다. 결론적으로 중간엽줄기세포의 장기적인 고밀도배양에 있어서 dexamethasone은 세포자멸사를 억제하여 세포증식에 영향을 미친다고 할 수 있다. Homeostasis of the body is maintained by balance of cell renewal, differentiation, and death. Dexamethasone has been used long time in field of MSCs research as differentiation inducer while, in contrast, there has been little work on the effect of dexamethasone on apoptosis and proliferation of MSCs. To determine the effect of dexamethasone on apoptosis and proliferation, MSCs were cultivated with (Dex) or without (Con) dexamethasone for 3 weeks. During this period weekly cell count, DNA assay, mitosis, apoptosis as well as alkaline phosphatase assay observation were recorded. DNA and cell number of Dex group was lower than Con group in early period but exceed at 3th week. There is no significant difference in mitosis between both groups whereas apoptosis frequency in Dex group was lower than that of in Con group. These results indicate that dexamethasone influences cell proliferation of MSCs in long term confluent culture by suppression of apoptosis.

배양중 중간엽줄기세포의 dexamethasone 노출중단에 따른 증식과 분화양상 변화

송인환(In-Hwan Song),김주영(Joo Young Kim),성언기(Eon Gi Sung),김성용(Seong Yong Kim) 대한해부학회 2007 Anatomy & Cell Biology Vol.40 No.4

골수 중간엽줄기세포는 여러 중배엽세포로 분화될 수 있는 능력에 기인해 많은 연구자들에 의해 손상된 신체복구를 위한 세포치료제로의 활용가능성이 타진되고 있다. Dexamethasone은 중간엽줄기세포 분화유도에 중요한 역할을 하며 시험관 내에서 뼈모세포, 지방세포, 섬유모세포 등으로 분화시킬 수 있다. 지금까지 지속적 dexamethasone 처리에 따른 분화유도에 대해서는 많은 연구가 되어 왔으나 분화유도 과정에서 dexamethasone 제거에 따른 분화효과의 영향에 대한 보고는 찾아보기 힘들다. 하지만 현실적으로 사용 가능성이 높은, dexamethasone으로 전처리한 후 생체에 이식했을 경우 이식된 후의 세포분화의 판단에 중요한 지표가 될 수 있다. 이에 본 연구에서는 dexamethasone을 투여하여 중간엽줄기세포의 분화를 유도하는 과정에 1주 단위로 dexamethasone을 제거하면서 뼈모세포 분화의 척도로 alkaline phosphatase의 발현 정도를 분석하였고 BrdU에 노출시킨 후 이에 대한 면역염색으로 BrdU에 표지된, 분열 중인 세포수의 비율을 조사하였다. Dexamethasone으로 1주 및 2주 처리한 군에서는 alkaline phosphatase의 발현이 dexamethasone 제거 후 바로 감소하여 4~5주에 대조군 수준으로 감소하였으나 3주 및 4주 처리군은 3주경에 최고치에 도달한 후 감소하기 시작하였고 1주 및 2주 처리군에 비해 높은 수치를 유지하였다. 세포분열정도를 분석한 실험에서 dexamethasone을 투여한 군에서 분열도가 대조군에 비해 낮은 경향을 보였으며 dexamethasone을 제거하면 상당기간 세포분열이 유의성 있게 증가 되었는데 이런 경향은 dexamethasone을 6, 9, 12, 15일 동안 처리한 군에서 뚜렷하였다. 이 결과를 보면 중간엽줄기세포는 dexamethasone에 의해서 뼈모세포로 분화되어 가는데 충분한 기간 처리되지 않으면 그 분화효과는 크게 감소하는 것으로 보이며 그 기간은 3주 이상 처리되어야 한다고 판단된다. With potential of differentiation into many different lineages, mesenchymal stem cells have been candidate on cell therapy for recovery of injured body. Dexamethasone plays important role in mesenchymal stem cells differentiation and can derived into osteoblast, chondrocytes, adipocytes, and fibroblasts in vitro. There has been many studies on effect of dexamethasone for differentiation of MSCs with continuous exposure, but little work on the effect for deprivation during this progress. This result will be an important guild line for evaluation of transplanted MSCs after pretreatment with dexamethasone. In this study, dexamethasone was deprived by weekly withdrawal schedule in the process of differentiation induction by dexamethasone. During this period, expression of APase was evaluated as mark of osteoblast differentiation and number of BrdU incorporated cells were counted as index of proliferation. APase level of one or two week exposure groups decreased immediately after deprivation of dexamethasone and approached to control level at 4~5 week but three or four week exposure groups reached peak level at 3th week then decreased but still remained higher level than other groups. Dexamethasone exposure groups showed the trend of decreased in mitotic activity compared to control, but there were significant increase in mitosis after deprivation of dexamethasone. This pattern prominent in 6, 9, 12, 15 day exposure groups. These results showed that the effect of dexamethasone derived MSCs differentiation into osteoblasts is faint without full enough exposure and the period should be more than three weeks.

시험관내 인공피부 제작

송인환(In Hwan Song) 대한체질인류학회 1998 해부·생물인류학 (Anat Biol Anthropol) Vol.11 No.2

인공피부는 시험관내 피부질환 연구모델 뿐 아니라 화상치료 등의 임상적 응용 도구로서 매우 유용한 가치를 가지고 있다. 본 연구에서는 이에 대한 타당성을 검증해 보고자 인공진피 위에 각질화세포를 심고 공기에 노출시켜 배양하여 인공피부를 제작한 후 전자현미경으로 미세구조를 관찰하였다. 표피는 바닥층, 가시층, 과립층, 각질층에 해당하는 10층 이상의 중층을 형성하였다. 하지만 표피 -진피 경계면에 바닥막과 고정원섬유는 형성되지 않았다. 세포경계면에 부착반점이 형성되었지만 생체에 비해 다소 수가 적고 크기도 작았다. 중간세사는 양이 적었을 뿐만 아니라 아주 섬세하였고 이러한 경향은 가시층에서 두드러졌다. 과립층의 각질유리과립은 생체조직에 비해 크기가 작고 수도 적었다. 각질층에서 이상각화증 소견이 관찰되었다. 이상의 소견들을 종합해 볼 때 인공피부에서 각질화세포의 분화과정이 다소 불안전한 점을 감안하더라도 시험관 내 연구모델로 유용하게 활용되리라 판단된다.

Distribution Patterns of Involucrin in the Stratum Corneum of the Normal and Psoriatic Artificial Skins

송인환(In-Hwan Song),성훈기(Hoon-Ki Sung),김주영(Joo-Yung Kim),성언기(Eon-Ki Sung),이융창(Yungchang Lee),박정현(Jeong-Hyun Park),문용석(Yong-Suk Moon),김홍태(Hong-Tae Kim),장성익(Sung-Ik Chang) 대한해부학회 2004 Anatomy & Cell Biology Vol.37 No.2

Cornified envelope는 최종분화과정에 있는 각질세포의 형질막 밑에 형성되는 비용해성의 구조로서 involucrin, loricrin, cornifin 등 여러 단백질의 상호연결로 안정화된다. 건선은 염증과 각질세포의 과다증식을 특징으로 하는 만성 피부질환이며 각질층의 involucrin에 대한 면역염색에서 정상 표피와는 차이가 있다. 즉 건선에서는 cornified envelope에 제한되나 정상피부에서는 세포질 전반에 표지된다. 본 실험에서는 건선과 정상 각질세포의 분화양상을 비교하기 위해서 건선병변부와 정상피부의 각질세포를 분리 배양하여 정상 및 건선인공피부를 제작하고 이들의 각질층에서 involucrin에 대한 면역금표지법을 시행하였다. 인공건선피부에서는 얇고 엉성한 각질층이 형성되었으며 표지반응이 아래층에서는 세포질 전반에 걸쳐, 상부층에서는 cornified envelope에 국한된 양상을 보여 생체에서와 유사하였다. 정상인공피부에서는 잘 형성된 중층의 두꺼운 각질층이 관찰되었지만 아래쪽의 대부분 영역에서 이상각화증의 흔적이 보였고 세포질 전반에 분포하는 표지반응을 보였다. 표면쪽의 일부 세포에서 cornified envelope에 집중되는 표지반응을 보였지만 정상인공피부의 두꺼운 각질층을 고려할 때 cornified envelope에 집중되는 경향의 정도는 인공건선피부와 비슷하였다. 결과적으로 장기형 인공배양 모델에서 정상 및 건선 각질세포의 최후 분화에서 involucrin 분포 양상은 차이가 없었다. 결론적으로 정상인공피부에서는 비록 잘 발달된 각질층이 형성되었지만 이들은 cornified envelope의 최종분화과정 까지 는 도달하지 못하는 것으로 보이며 건선피부 각질층에서 보이는 involucrin의 분포양상의 차이는 이들 세포의 특성에 기인한다기 보다는 빠른 세포성장에 기인하는 것으로 판단된다. Cornified envelope is highly insoluble structure formed beneath the plasma membrane during terminal differentiation of keratinocytes and is stabilized by cross linking of various proteins, including involucrin, loricrin, and cornifin. Psoriasis is a chronic skin disease characterizing inflammatory reaction and hyperproliferation of keratinocyte. There are some differences in involucrin immunolabelling in stratum corneum between normal and psoriasis epidermis. Labelling was convergent to cornified envelope in psoriasis skin but throughout cytoplasm in normal skin. To compare terminal differentiation patterns of normal and psoriasis keratinocytes, we reconstructed normal and psoriatic artificial skin by using primary cultured keratinocytes from normal and psoriasis skin and then performed immunogold labelling for involucrin in stratum corneum. Psoriatic artificial skin had thin and poorly organized corneal layer. Immunogold labelling for involucrin revealed same pattern of that in vivo by showing throughout cytoplasm in lower layer but convergent cornified envelope in upper layer. Compared with psoriatic artificial skin, normal artificial skin had well organized and thick stratum corneum. Involucrin labelling was throughout cytoplasm in most of corneal layer but convergent to cornified envelope in some uppermost cells. Even though some cells show convergent pattern in normal artificial skin, absolute number of this pattern was no lesser than in artificial psoriatic skin because of normal artificial skin had thick stratum corneum. This result showed there was no difference in involucrin distribution in terminal differentiation of normal and psoriasis keratinocytes in organotypic culture model. It is concluded that although well organized multiple corneal layers are formed in normal artificial skin, they can not reach to full maturation of cornified envelope, and difference of involucrin localization in cornified envelope of psoriasis epidermis is related with not peculiarities of the cells but rapid growing in vivo.

자동 세포 분할을 위한 채널 간 상관성 기반 세포 영상의 전처리 알고리즘

송인환(In-Hwan Song),한찬희(Chan-Hee Han),이시웅(Si-Woong Lee) 한국콘텐츠학회 2011 한국콘텐츠학회논문지 Vol.11 No.5

바이오 영상에서 세포 영역의 자동 분할 기술은 생물학자들이 복잡한 세포의 기능을 이해하는데 도움을 주고, 수작업을 통해 세포를 분석하던 일들을 자동적으로 처리해주는 매우 중요한 기술이다. 기존의 멀티채널 영상으로부터 세포핵 및 세포를 분할하는 방법은 DNA 채널을 이용하여 세포핵을 검출하고, 이를 초기 윤곽으로 하여 Actin 채널에서 밝기 기반의 Active Contour 모델을 통해 세포를 분할하는 2 단계의 과정을 거친다. 그러나 세포 분할 과정에서 채널 간 상관성으로 인해 발생하는 세포 내 불균일한 밝기 문제를 고려하지 않은 채, 밝기 기반의 Active Contour 모델을 적용하여 분할의 성능이 저하되는 문제점이 발생한다. 따라서 본 논문에서는 DNA 와 Actin 채널 간 상관성을 고려하여, DNA 채널 정보를 통해 Actin 채널 내부의 밝기를 균일하게 보정함으로써 밝기 기반의 Active Contour 모델이 세포 분할에 잘 적용 될 수 있는 전처리 알고리즘을 제안한다. 실험을 통해 제안 전처리 과정을 거친 세포 분할 방법의 성능이 기존 방법에 비해 객관적, 주관적으로 크게 향상됨을 증명한다. The automated segmentation technique of cell region in Bio Images helps biologists understand complex functions of cells. It is mightly important in that it can process the analysis of cells automatically which has been done manually before. The conventional methods for segmentation of cell and nuclei from multi-channel images consist of two steps. In the first step nuclei are extracted from DNA channel, and used as initial contour for the second step. In the second step cytoplasm are segmented from Actin channel by using Active Contour model based on intensity. However, conventional studies have some limitation that they let the cell segmentation performance fall by not considering inhomogeneous intensity problem in cell images. Therefore, the paper consider correlation between DNA and Actin channel, and then proposes the preprocessing algorithm by which the brightness of cell inside in Actin channel can be compensated homogeneously by using DNA channel information. Experiment result show that the proposed preprocessing method improves the cell segmentation performance compared to the conventional method.

정수처리공정에서 Geosmin의 발생 특성

송인환 ( In Hwan Song ),하준수 ( Jun Su Ha ),박찬혁 ( Chan Hyuk Park ),이상협 ( Sang Hyup Yi ) 한국물환경학회(구 한국수질보전학회) 2015 한국물환경학회·대한상하수도학회 공동 춘계학술발표회 Vol.2015 No.-

세포배양을 이용해 제작한 인공피부의 표피에서 cytokeratin 및 involucrin 발현양상

송인환(In Hwan Song),이종기(Chong Kee Lee),성언기(Eon Ki Sung) 대한체질인류학회 1999 대한체질인류학회지 Vol.12 No.1

세포배양을 이용해 제작한 인공피부의 표피에서 각질화세포의 분화 및 성장상태를 추적하기 위하여 몇 종류의cytokeratin과 involucrin의 발현 양상을 면역화학 법으로 추적하고 이를 생체피부의 결과와 비교하였다. Cytokeratin(CK) 14면역염색 결과 생체피부에서는 바닥 층 세포에 국한되어 강한 반응을 보였으나 인공피부에서는 바닥 층과 하부 가시 층에서 강한 반응을 보였다. CK10 면역염색에서 생체피부에서 바닥 층을 벗어나면서 반응 강도가 강해졌으나 인공피부에서는 가시 층 중간부위에서부터 강한 반응을 보였다. CK16과 CK17 면역염색 결과 생체피부에서는 반응을 보이지 않았고 인공피부에서는 가시 층에서만 약한 반응을 보였다. Involucrin 면역염색 결과는 생체피부에서는 상부 가시 층 이상에서 양성반응을 보였고 인공피부에서는 하부 가시 층에서부터 반응을 보이기 시작하였으며 강도가 다소 약하였다. 이상의 결과들을 정리해보면 시험관내에서 제작된 인공표피에서는 바닥세표의 성질을 하부 다수 층이 유지 하고 있으며 CK14, CKl0, involucrin은 그 발현시기가 다소 변하였지만 그 순서는 대체로 유지하고 있는 것으로 보아 생체피부에 상응하는 분화체계를 유지하고 있다고 사려 된다.

각질세포와 멜라닌세포를 공동 배양하여 제작한 인공표피에서 멜라닌세포 수의 변화

송인환(In-Hwan Song) 대한해부학회 2004 Anatomy & Cell Biology Vol.37 No.2

표피대체를 위해 배양된 세포를 이용하는 세포치료법에서 멜라닌세포와 각질세포를 배양한 후 혼합하여 중층표피를 제작할 경우 시험관내에서 멜라닌세포와 각질세포의 세포 유지비율을 알아보기 위해서 멜라닌세포와 각질세포를 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80의 비율로 혼합하여 1주일간 중층을 유도하면서 배양한 후 바닥층에서 두 세포의 비율을 조사한 결과 각각 1 : 6.7, 1 : 10.7, 1 : 12.6, 1 : 13.8 이었다. 초기 혼합비율이 8배의 차이를 두고 혼합되었으나 1주후 약 2배 정도의 차이로 좁혀졌으며 멜라닌세포에 대한 각질세포의 비율은 1 : 10 정도로 조절되어 갔다. 그 조절기전을 알아보고자 바닥층에 있는 멜라닌 세포에 대해 바닥층에서 떨어져나가는, 가시층 이상에 존재하는 멜라닌세포를 세어서 그 비율을 조사한 결과 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80 비율에서 각각 0.142, 0.140, 0.118, 0.104로 유사하였다. 이상의 결과들을 종합해 볼 때 시험관 내에서 중층 표피를 제작할 경우 멜라닌세포에 대한 각질세포의 비율은 초기 혼합 비율에 비례하지 않으며 고유의 조절 비율을 가지는데 이는 각질세포에 의해 간접적으로 조절되는 멜라닌세포의 증식에 의한 것으로 판단된다. To follow up the change of melanocytes to keratinocytes ratio in stratified epidermis reconstructed by mixed culture of these cells, the author investigated the ratio of melanocyte to keratinocyte in the basal layer of reconstructed epidermis after induction of stratification for 1 week with cocultured melanocyte and keratinocyte in various ratio. Initial mixing ratios of melanocyte to keratinocyte were 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80. Post ratios were changed to 1 : 6.7, 1 : 10.7, 1 : 12.6, 1 : 13.8 respectively after 1 week. Eight time of initial gap reduced to two times and melanocyte to keratinocyte ratio converged to 1 : 10. To know the regulation mechanism, the author investigated the ratio of basal melanocytes to suprabasal melanotytes. The ratios were nearly same by showing 0.142, 0.140, 0.118, 0.104 respectively. These results suggest that the ratio of melanocyte to keratinocyte in reconstructed stratified epidermis in vitro was not related with initial mixing ratio and was regulated by proliferation of melanocytes controled by corresponding keratinocytes.

자동 세포 분할을 위한 밝기 및 기하학적 정보 기반의 새로운 Active Contour 모델

송인환(In-Hwan Song),한찬희(Chan-Hee Han),이시웅(Si-Woong Lee) 한국콘텐츠학회 2011 한국콘텐츠학회논문지 Vol.11 No.5

최근 생물학자들이 복잡한 세포의 구조와 기능을 분석하는데 도움을 주는 고속 genome-wide RNAi 스크리닝에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 이와 관련된 연구에서 발생하는 수많은 영상을 수작업으로 분석하는 것은 많은 시간과 노력을 필요로 한다. 따라서 세포 영상의 자동 분석 기술은 관련 연구의 활성화를 위해 매우 중요하며, 그 중 영상 분할은 자동분석을 위해 반드시 필요한 과정이다. 멀티채널 영상으로부터 세포핵 및 세포를 분할하기위한 기존의 방법은 먼저, DNA 채널을 이용하여 세포핵을 검출하고, 이를 초기 윤곽으로 하여 Actin 채널에서 밝기 기반의 Active Contour 모델을 통해 세포를 분할한다. 그러나 기존 방법은 세포 분할 과정에서 일부 세포 내부에 발생하는 불균일한 밝기 문제로 인해 세포 분할 성능이 저하된다. 따라서 본 논문에서는 ground truth 영상을 통해 분할 된 세포들의 크기 사이에 상당히 큰 상관성이 존재한다는 사실에 근거하여, 기존의 밝기 기반의 Active Contour 모델이외에 세포 크기 기반의 새로운 Active Contour 모델을 함께 이용하여 세포를 분할한다, 실험을 통해 제안 세포 분할 방식의 성능이 기존 세포 분할 방식의 성능에 비해 객관적, 주관적으로 크게 향상됨을 증명한다. Recently, a study on high-throughput genome-wide RNAi screening to help biologists understand complex structure and function of cells is progressing dynamically. However the manual analysis of the large number of images taken place by in each work spends a lot of time and effort. Therefore, automatic cell image analysis technique is very important for activation of related work, where image segmentation is absolutely needed for automatic analysis. The conventional segmentation methods consist of two steps. In the first step nuclei are extracted from DNA channel, and used as initial contour for the second step. In the second step cell are segmented from Actin channel by using Active Contour model based on intensity. However, segmentation performance of conventional methods falls by inhomogeneous brightness problem in the cell. Therefore, the paper proposes energy functional of Active Contour model based on brightness and geometrical information by using the ground truth that the size of segmented cells have considerable correlation. Simulation result show that performance of the proposed cell segmentation method improves the cell segmentation performance compared to the conventional method.

배양된 사람 세포를 이용해 제작한 인공피부에서 방사선조사에 대한 dimethyl sulfoxide의 보호 효과

류영하,최갑식,송인환,Ryu Young-Ha,Choi Karp-Shik,Song In-Hwan 대한영상치의학회 2002 Imaging Science in Dentistry Vol.32 No.1

Purpose: To evaluate cultured human artificial skin as an experimental model for studying radiation effects in vitro. Materials and Methods: The skin was constructed by culturing keratinocytes over collagen lattice which made by culturing fibroblasts. Two groups were irradiated to gamma rays at single dose of 25 Gy with or without 3.5% of DMSO. Ultrastructures were investigated by electron microscopy after irradiation. The number of epidermal layers and expression of cytokeratin (CK) 14 & 10 were also seem by light microscopy. Results: At 2 days after irradiation in experimental group without DMSO, necrotic cells were rarely found in the spinosal layer and undercornified cells were visible in the homey layer. Similar findings were also found in experimental group with DMSO but in mild form. The number of epidermal layers in experimental group without DMSO were significantly fewer than other group. CK 14 expressed in all the layer excluding homey layer but CK 10 expressed over 3∼4 basal layers. Such patterns of CK expression were similar to all groups. It is suggested that structures of the keratinocytes and epidermal formation could be disturbed by irradiation in artificial skin and that DMSO can protect these damages. Conclusion : Therefore this work could be used as an organotypic experimental model in vitro using human cells for studying radiation effect in skin. Furthermore structural findings provided in this study could be used as useful basic data in further study using this model.