Change in Expression of Keratin and Proto-oncogene Induced by Beta-propiolactone in HaCaT Cell

류음(Yin Liu),성언기(Eon-Gi Sung),송인환(In-Hwan Song),Dongyi Du, 김대광(Dae-Kwang Kim),박정현(Jeong-Hyun Park),성훈기(Hoon-Ki Sung),이융창(Yungchang Lee),김주영(Joo-Young Kim) 대한해부학회 2001 Anatomy & Cell Biology Vol.34 No.4

사람 각질화 세포주인 HaCaT 세포를 Beta-propiolactone (BPL)으로 처리한 후 형태학적인 변화와 kerain 및 protooncogoen 사이의 관계를 밝히기 위해, keratin (K8, K10, K13)과 proto-oncogene (c-fos, c-jun, c-myc)의 발현 변화를 조사하였다. 다양한 농도 (0, 0.1, 1 μg/ml)의 BPL을 이 세포들에 2시간 또는 6시간 동안 처리하였다. BPL에 의해 다각형 모양의 세포들은 섬유세포형으로 변화하였다. 많은 소엽을 보이는 핵들이 나타났으며, 부착반의 수 는 감소하였다. 면역형광법과 Northern blotting의 결과, 이 약제는 K10 (정상적인 각질화세포의 분화 표지자)의 발현은 감소시켰고, 반면에 K8과 K13 (병적인 상태와 관련된 표지자)의 발현을 증가시켰다. 또한 BPL은 c-fos와 c-jun의 발현은 상향조절 시킨 반면에, c-myc의 발현은 감소시켰다. 유세포분석으로 각각의 keratin 또는 proto-oncogene, 그리고 DNA의 양을 동시에 측정하였는데, K8의 발현이 S-G2-M기에서 급격히 증가되었다. 약제 노출 2시간 이내에서 c-Fos의 경우 S-G2-M기에서 증가되었지만, c-Jun은 S-G2-M기에서 처리시간에 따라 차츰 증가되었다. G0-G1기와 S-G2-M기에서 c-Myc의 발현은 용량 및 시간에 비례하여 억제되었다. 결론적으로 BPL에 의해 유발된 이들 결과들은 형태학적인 변화와 keratin 또는 proto-oncogene들의 발현 사이에 밀접한 연관성을 반영한다. To investigate the relationship between the morphologic changes and the expression of keratin and proto-oncogene induced by Beta-propiolactone (BPL), we assessed on the expression of keratins (K8, K10, K13) and proto-oncogenes (c-fos, c-jun, c-myc) in human HaCaT cell line. The cells were treated with 0, 0.1, 1 μg/ml BPL for 2 or 6 hours. Morphologic studies revealed that BPL changed the cells into fibrocyte-shaped, caused highly lobulated nuclei and reduced desmosomes in their number. Findings of immunofluorescence and Northern blotting indicated that BPL consistently decrease expression of K10 representing a normal differentiation marker of keratinocytes, while increasing expression of K8 and K13 associated with a pathologic differentiation. This reagent also up-regulated expression of cfos and c-jun, and down-regulated expression of c-myc. Together with staining for each keratin or proto-oncogene and DNA content in flow cytometry, BPL increased K8 expression dramatically at S-G2-M phase. The induction of c-Fos at S-G2-M phase appeared within 2 hours, and c-Jun gradually occurred. However, c-Myc was inhibited regardless of phases of cell cycle. In conclusion, these changes caused by BPL demonstrate a close relationship between the morphologic evidence and the altered expression of each keratin and proto-oncogene.

rhBMP-7 adenovirus로 형질전환한 사람 섬유모세포로 유도된 뼈형성의 형태학적 조사

박정기(Jeong-Ki Park),성언기(Eon-Gi Sung),김주영(Joo-Young Kim),김재룡(Jae-Ryong Kim),안면환(Myun-Hwan Ahn),김홍태(Hong-Tae Kim),문용석(Yong-Suk Moon),송인환(In-Hwan Song) 대한해부학회 2006 Anatomy & Cell Biology Vol.39 No.2

BMP-7 adenovirus (AdBMP-7) 유전자치료제의 효용성을 확인하기 위해서 사람 진피섬유모세포를 배양하여 재조합 AdBMP-7로 형질도입 시킨 후 누드마우스의 장딴지근육에 주사하여 세포를 이식한 다음 1, 2, 4, 6주에 희생시켜 뼈발생과정을 형태학적으로 추적하였다. 세포이식 1주째 근육섬유 사이에 신생조직의 형성이 관찰되었다. 그 중 상당부분은 연골로 확인되었는데 Von Kossa 염색과 전자현미경 소견에서 연골바탕질의 석회화를 확인할 수 있었다. 이식 2주째에 해면뼈의 형성이 관찰되었고 뼈잔기둥 사이에 근육섬유들과 지방세포가 섞여 있었다. 뼈표면에는 뼈모세포와 뼈파괴세포가 관찰되었다. Von Kossa-Van Gieson 염색 결과 전반적으로 뼈잔기둥은 흡수되는 부분이 많았다. 4주째에 뼈잔기둥사이의 공간은 거대핵세포를 위시한 혈구발생과정의 세포들로 채워져 골수가 형성되었다. 이식 6주째의 조직검사에서 골수내의 뼈잔기둥은 많이 감소되었고 겉질뼈는 두꺼워졌다. 상당부분의 뼈기질은 표면에 평행한 층판배열을 하고 있었고 그 속에 뼈세포 뿐만 아니라 뼈세관과 그 속의 세포질 가지들도 관찰되었다. 본 실험의 결과로 세포를 매개로한 AdBMP-7 유전자치료제는 근육내에서 1주 이내에 연골의 발생과 기질의 석회화가 시작되어 4주 이내에 골수를 포함한 뼈조직의 형성이 완성되므로 뼈형성 촉진이 필요한 곳에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 보인다. To evaluate availability of the BMP-7 adenovirus (AdBMP-7) as a gene therapy for osteoinduction, we investigated in morphological aspect at 1, 2, 4, 6 weeks after cells injection. Primary cultured human dermal fibroblasts, transduced with AdBMP-7, were injected into gastrocnemius muscle of the nude mice. One week after fibroblasts transplantation new tissue was observed in the muscle. Majority of new tissue was evaluated as cartilage and calcification in the matrix was confirmed by Von Kossa stain as well as electron microscopy. Two weeks after transplantation, spongy bone was built up and adipocytes were observed in intertrabecular spaces. Osteoblasts and osteoclasts were observed in the bony tissue surface. In the result of Von Kossa-Van Gieson stain, osteolysis was dominant in bony trabeculae. Bone marrow was established in 4th weeks with intertrabecular space filled up by hematopoietic cells. At the 6th weeks, the number of trabeculae decreased and thickness of the cortical bone was increased. A great part of bone matrix has laminar structure which run paralleled to surface and which included osteocytes and canaliculi. These data demonstrate that cell mediated AdBMP-7 for gene therapy initiate development of cartilage and calcification of matrix within 1 week and complete bone and bone marrow formation within 4 weeks, so then, could be made practical application for promotion of osteoinduction.

생쥐 대동맥에서 혈관 내피세포 및 민무늬근육세포의 효과적 분리

김경곤(Kyung Gon Kim),성언기(Eon-Gi Sung),김주영(Joo-Young Kim) 대한해부학회 2009 Anatomy & Cell Biology Vol.42 No.2

특정 유전자들이 없는 생쥐 또는 정상적인 생쥐의 대동맥으로부터 각각 분리된 세포들을 이용하여 서로 비교분석하면 죽상경화증 등의 질병 기전을 밝히는 데 유용한 모델로 쓰일 수 있다. 본 실험에서는 4~6주된 C57BL/6J 정상 생쥐 대동맥에서 혈관 내피세포와 민무늬근육세포를 효과적으로 분리하는 방법을 확립하기 위해서, 바깥막만을 제거하여 내막과 중간막으로 구성된 대동맥조직을 얻었다. 이 조직을 제1형 또는 제2형 아교질분해효소용액으로 처리하여 각각에서 분리된 내피세포와 민무늬근육세포의 특성을 조사하였다. 이들 세포의 성장 양상은 도립현미경으로 관찰하였다. 내피세포의 표지자인 CD31과 민무늬근육세포의 표지자인 α-smooth muscle actin은 공초점현미경으로 검경하였고, 효소용액의 종류에 따른 이들 세포의 분리 효과는 전체세포 수 중각 표지자에 양성반응을 보인 세포 수를 백분율로 표시하였다. 제1형 아교질분해효소용액으로 분리된 내피세포들은 배양 10일에 배양용기의 70~80%를 세포들이 덮었고, 제2형 아교질분해효소용액의 경우 40~50%가 세포들로 덮였다. 민무늬근육세포들은 배양 13일에 제1형 및 제2형 아교질분해효소용액 모두에서 배양용기의 70~80%가 세포들로 덮였다. 제1형 아교질분해효소용액으로 분리된 세포 중 CD31 양성반응인 내피세포의 백분율은 91.1±2.865%**였고, 제2형 아교질분해효소용액을 처리한 경우는 86.4±3.641%였다(**p⁄0.05, n=5). α-smooth muscle actin 양성반응인 민무늬근육세포의 백분율은 제1형 아교질분해효소용액을 사용하였을 경우 87.9±5.713%, 제2형 아교질분해효소용액의 경우 86.6±4.778%로 두 군 사이에 유의한 차이가 없었다. 이상을 요약하면 대동맥조직을 제2형 아교질분해효소용액으로 처리하는 것에 비해 제1형 아교질분해 효소용액을 사용하는 것이 혈관내피세포를 분리하는 데 있어 더욱 효과적이었다. The mechanism of the disease such as artherosclerosis is easily elucidated by the comparison among cells isolated from each aorta of knockout mouse and wild type mouse, respectively. This study was aimed at effectively harvesting the endothelial and smooth muscle cells from 4~6 weeks old wild type C57BL/6J mouse aorta. The tunica adventitia was completely removed to get the aortic tissues only consisting of the tunica intima and the tunica media under the stereoscope. These aortic tissues were treated with type I collagenase or type II collagenase solution, respectively, and then the endothelial or smooth muscle cell was isolated. CD31 marker of the endothelial cell and α-smooth muscle actin marker of the smooth muscle cell were identified with confocal microscope. The percentages of the labelled cells by each marker represented the extent of purification of endothelial or smooth muscle cells, respectively, for harvested cells according to the collagenase solutions. 70~80% of culture vessel was covered with the endothelial cells 10 days after the treatment of the type I collagenase solution, while 40~50% of culture vessel covering with the cells after the treatment of the type II collagenase solution. 70~80% of culture vessel was covered with the smooth muscle cell regardless of the type of the collagenase solution on the 13th day. Percentages of the CD31 positive cells after the treatment with the type I or the type II collagenase solution was 91.1±2.865%** and 86.4±3.641%, respectively (**p⁄0.05, n=5). Percentages of the α-smooth muscle actin labelled cells after the treatment with the type I or the type II collagenase solution were 87.9±5.713% and 86.6±4.778%, respectively, and these values were not significantly different. Taken together, the aortic tissues using the type I collagenase solution comparing with using the type II collagenase solution were much more effective in the isolation of the endothelial cells.

배양된 별큰포식세포의 무산소-산소재공급 시험관실험모델

홍정숙(Jeong Sook Hong),성훈기(Hoon Ki Sung),송인환(In Hwan Song),김주영(Joo Young Kim),지대림(Dae Lim Jee),성언기(Eon Gi Sung) 대한해부학회 2003 Anatomy & Cell Biology Vol.36 No.3

본 실험은 생체의 특성을 잘 유지할 수 있는 별큰포식세포의 배양법을 확립하고, 배양된 별큰포식세포를 이용하여 간 의 허혈-재관류 과정에서 발생되는 별큰포식세포의 활성화를 재현할 수 있는 시험관내 실험모델을 제작하여 다음의 결과 를 얻었다. 별큰포식세포의 분리에서 collagenase의 관류, stainless 그물의 통과, Percoll gradient centrifugation 및 세포가 배양용기에 부착하는 시간의 차이를 이용한 분별부착법 등의 일련의 조작으로 90% 이상의 순수한 별큰포식세포를 얻을 수 있었다. 흰쥐 1개의 간에서 1~5×107개의 별큰포식세포를 얻었고, 다른 세포의 과다증식없이 별큰포식세포 배양을 10일 정도 유 지할 수 있었다. 배양된 별큰포식세포의 탐식능력은 배양액에 첨가된 latex beads의 탐식정도로 측정하였는데, 그 수가 한 개에서 수십 개로 다양하였다. 크고 둥근 모양의 별큰포식세포가 많은 latex beads를 탐식하였고 작거나 불규칙한 모양의 세포는 탐식 능력이 떨어져, 생체에서의 별큰포식세포의 다양성에 따른 탐식능력의 차이가 시험관에서도 유지되었다. 배양된 별큰포식세포의 무산소-산소재공급 처리한 실험군에서는 70.2%의 세포가 latex beads를 탐식하였고 latex beads 를 탐식한 세포들 중 57.5%의 세포가 5개 이상의 latex beads를 탐식하여 대조군의 48.9%와 44.3%에 비교하여 유의한 증 가를 보여 (p⁄0.01), 허혈-재관류 후에 발생되는 별큰포식세포의 활성화를 직접적으로 설명할 수 있는 결과였다. 결론적으로 본 실험에서 배양된 별큰포식세포는 탐식기능에서 생체의 특성을 잘 유지하였고, 이를 이용한 무산소-산소 재공급 시험관모델은 간의 허혈-재관류 손상에서 별큰포식세포의 역할을 이해하는데 적합한 것으로 생각된다. The aims of this study were to describe a reproducible method for the isolation, purification and primary culture of rat Kupffer cells, and were to develop in vitro system which could provide a tool for the study of ischemia-reperfusion injury. Kupffer cells were isolated following sequential collagenase digestion of the liver by perfusion and enrichment of a nonparenchymal cell fraction by a double-densities gradient centrifugation step using Percoll and were selected by allowing them to adhere to culture vessel for 2 h at 37�C under 5% CO2. The purity of obtained Kupffer cell was about 90% assessed by the phagocytosis of 3 μm latex beads. This method for Kupffer cell isolation resulted in yields of 1~5 ×107 Kupffer cells per liver and Kupffer cells were preserved in maintenance cultures for 10 days. The phagocytic capacity of cultured Kupffer cells was measured according to the amount of latex beads incorporated into the cytoplasm. Larger round Kupffer cells in the culture had higher phagocytic capacity compared with smaller round or irregular shaped Kupffer cells. The different phagocytic capacity of Kupffer cells which was dependent on size and shape in vivo was well preserved during culture. The experimental group of Kupffer cells in culture were sequentially treated with ischemia and reperfusion at 1h and 30 min. The ratio of Kupffer cells having latex beads in their cytoplasm was significantly increased compared with control (p⁄0.01). This result was able to explain the Kupffer cells’ activation after ischemia-reperfusion injury in vivo. In conclusion, Kupffer cells in this culture well resembled the cells in vivo and this in vitro model could provide a valuable tool for the study of Kupffer cells with a key role in pathophysiology of ischemia-reperfusion injury.

배양중 중간엽줄기세포의 dexamethasone 노출중단에 따른 증식과 분화양상 변화

송인환(In-Hwan Song),김주영(Joo Young Kim),성언기(Eon Gi Sung),김성용(Seong Yong Kim) 대한해부학회 2007 Anatomy & Cell Biology Vol.40 No.4

골수 중간엽줄기세포는 여러 중배엽세포로 분화될 수 있는 능력에 기인해 많은 연구자들에 의해 손상된 신체복구를 위한 세포치료제로의 활용가능성이 타진되고 있다. Dexamethasone은 중간엽줄기세포 분화유도에 중요한 역할을 하며 시험관 내에서 뼈모세포, 지방세포, 섬유모세포 등으로 분화시킬 수 있다. 지금까지 지속적 dexamethasone 처리에 따른 분화유도에 대해서는 많은 연구가 되어 왔으나 분화유도 과정에서 dexamethasone 제거에 따른 분화효과의 영향에 대한 보고는 찾아보기 힘들다. 하지만 현실적으로 사용 가능성이 높은, dexamethasone으로 전처리한 후 생체에 이식했을 경우 이식된 후의 세포분화의 판단에 중요한 지표가 될 수 있다. 이에 본 연구에서는 dexamethasone을 투여하여 중간엽줄기세포의 분화를 유도하는 과정에 1주 단위로 dexamethasone을 제거하면서 뼈모세포 분화의 척도로 alkaline phosphatase의 발현 정도를 분석하였고 BrdU에 노출시킨 후 이에 대한 면역염색으로 BrdU에 표지된, 분열 중인 세포수의 비율을 조사하였다. Dexamethasone으로 1주 및 2주 처리한 군에서는 alkaline phosphatase의 발현이 dexamethasone 제거 후 바로 감소하여 4~5주에 대조군 수준으로 감소하였으나 3주 및 4주 처리군은 3주경에 최고치에 도달한 후 감소하기 시작하였고 1주 및 2주 처리군에 비해 높은 수치를 유지하였다. 세포분열정도를 분석한 실험에서 dexamethasone을 투여한 군에서 분열도가 대조군에 비해 낮은 경향을 보였으며 dexamethasone을 제거하면 상당기간 세포분열이 유의성 있게 증가 되었는데 이런 경향은 dexamethasone을 6, 9, 12, 15일 동안 처리한 군에서 뚜렷하였다. 이 결과를 보면 중간엽줄기세포는 dexamethasone에 의해서 뼈모세포로 분화되어 가는데 충분한 기간 처리되지 않으면 그 분화효과는 크게 감소하는 것으로 보이며 그 기간은 3주 이상 처리되어야 한다고 판단된다. With potential of differentiation into many different lineages, mesenchymal stem cells have been candidate on cell therapy for recovery of injured body. Dexamethasone plays important role in mesenchymal stem cells differentiation and can derived into osteoblast, chondrocytes, adipocytes, and fibroblasts in vitro. There has been many studies on effect of dexamethasone for differentiation of MSCs with continuous exposure, but little work on the effect for deprivation during this progress. This result will be an important guild line for evaluation of transplanted MSCs after pretreatment with dexamethasone. In this study, dexamethasone was deprived by weekly withdrawal schedule in the process of differentiation induction by dexamethasone. During this period, expression of APase was evaluated as mark of osteoblast differentiation and number of BrdU incorporated cells were counted as index of proliferation. APase level of one or two week exposure groups decreased immediately after deprivation of dexamethasone and approached to control level at 4~5 week but three or four week exposure groups reached peak level at 3th week then decreased but still remained higher level than other groups. Dexamethasone exposure groups showed the trend of decreased in mitotic activity compared to control, but there were significant increase in mitosis after deprivation of dexamethasone. This pattern prominent in 6, 9, 12, 15 day exposure groups. These results showed that the effect of dexamethasone derived MSCs differentiation into osteoblasts is faint without full enough exposure and the period should be more than three weeks.

Effect of Paclitaxel on the β-actin, Fibronectin, Laminin and Fine Structure in HeLa and L929 Cells

김주영(Joo-Young Kim),류인(Yin Liu),성훈기(Hoon-Ki Sung),박정현(Jeong-Hyun Park),송인환(In-Hwan Song),성언기(Eon-Gi Sung),이융창(Yungchang Lee) 대한해부학회 2001 Anatomy & Cell Biology Vol.34 No.1

Paclitaxel로 처리한 HeLa 및 L929 암세포주에서 생기는 β-actin, fibronectin 및 laminin의 세포질 내 분포의 변화가 형태학적인 변화와는 어떤 연관이 있는지를 알아보기 위해 본 실험을 시행하였다. 이 약제에 의한 세포증식의 조절에 관하여는 MTT 분석을 하였고, 위에서 언급된 세포질 내 단백질들의 변화는 면역세포화학적 방법과 analySIS AUTO로 분석하였다. 세포의 형태적인 변화들은 도립현미경과 투과전자현미경으로 관찰하였다. MTT 분석 결과로는 paclitaxel 1 μM과 10 μM의 농도에서 HeLa 세포는 세포성장이 대조군에 비해 20~80% 억제되었고 L929 세포는 27~44% 억제되었으며, 그 효과는 약제의 용량과 시간에 따라 증가되었다. β-actin, fibronectin 및 laminin의 분포는 핵 주변부에서 강한 반응을 보였던 것이 약제 처리 후 세포질 전체에 고루 분포하면서 약한 반응을 나타냈다. 형태학적인 변화로는 2가지 종류의 세포 모두에서 이질염색질의 증가, 과립형질내세망의 부착리보소체의 떨어짐 및 골지복합체의 절편화를 쉽게 볼 수 있었다. 따라서, paclitaxel에 의한 이들 세포의 성장억제와 형태학적인 변화들은 위의 세가지 종류의 단백질들의 재배열과 그 합성의 감소와 밀접히 연관될 것으로 생각된다. The aim of this investigation was to elucidate the changes in the cytoplasmic distribution of β-actin, fibronectin, and laminin through mainly the morphological changes occurring in HeLa and L929 cancer cell treated with paclitaxel. Whether or not paclitaxel regulates cell proliferation was assessed with MTT assay. Possible influence on the distribution of β-actin, fibronectin, and laminin in these cells was confirmed with immunocytochemistry and analySIS Auto software program. The changes in cell morphology were observed under inverted and electron microscope. The MTT assay showed that 1 μM and 10 μM concentrations of paclitaxel inhibited HeLa cell growth approximately by 20% to 80% and L929 cell by 27% to 44% in a dose- and time-dependent manner. The distribution of these proteins was changed from the condensed around nucleus and strong reaction to the weak throughout cytoplasm. The morphological changes indicated that paclitaxel changes the location or number of protein synthesis apparatus: damages of RERs, Golgi complex, and increase of heterochromatin. These data suggest that the growth inhibition and morphological changes of tumor cells induced by paclitaxel might be modulated by the rearrangement and decreased production of β-actin, fibronectin, and laminin in cytoplasm.

흰쥐에서 단감발효주가 알코올성 지방간 형성에 미치는 영향

남경숙(Kyung-Sook Nam),김주연(Juyoun Kim),노상규(Sang K. Noh),박중협(Joong-Hyeop Park),성언기(Eon-Gi Sung) 한국식품영양과학회 2011 한국식품영양과학회지 Vol.40 No.11

본 연구에서는 흰쥐를 이용, 단감발효주의 항산화성과 알코올성 지방간 증상 완화에 미치는 영향을 조사하였다. Lieber-DeCarli 액체 표준식이만 공급받는 동물군을 대조군, 에탄올에 의한 열량 보충으로 대조군과 동일 열량의 액체식이를 공급받은 에탄올군, 에탄올군과 동일한 양의 알코올을 함유하는 단감발효주가 혼합된 액체식이를 공급받는 단감발효주군으로 하여 7마리씩 3그룹으로 나누어 6주간 사육하였다. 시작 전, 3주째, 그리고 6주째에 혈액을 채취하였고 간은 6주 혈액 채취 직후 적출되었다. 단감발효주의 총 페놀함량은 24.59mg/100mL이었고 SOD 유사활성은 20.9 %이었으며 DPPH 라디칼 소거능은 27%로 나타났다. 6주간 의 체중증가율은 대조군과의 비교에서 에탄올군에서는 유의적으로 감소되었으나 에탄올군과 단감발효주간의 비교에서는 차이가 없었다. 혈액의 중성지방 농도는 에탄올군과 단감발효주군에서 유의적으로 감소되었다. 혈액의 ALT, AST 농도는 대조군에 비해서 에탄올군에서 유의적으로 증가되었으나 단감발효주군에서는 유의적으로 감소하였다. 간조직의 사진촬영에서와 유사하게 간조직의 총지방량은 대조군에 비해 에탄올군에서 유의적으로 증가되었고 단감 발효주군에서는 유의적으로 감소하였다. 간조직의 주요 지방 종류별 총지방산 비교에서도 중성지방 분획의 지방산들은 에탄올군에서 유의적으로 증가되었으나 단감발효주군에 서는 유의적으로 감소되는 경향을 보였다. 본 실험을 통해 단감발효주가 알코올 섭취로 증가된 혈중 지질 수준과 간기능 지표 수준을 개선시키는 효과를 나타냈으며 지방간 형성이 유의적으로 억제되는 것을 간조직 지방분석을 통해 확인 하였다. 이는 전통기능성주인 단감발효주에 포함된 다양한 폴리페놀이 알코올에 의한 간 손상을 보호하는데 기여할 수 있음을 증명한 실험결과로 판단된다. Persimmons are shown to contain high levels of phenolics. The present study was designed to investigate if a sweet persimmon wine (SPW) would affect the development of alcoholic fatty liver in rats. Initially, male Sprague-Dawley rats were housed singly in stainless steel wire-bottomed cages in a room of controlled temperature and lighting. The rats had free access to a nutritionally adequate AIN-93G diet and deionized water. After the acclimatization period, rats were weight-matched and assigned to the following three groups: two groups were fed 6.7% ethanol or the caloric equivalent of maltose-dextrin in a Lieber-DeCarli diet and the other group was fed the isocaloric Lieber-DeCarli diet containing SPW at the same ethanol level. All three groups were fed their respective diets for 6 weeks. Serum transaminase, cholesterol, and triglyceride levels were measured. Liver lipids and histology were assessed at 6 weeks. The total phenolic content and the antioxidant and free radical scavenging activities of SPW were determined. SPW significantly increased antioxidant and free radical scavenging activities. As markers of liver injury, serum alanine and aspartate transminases were markedly lowered by SPW at 6 weeks. SPW significantly reduced the serum levels of serum cholesterol and triglyceride compared to ethanol treatment. SPW delayed the development of an alcoholic fatty liver by reversing fat accumulation in the liver, as evidenced in histological observations. Taken together, SPW seems to protect the liver from becoming fatty by alleviating fatty liver symptoms and lowering hepatic and serum lipid levels. Such a protective effect of SPW appears to be in part due to its phenolics.

각질세포분비물이 멜라닌세포의 형태 및 멜라닌소체의 이동에 미치는 영향

윤용현(Yong Hyun Yoon),김주영(Joo Young Kim),송인환(In Hwan Song),성언기(Eon Gi Sung) 대한해부학회 2007 Anatomy & Cell Biology Vol.40 No.3

각질세포분비물은 피부색을 결정하는 멜라닌세포의 성장과 분화 혹은 멜라닌의 합성과 이동에 영향을 미친다. 이들의 효과를 알고자 본 실험에서는 인체의 음경껍질에서 분리 배양된 각질세포와 멜라닌세포를 공동배양 하였고, 그 결과를 순수배양과 혼합배양을 시행하여 비교하였다. 멜라닌세포의 활성화 정도를 알고자 가지돌기 수와 세포면적을 계산하였고, 티로시나제의 농도를 측정하여 생성된 멜라닌의 양을 비교하였으며, 투과전자현미경 표본으로 멜라닌소체의 이동을 관찰하였다. 공동배양의 멜라닌세포가 순수배양과 비교하여 세포면적(p⁄0.05)에는 유의한 증가가 있었으나 가지돌기 수에는 유의한 차이가 없었다. 공동배양 2일과 4일째의 티로시나제의 농도는 순수 및 혼합배양과 비교하여 유의하게 높았다(p⁄0.05). 공동배양에서는 배양시간이 경과함에 따라 티로시나제의 농도가 감소하였으나 순수 및 혼합배양에서는 증가하였고, 배양 6일째에 모든 배양에서 유사한 농도를 보였다. 공동배양에서 티로시나제의 농도가 배양액에서는 높았으나 각질세포에서는 검출되지 않았다. 공동배양 및 혼합배양에서 각질세포로 이동된 멜라닌소체를 투과전자현미경 표본에서 관찰할 수 없었다. 결과적으로 각질세포분비물은 멜라닌세포의 형태와 멜라닌의 합성에는 영향을 미쳤으나, 멜라닌소체의 각질세포로의 이동에는 도움을 주지 않았다. Keratinocyte-derived factors are involved in regulating the proliferation, differentiation or melanogenesis of melanocytes. To investigate the effects of keratinocyte-derived factors on the skin pigmentation, human melanocytes and keratinocytes were cultivated in the forms of pure melanocyte or keratinocyte culture system, co-culture system (melanocytes and keratinocytes were cultivated together in a vessel but they were separated with semipermeable membrane) or mixed culture system (melanocytes and keratinocytes were cultivated together in a vessel in mixed form). The authors studied the cellular features (dendritogenesis and area) and the tyrosinase activities and observed the electron microscopic structures for melanosome transfer. Melanocyte in co-culture system increased in the area (p⁄0.05) but not in the dendritogenesis compared with the melanocyte in pure culture system. The tyrosinase activities of co-culture system on the 2nd and 4th day revealed higher compared with the ones of the pure and mixed culture system (p⁄0.05). In the co-culture system, the tyrosinase activities were gradually decreased with the lapse of time and vice versa in the pure and mixed culture system. On the 6th day culture, all of the three melanocyte culture systems showed the same tyrosinase activities. In spite of high tyrosinase activities in the medium, there were no tyrosinase activities in keratinocytes with the co-culture system. In transmission electron microscopic findings, there were scant of melanosomes in keratinocytes with the co-culture and mixed culture systems. In conclusion, keratinocyte-derived factors modulate the activities and melanogenesis of melanocytes but there were no effects on melanosome transfer to keratinocytes.

재조합 BMP-7 adenovirus로 형질도입된 사람 진피섬유모세포를 이용한 아교스폰지에서의 뼈발생

류 탁(Tak Ryoo),김재룡(Jae-Ryong Kim),안면환(Myun-Whan Ahn),박정현(Jeong-Hyun Park),성훈기(Hoon-Ki Sung),김주영(Joo-Young Kim),성언기(Eon-Gi Sung),이융창(Yungchang Lee),송인환(In-Hwan Song) 대한해부학회 2004 Anatomy & Cell Biology Vol.37 No.4

사람에서 재조합 BMP-7 유전자를 뼈형성 및 재생에 활용하기 위하여, 조직공학적 방법과 유전자이식을 함께 응용하여 면역결핍생쥐에서 뼈형성을 유도하고자 하였다. 재조합 BMP-7 adenovirus를 사람 진피섬유모세포로 형질도입시킨 후 제1형아교용액과 함께 배양하여 아교스폰지를 만들고 이를 생쥐의 피하조직에 이식하여 1, 2, 4, 6, 8주에 2마리씩 희생시켜 뼈형성이 유도되는지를 조직표본염색, 투과전자현미경관찰, 방사선 촬영 등으로 조사하였다. 1주째의 아교스폰지 주위에 많은 수의 세포가 모여들어 있었고 이들과 섬유들이 동심원상으로 둘러싸며 피막구조를 형성하고 있었다. 피막 및 이와 인접한 이식된 아교스폰지 내에 혈관이 형성되었지만 아교스폰지 중심부의 세포는 핵이 농축되고 세포 사이의 경계가 불분명하였다. 이식 2주째에는 피막에 신생 뼈조직으로 보이는 산호성구조를 관찰할 수 있었다. 그 속에 뼈세포방을 가지고 있었고 시간이 경과하면서 영역이 확장되었다. 이들 구조에 대한 Von Kossa 염색에서 양성반응을 보여 뼈조직임을 확인하였다. 광학현미경관찰에서 연골로 보이는 구조는 보이지 않았지만 2주째의 전자현미경관찰에서 피막 주위에 소수의 연골모세포가 관찰되었다. 6주 이후부터 방사선사진상 이식부위에서 고음영을 관찰할 수 있었고 조직검사에서 아교스폰지 전 영역에 걸친 뼈형성을 관찰하였다. 바깥쪽으로는 겉질뼈가 형성되었고 안쪽에는 얼마간의 지주뼈가 형성되었으며 그 사이에 잘 발달된 혈관들과 지방세포들로 채워져 골수와 유사한 구조를 취하고 있었다. 이식된 아교스폰지 내의 뼈형성 빈도를 분석한 결과 1, 2, 4, 6, 8주 각각 0, 63, 88, 100, 100% (n = 8) 에서 뼈형성이 관찰되었다. 이상의 결과 재조합 BMP-7 adenovirus를 형질도입한 사람 섬유모세포와 아교스폰지를 담체로 이용해 얻은 본 실험의 면역결핍생쥐에서의 뼈형성은 사람에서의 재조합 BMP-7을 이용한 유전자이식의 또 다른 가능성을 보인 것이라 판단된다. As a preceding study to apply recombinant BMP-7 gene to the human, we investigated bone formation in immunodeficient mice by using tissue engineering and gene transplatation. Human dermal fibroblasts were transduced with AdBMP-7 and cultured with type I collagen solution to form collagen sponge. The collagen sponge containing AdBMP-7 transduced fibroblasts was transplanted into hypodermis of the mice and osteogenesis in the spongy was investigated by histochemical, electronmicroscopic, and radiologic methods at 1, 2, 4, 6, and 8 weeks. At one week after transplantation, there were fluent cells infiltration around the collagen sponge and capsular structure was formed with fibers arranged in concentric circles. New vessel formation was observed in the capsule and subcapsular area of the sponge, but there were nucleus condensation and obscure cell boundary in the cells of the central region. Lacuna containing eosinophilic structures were observed in the capsular structure at two weeks. This structures were enlarged with time and were confirmed to be bone tissue by showing positive reaction for Von Kossa stain. Cartilaginous structure was not observed in light microscopic level, but a few chondroblasts were observed in pericapsular area in electron microscopic observation. After 6 weeks, radiopaque shadows were observed at the region of transplantation. Cortical bone was formed in periphery of the sponge while marrow like structure was observed in central region; some trabecula bone, adipocytes, and well developed vessels. The percentage of bone formation in transplanted sponge at 1, 2, 4, 6, and 8 weeks were 0, 63, 88, 100, and 100% (n = 8), respectively. From these results, bone formation by BMP-7 transduced human dermal fibroblasts using collagen sponge scaffolds in immunodeficient mouse shows another potential way of human gene transplantation using recombinant BMP-7 adenovirus.

배양에 따른 심장근육세포의 박동과 세포사이결합의 변화

홍종욱(Jong-Wook Hong),박정현(Jeong-Hyun Park),김대광(Dae-Kwang Kim),송인환(In-Hwan Song),성언기(Eon-Gi Sung),이융창(Yungchang Lee),김주영(Joo-Young Kim) 대한해부학회 2003 Anatomy & Cell Biology Vol.36 No.3

생후 3일된 흰쥐의 심장근육세포들을 배양하면서 배양시간에 따른 동시박동 수를 측정하였고, 세포사이결합의 분포양 상을 조사하였다. 이를 통해 동시박동 수의 변화와 세포사이결합과의 관계를 이해하고자 한다. 심장근육세포를 분리한 후, cardiogel이 처리 또는 처리되지 않은 배양용기에서 1, 3, 5, 7일 동안 배양하였다. 도립위상차현미경 하에서 세포들의 동시 박동 수를 측정하였고, 투과전자현미경과 함께 형태학적 변화들을 관찰하였다. Connexin43, pan-cadherin, alpha-sarcomeric actin을 간접면역형광 염색하였고, Western blotting으로는 connexin43과 pan-cadherin의 특정한 띠들을 확인하였다. Cardiogel 처리군 및 비처리군 모두에서 배양 3, 5, 7일에 동시박동 수는 유의한 차이를 보였고, 처리군의 5일에 최고 수치를 기록하였다. Cardiogel 처리군에서 비처리군에 비해 동시박동 수가 배양 5일과 7일에 유의하게 증가하였다. Cardiogel 처리군에서 비처리군에 비해 배양 5일에 심장근육세포들의 증식이 현저하였지만, 배양 7일에는 비처리군에서 상대적으로 많은 섬유모세포들이 나타났다. Connexin43, pan-cadherin 및 alpha-sarcomeric actin은 배양 1일의 세포들에 비해 3, 5, 7일에 정상적으로 재분포되었고, 동시박동 수에 따라 그 반응도 증감하였다. 배양 7일에 단층을 형성한 부분에 염색되지 않는 섬유모세포들이 증가하였다. 특정한 부위에서 connexin43과 pan-cadherin의 띠를 확인하였다. 배양 3, 5, 7일에 교통반점, 부착막, 부착반점이 많이 나타났다. 결론적으로 심장근육세포의 배양 3일과 5일에는 동시박동 수의 증가에 따라 connexin43과 pan-cadherin의 양도 증가하 였다. 배양 5일에는 동시박동 수치가 최고에 이르렀으나, 7일에는 섬유모세포의 증식으로 동시박동 수가 떨어졌다. 따라서 사이원반을 구성하는 미세구조적 소견들은 cardiogel 처리군과 비처리군 모두에서 동시박동 수와 connexin43과 pancadherin과의 관계를 해석하는데 도움이 되었다. This experiment was designed for the elucidation of relationships between the cell adhesion molecules and synchronous beating rates of cardiomyocytes isolated from ventricles of 3-day-old rats. These cells were grown on the culture vessel coated or non-coated with cardiogel for 1, 3, 5, and 7 days. The synchronous beating rate and morphologic changes of cells were investigated under the inverted microscope. Those changes of cardiomyocytes were observed by transmission elcectron microscopy (TEM). Connexin43, pan-cadherin, and alpha-sarcomeric actin were stained by indirect immunofluorescent (IF) technique. Western blotting were used for identifying unique bands of connexin43 and pan-cadherin in the regions of specific size. The synchronous beating numbers of cardiomyocytes in each group on the dish coated or non-coated with cardiogel were significantly different for 3, 5, and 7 days in culture. The maximum values of synchronized beating in the cells appeared on the day 5. The beating numbers of cells grown on coated dish comparing with non-coated dish were significantly increased on the day 5 and day 7. The proliferation of cardiomyocytes increased markedly in the cardiogel-coated dish on the day 5, while the number of fibroblasts in non-coated dish were obviously increased on the day 7. In indirect IF studies, a normal redistribution of connexin43, pan-cadherin, and alpha-sarcomeric actin of the cells was expressed in day 3 throughout day 5. The reaction intensity of those proteins were increased or decreased in the proportion to the beating numbers. The lack of reaction was appeared in the fibroblasts consisting of monolayer on the day 7. Unique bands of connexin43 and pan-cadherin having a specific size were marked on Western Blotting. The structures such as gap junction, fascia adherence and desmosome compatible with intercellular adhesion in cardiac muscle were abundant on day 3 to 7. In conclusion, the amount or reaction intensity of connexin43 and pan-cadherin in cardiomyocytes were stronger simultaneously with the increase of synchronous beating numbers, particularly for 3 and 5 days. The maximum beating rates of cardiomyocytes reached on the day 5, while the maximum beating rates of them were markedly decreased owing to the proliferation of fibroblasts on day 7. TEM findings consisting of intercalated discs might be explained regardless of coating with cardiogel on why the close relationships between the beating rates and the connexin43 and pan-cadherin of those cells in culture exist.