Detection of Mitotic Centromere-Associated Kinesin (MCAK) During Cell- Cycle Progression of Human Jurkat T Cells Using Polyclonal Antibody Raised Against Its N-Terminal Region Overexpressed in E. coli

( Do Youn Jun ),( Seok Woo Rue ),( Byung Woo Kim ),( Young Ho Kim ) 한국미생물생명공학회 2003 Journal of microbiology and biotechnology Vol.13 No.6

Poster Session 1 : Oral Presentation ; Cell Cycle and Cell Death : Differential intracellular Localization of mitotic centromere-associated kinesin (MCAK) during cell cycle progression in human Jurkat T cells

( Do Youn Jun ),( Seok Woo Rue ),( Hyun Ju Lee ),( Jung Chan Park ),( Young Ho Kim ) 생화학분자생물학회 2005 62회 KSBMB Annual Meeting in 2005 Vol.- No.-

Poster Session 1 : Differential intracellular Localization of mitotic centromere-associated kinesin (MCAK) during cell cycle progression in human Jurkat T cells

( Do Youn Jun ),( Seok Woo Rue ),( Hyun Ju Lee ),( Jung Chan Park ),( Young Ho Kim ) 생화학분자생물학회 2005 생화학분자생물학회 춘계학술발표논문집 Vol.2005 No.-

Differential Intracellular Localization of Mitotic Centromere-associated Kinesin (MCAK) During Cell Cycle Progression in Human Jurkat T Cells

전도연,류석우,김수정,김영호,Jun Do Youn,Rue Seok Woo,Kim Su-Jung,Kim Young Ho Korean Society of Life Science 2005 생명과학회지 Vol.15 No.2

인체 MCAK 단백질을 Escherichia. coli에서 재조합 단백질로 발현하였다. 이를 SDS-PAGE 후 electroelution으로 정제하고 항원으로 사용하여 rat에서 다클론성 항체생성을 유도한 결과, 생성된 항체는 Western blot analysis에 의해 인체 MCAK 단백질 (81 kDa)을 특이적으로 인식할 수 있었으며, Jurkat T cells과 293T cells에 있어서 MCAK 단백질의 대부분이 핵 내에 위치함을 확인할 수 있었다. 세포주기에 따른 MCAK 단백질의 발현양의 변화를 조사하기 위해, Jurkat T cells을 Hydroxy urea 또는 Nocodazole의 처리로 $G_{1}/S$ boundary 그리고 $G_{2}/M$ boundary에 blocking하고 이로부터 release 시키는 시간을 달리하여 다양한 세포주기상에 위치한 Jurkat T cells을 확보하였다. 각각의 Jurkat T cells로부터 cell lysate를 얻어서 Western blot analysis를 시도한 결과, MCAK 발현양은 S phase에서 가장 높았으며 MCAK의 SDS-PAGE상의 mobility가 81 kDa에서 84 kDa로 shift됨을 확인하였다. MCAK의 전기영동상의 mobility shift에 의한 slow moving $p84^{HsMCAK}$는 S phase 후반부터 나타나기 시작하며 $G_{2}/M$ phase에 최대였고 $G_{1}$, phase에서는 확인되지 않았다. 이는 세포주기에 따라 MCAK의 단백질의 인산화 양상이 달라짐을 시사한다. 생성된 항체를 이용한 Immunocytochemical analysis의 결과, 인체 MCAK 단백질은 세포주기의 interphase에서는 주로 중심체와 핵에 존재하며, M phase의 각 단계에 따라서 spindle pole, centromere, spindle fiber 또는 midbody에 존재함을 확인하였다. 이러한 연구 결과는 E. coli에서 발현된 재조합 HsMCAK 단백질을 항원으로 하여 rat에서 생산한 다클론성 항체가 HsMCAK 단백질을 특이적으로 인식할 수 있음과 또한 HsMCAK 단백질의 인산화를 나타내는 SDS-PAGE상의 mobility-shift가 $G_{2}/M$ phase에 최대에 도달하는 양상으로 세포주기에 따라 변동됨을 나타내며, HsMCAK의 인산화와 HsMCAK의 세포 내 위치간의 관련성을 시사한다. 아울러 이러한 연구결과는 hamster 및 Xenopus 등에서 주로 연구되고 있는 MCAK의 세포주기상의 주요기능이 인체세포에도 적용될 수 있음을 시사한다. Mitotic centromere-associated kinesin (MCAK), which is a member of the Kin I (internal motor domain) subfamily of kinesin-related proteins, is known to play a role in mitotic segregation of chromosome during M phase of the cell cycle. In the present study, we have produced a rat polyclonal antibody using human MCAK (HsMCAK) expressed in E. coli as the antigen. The antibody specifically recognized the HsMCAK protein (81 kDa), and could detect its nuclear localization in human Jurkat T cells and 293T cells by Western blot analysis. The specific stage of the cell cycle was obtained through blocking by either hydroxyl urea or nocodazole and subsequent releasing from each blocking for 2, 4, and 7 h. While the protein level of HsMCAK reached a maximum level in the S phase with slight decline in the $G_{2}-M$ phase, the electrophoretic mobility shift from $p81^{MCAK}\;to\;p84^{MCAK}$ began to be induced in the late S phase and reached a maximum level in the $G_{2}/M $ phase, and then it disappeared as the cells enter into the $G_{1}$ phase. Immunocytochemical analysis revealed that HsMCAK protein localized to centrosome and nucleus at the interphase, whereas it appeared to localize to the spindle pole, centromere of the condensed mitotic DNA, spindle fiber, or midbody, depending on the specific stage of the M phase. These results demonstrate that a rat polyclonal antibody raised against recombinant HsMCAK expressed in E. coli specifically detects human MCAK, and indicate that the electrophoretic mobility shift from $p81^{MCAK}\;to\;p84^{MCAK}$, which may be associated with its differential intracellular localization during the cell cycle, fluctuates with a maximum level of the shift at the $G_{2}-M$ phase.

A Natural L-Arginine Analog, L-Canavanine-Induced Apoptosis is Suppressedby Protein Tyrosine Kinase p56<SUP>lck</SUP> in Human Acute Leukemia Jurkat T Cells

Hae Sun Park(박해선),Do Youn Jun(전도연),Hyun Ju Woo(우현주),Seok Woo Rue(류석우),Sang Kook Kim(김경민),Kyung Min Kim(김상국),Wan Park(박완),Byung Jo Moon(문병조),Young Ho Kim(김영호) 한국생명과학회 2009 생명과학회지 Vol.19 No.11

L-arginine 구조유사체인 L-canavanine의 인체 급성백혈병 Jurkat T 세포에 대한 apoptosis 유도활성이 단백질 티로신키나아제 p56<SUP>lck</SUP>에 어떻게 조절되는지를 규명하기 위해 p56<SUP>lck</SUP>를 발현하는 Jurkat T 세포주 E6.1과 p56<SUP>lck</SUP>-결손 Jurkat T 세포주 JCaM1.6에 있어서 L-canavanine의 세포독성, L-canavanine에 의해 유도되는 apoptotic DNA fragmentation 및 apoptotic sub-G1 peak를 비교하여 본 바, p56<SUP>lck</SUP>-negative JCaM1.6 세포가 p56<SUP>lck</SUP>-positive E6.1 세포에 비해 L-canavanine의 apoptotis 유도활성에 훨씬 더 민감한 것으로 나타났다. 이러한 p56lck-negative JCaM1.6 세포의 민감성은 JCaM1.6 세포에 p56<SUP>lck</SUP> 유전자를 transfection시켜 발현시키면 현저히 감소되었다. L-Canavanine에 의해 유도되는 apoptosis관련 현상들을 p56<SUP>lck</SUP>-stable transfectant인 JCaM1.6/lck 세포와 empty vector-transfectant 인 p56<SUP>lck</SUP>-negaive JCaM1.6/vector 세포에서 Western blot analysis로 비교한 결과, L-canavanine에 의해 유도되는 mitochondrial membrane potential (Δψm)의 감소, caspase-9, -8, -7 및 -3의 활성화, 그리고 PARP 및 PLCγ-1의 분해가 JCaM1.6/vector 세포에 비해 JCaM1.6/lck 세포에서 더 약하게 나타났다. JCaM1.6/lck 세포를 2.5 mM L-canavanine으로 처리한 다음 세포 내 p56<SUP>lck</SUP> kinase 활성의 변화를 α-casein을 기질로 하여 시간 별로 측정한 결과, L-canavanine의 처리 후 15분만에 p56<SUP>lck</SUP> kinase의 활성이 약 1.6배 증가되었으며 이후 6시간 동안은 약 1.3~1.4 배정도 증가된 수준으로 kinase 활성이 유지되는 것으로 확인되었다. L-Canavanine에 의한 apoptosis의 개시에 Fas/FasL 상호작용이 관련되는지를 규명하기 위해 FADD-negative Jurkat T 세포주 I2.1, caspase-8-negative Jurkat T 세포주 I9.2 및 wild-type Jurkat T 세포주 A3에 대한 L-canavanine의 세포독성을 비교한 결과, A3와 I2.1 세포의 경우는 L-canavanine의 세포독성이 동일하게 나타났고, 특히 caspase-8가 결손된 I9.2 세포의 경우는 L-canavanine의 세포독성에 대한 민감성이 A3와 I2.1 세포에 비해 단지 미약하게만 완화되는 것으로 나타나, L-canavanine의한 apoptosis에는 Fas/FasL 상호작용이 관련되어 있지 않으며, 또한 caspase-8의 역할이 필수적이지 않음을 시사하였다. Jurkat T 세포에 있어서 L-canavanie에 의해 유도되는 sub-G1 peak 및 caspases 활성화에 미치는 pan-caspase inhibitor (z-VAD-fmk), caspase-9 inhibitor (z-LEHD-fmk), caspase-3 inhibitor (z-DEVD-fmk), caspase-4 inhibitor (z-LEVD-fmk) 및 caspase-12 inhibitor (z-ATAD-fmk)의 영향을 조사한 결과, L-canavanie에 의한 apoptosis는 Δψm의 감소, caspase-9 및 caspase -3의 활성화에 뒤따른 caspase-8 및 caspase-7의 활성화, 그리고 PARP의 분해의 순서로 유도되는 것으로 나타났으며, 아울러 caspase-9의 활성화와 함께 caspase-12의 활성화가 L-canavanine 처리에 따른 caspase-3의 활성화에 요구되는 것으로 확인되었다. 결론적으로, L-canavanine 처리에 의한 Jurkat T 세포의 apoptosis는 Δψm 감소, caspase-9, caspase-3 및 caspase-7의 활성화에 의해 유도되며, 이들 apoptosis 현상들은 p56<SUP>lck</SUP>에 의해 negative regulation되었다. To elucidate further the antitumor effects of a natural L-arginine analogue, L-canavanine, the mechanism underlying apoptogenic activity of L-canavanine and its modulation by protein tyrosine kinase p56<SUP>lck</SUP> was investigated in human Jurkat T cells. When the cells were treated with 1.25 to 2.5 mM L-canavanine for 36 h, several apoptotic events including mitochondrial membrane potential (Δψm) loss, activation of caspase-9, -3, -8, and -7, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) degradation, and DNA fragmentation were induced without alteration in the levels of Fas or FasL. These apoptotic changes were more significant in p56<SUP>lck</SUP>-deficient Jurkat clone JCaM1.6 than in p56<SUP>lck</SUP>-positive Jurkat clone E6.1. The L-canavanine-induced apoptosis observed in p56<SUP>lck</SUP>-deficient JCaM1.6 cells was significantly reduced by introducing p56<SUP>lck</SUP> gene into JCaM1.6 cells by stable transfection. Treatment of JCaM1.6/lck cells with L-canavanine caused a transient 1.6-fold increase in the kinase activity of p56<SUP>lck</SUP>. Both FADD-positive wild-type Jurkat T cell clone A3 and FADD-deficient Jurkat T cell clone I2.1 exhibited a similar susceptibility to the cytotoxicity of L-canavanine, excluding involvement of Fas/FasL system in triggering L-canavanine-induced apoptosis. The L-canavanine-induced apoptotic sub-G1 peak and activation of caspase-3, -8, and -7 were abrogated by pan-caspase inhibitor (z-VADfmk), whereas L-canavanine-induced activation of caspase-9 was not affected. These results demonstrated that L-canavanine caused apoptosis of Jurkat T cells via the loss of Δψm, and the activation of caspase-9, -3, -8, and -7, leading to PARP degradation, and that the p56<SUP>lck</SUP> kinase attenuated the Δψm loss and activation of caspases, and thus contributed as a negative regulator to L-canavanine-induced apoptosis.