양막 및 제대에서 유래된 줄기세포로부터 간세포로의 분화

이윤정 연세대학교 대학원 2008 국내박사

성체줄기세포 중 골수에서 분리된 중간엽 줄기세포는 조혈작용을 지지하고 연골, 뼈, 지방조직 등의 다양한 조직으로 분화될 수 있어 세포 기초 치료와 조직 생성 촉진의 중요한 세포원으로 인식되어져왔다. 최근에는 골수 이외에도 다른 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있다는 것이 보고되고 있다. 양막이나 제대는 분만 시 쉽게 채취할 수 있고 배아줄기세포에서만 발현되는 여러 유전자가 발현될 뿐 아니라 골수보다 분화력이 뛰어나며 냉동보관이 가능하고 비교적 쉽게 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있는 장점이 있다. 본 연구에서는 양막 및 제대 조직에서 분리, 배양한 줄기세포의 특성을 조사하고 간세포 분화 유도 배양조건을 확립하여 양막 유래 줄기세포(human amnion-derived stem cells, HAM)와 제대 유래 줄기세포(human umbilical cord-derived stem cells, HUC)의 간세포로의 분화가능성을 비교하였다.연구에 사용된 양막 및 제대는 산모의 동의아래 만삭 정상 산모로부터 제왕절개 또는 질식 분만 후 채취하여 실험에 사용하였다. 양막과 제대에서 줄기세포를 분리, 배양 후 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR), 세포면역화학 분석 및 중배엽성 세포로의 분화능 실험을 시행하였다. 또한 양막과 제대에서 유래한 줄기세포를 간세포로 분화 유도 후 간세포 특이 유전자 발현, 알부민 분비 측정, 요소 합성 측정, 인간 알부민에 대한 면역블로팅과 세포면역화학염색법 그리고 PAS 염색을 시행하였다.1. 양막유래 줄기세포와 제대유래 줄기세포에서 Oct-4, SCF, FGF-5, NCAM, nestin, vimentin, CK18, GATA-4, BMP-4, HNF-4α, HLA ABC, HLA DR의 유전자가 발현되는 것을 RT -PCR 방법으로 확인하였다. 간세포로의 분화유도 전에 제대유래 줄기세포는 CK18, BMP-4, HNF-4α, CYP3A4, α1-AT, HNF-1α, PEPCK, CX32 그리고 transferrin 유전자가 발현되었고 양막유래 줄기세포는 CK18, BMP-4, HNF-4α, CYP3A4 그리고 α1-AT 유전자가 발현되었다.2. 세포 면역화학적 분석 결과 양막유래 줄기세포는 collagen I, II, III, IV, XII, fibronectin, CD44, CD54, α-SMA, vimentin, desmin, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 그리고 HLA ABC 단백질이 발현되었다. 제대유래 줄기세포는 는 collagen I, II, III, IV, XII, fibronectin, CD44, CD54, α-SMA, vimentin, desmin, SSEA-3, SSEA-4, vWF 그리고 HLA ABC의 단백질이 발현되었다.3. 양막 및 제대유래 줄기세포로부터 지방세포, 골아세포, 연골세포로 분화되는 것을 관찰함으로서 줄기세포로서의 조직 다분화능을 확인하였다.4. 간세포로의 분화 유도 시 알부민 합성 분비와 요소 합성의 농도가 제대유래 줄기세포에서 양막유래 줄기세포보다 높게 측정되었다. 제대유래 줄기세포는 분화 배양조건 중에서 DM4 배양액에서 간세포로 가장 잘 분화하였다.5. SDS-전기영동, 면역 블로팅 결과 간 분화 유도 전 제대유래 줄기세포에서는 알부민이 분비되지 않았으나, 분화 유도한 세포에서는 알부민이 분비되었다.6. 세포면역화학염색 방법을 이용하여 간세포로 분화한 제대유래 줄기세포내에 인간 알부민이 존재함을 직접 검증하였다.7. PAS 염색을 하여 분화 유도 전 제대유래 줄기세포에서는 글리코겐의 축적이 관찰되지 않았으며, DM4에서 분화를 유도한 세포는 글리코겐이 축적되는 것을 관찰 할 수 있었다.이상의 결과로부터 본 연구에서는 제대나 양막에서 얻은 줄기세포로부터 간세포로의 분화를 유도하였으며, 두 줄기세포 중 제대에서 얻은 줄기세포가 양막에서 얻은 줄기세포보다 간세포로의 분화 유도가 더 잘됨을 확인하였다. 또한 여러 분화 배양조건으로 간세포 분화를 유도하였을 때 간세포로의 분화 유도가 가장 잘되는 배양조건도 제시할 수 있었다.결론적으로 줄기세포로부터 분화유도 된 간세포를 골수 유래 중간엽 줄기세포가 아닌 제대나 양막으로부터 얻을 수 있게 됨으로서 본 연구가 향 후 간 질환 환자에게 줄기세포 치료에 도움이되고, 제대나 양막 등으로 줄기세포원을 확대함으로서 간세포 획득 방법에 좋은 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다. Among adult stem cells, mesenchymal stem cells isolated from bone marrow have been considered an attractive means of cell‐based treatment and tissue formation because they support hematopoiesis and can be differentiated into various tissues including cartilage, bone and fat tissue. Recently it has been found that mesenchymal stem cells can be isolated from tissues other than bone marrow. Amnion and umbilical cord are easily obtainable and they express various genes known to be expressed only in embryonic stem cells. In addition, they show higher differentiation ability than bone marrow and can be stored frozen conveniently, and it is relatively easy to isolate mesenchymal stem cells from them. The present study investigated the characteristics of stem cells isolated from the tissues of amnion and umbilical cord and cultured, established culture conditions for inducing their differentiation into hepatocyte-like cells(HLC), and compared the possibility of the differentiation of stem cells derived from human amnion and umbilical cord into HLC. Amnions and umbilical cords used in the research were collected from Caesarean section or vaginal delivery of normal term women under their consent, and were used in the experiment. After stem cells were isolated from the amnions and umbilical cords and cultured, we performed RT‐PCR, immunocytochemical analysis, and experiment on differentiation into mesodermal cells. After inducing the differentiation of human amnion-derived stem cells (HAM) and human umbilical cord-derived stem cells (HUC) into HLC, we examined the expression of hepatocyte specific genes, measured albumin secretion and urea synthesis, and conducted immunoblotting, immunocytochemical staining and PAS staining.1. According to the results of RT‐PCR, HAM and HUC were found to express genes such as Oct‐4, SCF, FGF‐5, NCAM, nestin, vimentin, CK18, GATA‐4, BMP‐4, HNF‐4α, HLA ABC and HLA DR. In HUC before induction of differentiation into HLC were expressed CK18, BMP‐4, HNF‐4α, CYP3A4, α1‐AT, HNF‐1α, PEPCK, CX32 and transferrin gene, and in HAM were expressed CK18, BMP‐4, HNF‐4α, CYP3A4 and α1‐AT gene.2. According to the results of immunocytochemical analysis, in HAM were expressed collagen I, II, III, IV, XII, fibronectin, CD44, CD54, α‐SMA, vimentin, desmin, SSEA‐3, SSEA‐4, TRA‐1‐60 and HLA ABC protein. In HUC were expressed collagen I, II, III, IV, XII, fibronectin, CD44, CD54, α‐SMA, vimentin, desmin, SSEA‐3, SSEA‐4, vWF and HLA ABC protein.3. It was observed that HAM and HUC differentiated into adipocytes, osteoblasts and chondrocytes.4. In differentiation into HLC, HUC showed higher secretion of albumin protein synthetic and higher concentration of urea synthetic than HAM. HUC differentiated into HLC most efficiently in DM4 medium among differentiation culture conditions.5. According to the result of SDS‐electrophoresis and immunoblotting, HUC before the induction of differentiation into HLC did not secrete albumin but those after the induction of differentiation secreted albumin.6. Using immunocytochemical staining, we proved that human albumin exists in cells differentiated into HLC.7. Through PAS staining, we observed that glycogen was not accumulated in HUC before the induction of differentiation but it was accumulated in cells after the induction of differentiation in DM4.Through the results of this study presented above, HUC are more likely to differentiate into HLC than HAM. In addition, we induced differentiation into HLC under several differentiation culture conditions in order to find the culture condition most efficient for inducing HUC to differentiate into HLC. Further research is required to establish the optimal condition for differentiating HAM and HUC into HLC, and such a study is considered to contribute to stem cell treatment and improve the effect of HLC transplantation for liver disease patients.

신경줄기세포의 분리 및 배양과 냉동보존

권광원 아주대학교 대학원 2005 국내석사

Nestin은 classⅥ 중간형 세사(intermadiate filament)로서 신경 줄기 세포의 특이적인 표지인자로 알려져 있으며, 4개의 exon과 3개의 intron의 유전자로 구성되어 있다. Nestin 유전자의 잘 보존된 두 번째 intron인 3’ 방향의 637 bp는 신경 발생 과정 중 nestin의 발현을 조절하기에 충분하다고 알려져 있다. 본 연구에서는 신경줄기세포의 특이적인 표지자인 nestin이 rat 2nd intron에 의해 조절 받는 nestin과 GFP(green fluorescence protein)가 동시에 발현되는 형질 도입된 마우스로부터 신경줄기세포를 분리하여 배양하였다. 이렇게 배양된 세포는 신경줄기세포의 특징인 신경구(neurosphere)를 형성하였으며, GFP를 발현하고 있었다. 배양된 신경구는 단일세포로 분리하여, 유세포 분석기를 통해 GFP(+)와 GFP(-)세포로 분리하여 배양하였을 때, 세포는 각각 2차 신경구를 형성하였다. GFP(+)와 GFP(-) 신경구를 각각 분화 조건에서 배양하였을 때, GFP(+) 신경구의 경우 신경세포(neuron)와 신경아교세포(astrocyte), 그리고 희돌기교세포(oligodendrocyte)로 분화 되었지만, GFP(-) 신경구의 경우는 희돌기교세포(oligodendrocyte)로 분화되는 능력이 저해 되어 있었다. Fibronectin이 코팅된 조건에서 배양된 신경줄기세포는 신경구를 형성하는 비율이 감소되며, 평평한 모양으로 자랐으며, GFP(+)세포는 그 수가 증가되고 있음을 확인하였다. 사람으로부터 얻어진 신경줄기세포를 배양하기 위해 임신 10~15주의 중절된 사람 태아의 대뇌조직에서 신경줄기세포를 얻어 배양하였다. 배양된 세포는 신경구를 형성하였으며, 면역형광염색 결과 nestin을 발현하고 있었고, 분화시켰을 때, 신경세포와 신경아교세포로 분화되었다. 사람 대뇌의 조직이나 신경구를 냉동보관 후 녹였을 때, 신경줄기세포의 성격을 그대로 유지하는지 알아보고자 잘게 조각낸 태아의 대뇌조직과 배양된 신경구를 냉동 보관하였다. 냉동보관된 조직과 신경구를 신속히 해동하여 배양하였고, 해동된 조직과 신경구 모두에서 배양 7일째에 다시 신경구를 형성하였다. 면역형광염색을 통해 확인한 결과 nestin을 발현하고 있었고, 분화 조건으로 배양하였을 때, 신경세포(neuron), 신경아교세포(astrocyte)로 분화됨을 확인하였다. Nestin is a member of the class Ⅵ intermediated filament proteins and a well-known stem cell marker in the neural lineage. The nestin gene consists of four exons and three introns. It has been known that the nestin transgene containing the second intron is sufficient to direct tissue specific expression of the nestin gene in developing embryos. In this study, we investigated whether the second intron of the rat nestin gene is sufficient to confer tissue-specific expression of the gene in neural stem cells in vitro and in vivo system. To study the specificity of the second intron of the nestin gene, eGFP expression was determined in transgenic mice carrying the nestin 2nd intron-eGFP transgene. eGFP expression was high in developing embryos but not in the adult mice. Neural stem cell were isolated from the forebrain of E12.5 transgenic mice and sorted by FACS based on GFP expression. Both GFP (+) and (-) cells could generate neurospheres but the differentiation potential into oligodendrocyte was reduced in eGFP(-) neurospheres. To determine differentiation ability neurosphere from single cell, we selected by clonal selection and cultured for 10 day. Single cell was formed neurosphere and expressed GFP or not. Neural stem cells (NSCs) derived from fetal and adult central nervous system has been expanded, differentiated, and fount to be multipotent and self-renewing. In this study, we investigated whether the NSCs from cryopreserved fetal brain tissue or cultured neurospheres maintain the differentiation potential compared with fresh(not frozen) tissue derived NSCs. Neural stem cell was prepared from gestation 10 to 15 weeks human fetal brain. Cultured neural stem cell was expressed nestin, a well-known stem cell marker in the neural lineage and positive neuronal marker(β-tubulin-III) and glial marker(Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP) after differentiation. To compared with not frozen and frozen tissue or neurospheres, tissue or neurosphere was cryopreserved in liquid nitrogen for 2 weeks. The cell derived from frozen tissue or neurospheres was expressed nestin and neuronal marker(β-tubulin-III) and glial marker(Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP) differentiation markers after differentiation. The results indicated that cryopreserved fetal brain tissue or neurospheres maintains NSCs fate, so tissue and neurospheres could store in liquid nitrogen. The Cryopreservation of tissue or neurosphere, expand the chances for use of the NSCs could therapeutic approach.

Realtime MRI detection of systemically injected iron-labeled mesenchymal stem cells in the infarcted rat myocardium

홍범기 Graduate School, Yonsei University 2006 국내박사

성체줄기세포를 이용한 세포 치료는 생체 내 이식의 양상이나 이식된 세포의 운명을 추적하기 어렵다는 제한을 갖고 있다. 최근 전신적으로 투여된 간엽줄기세포가 골수로 귀소하는 능력이 있음이 알려졌다. 줄기세포와 전구세포가 손상된 심근으로 귀소하는 사실은 심혈관 질환에 있어서 세포 치료에 대한 비침습적 접근을 가능하게 할 수 있는 하나의 중요한 기전이 된다. 초기에는 세포 조영 물질이 T 임파구의 이동을 추적하는데 사용되었으며, 그 후 신경학적인 응용으로 줄기세포를 추적하는데 이용되고 있다. 줄기세포의 이동이 설치류의 정상, 혹은 손상 받은 뇌조직에서 확인되고, gadolinium 조영제를 이용하여 이들을 추적하게 되었다. 최근에는, 철입자를 줄기세포나 전구세포의 표지자로 이용하는 방법이 개발되었는데, 이들은 이 세포들의 분화나 증식에 영향을 주지 않으며, 심근에 직접 주입한 후 세포의 이식을 추적하는데 유용한 방법임이 알려지게 되었다.$$a$$a본 연구에서는, 철-형광입자로 표식된 간엽줄기세포를 심근 경색이 있는 쥐에게 전신적으로 주입한 후 이들을 자기공명영상을 이용한 비침습적 방법을 통해 생체 상태에서 추적할 수 있는지 알아보고, 이 세포들이 심근세포 특이 단백질을 발현하는지, 그리고 궁극적으로 손상된 심근의 기능적인 호전에 기여하는지 알아보고자 하였다.$$a$$aAugust Copehagen Irish(ACI) 쥐의 좌관상동맥을 결찰하여 심근경색을 유발하고 다시 재관류시킨 후, 정맥 내로 동종의 철-형광입자로 표식된 간엽줄기세포를 주입하거나(n=9), 혹은 단순히 철-형광입자만을 주입하고(n=9), 심장 자기공명영상 검사를 주입 후 5일, 6주, 3개월, 그리고 6개월째 시행하였다. 철-형광입자로 표식된 줄기세포는 심근세포의 표지 단백질인 desmin과 connexin-43를 이용한 면역조직화학 염색을 통해 동일초점 현미경으로 확인 하였다. 심장 조직에서 경색부와 비경색부에서 총 세포수를 확인하고, 이를 다시 철-형광입자로 표식된 세포의 수와 비교하였다.$$a$$a철-형광입자로 표식된 간엽줄기세포는 경색 심근부위에서 주입 후 5일째부터 6개월째까지 확인이 되었는데 6주째 최고치를 보였다. 이 세포들은 특히 심근 손상이 있는 부위에 선택적으로 귀소하는 양상을 보여, 경색 심근부위와 정상 심근부위에서 총 세포수에 대한 철-형광입자로 표식된 세포의 비율이 의미있게 높았다(0.62 vs. 0.16, p<0.01). 6주째 이식된 세포는 근육원섬유 단백(desmin)과 간근결합 단백(con- nexin-43)을 발현하기 시작하였으며 3개월째 구조적 형태가 성숙되는 양상을 보였다. 좌심구혈률은, 비록 통계적인 의의는 보이지 않았지만, 간엽줄기세포를 주입하지 않은 군에 비해 세포를 주입한 군에서 더 호전되는 경향을 보였다.$$a$$a이 연구를 통해 자기공명영상을 이용한 방법은 동종의 간엽줄기세포 이식의 귀소와 선택적인 이식 양상을 추적하는데 매우 유용하며, 이를 통해 이식된 줄기세포의 생체내 분화 과정을 추적할 수 있을 것으로 사료된다.$$a$$a Cell therapy using adult pluripotent stem cells is limited by the inability to track in vivo engraftment and the fate of transplanted cells. Recent evidence has demonstrated the homing ability of mesenchymal stem cells to bone marrow following systemic infusion. Homing of stem and progenitor cells to myocardial injury is one potential mechanism that may permit a non-invasive approach to cardiovascular cell therapy. Cellular based contrast agents were initially used to monitor T cell trafficking in inflammation and, more recently, have been used to track stem cells for neurological applications. Stem cell migration has been demonstrated in healthy and damaged brain tissue of rodents and tracked using gadolinium based agents. Recent evidence has demonstrated the feasibility of iron labeling of stem and progenitor cells without affecting differentiation and proliferation and for monitoring cell engraftment following direct myocardial injection.$$a$$aIn an attempt to assess the homing of systemically injected mesenchymal stem cells to infarcted myocardium, this study was initiated with a series of experiments aimed at tracking of these cells which had been labeled with iron oxide microparticles, followed by assessing whether these cells can express cardiomyocyte-specific proteins and contribute the functional competence.$$a$$aMyocardial infarction was induced in sixteen August Copenhagen Irish(ACI) rats by surgical occlusion of the left coronary artery followed by reperfusion and intravenous administration of either allogeneic iron-fluorescence-particle(IFP)-labeled mesenchymal stem cells derived from ACI rats(n=9) or free IFP(n=9). Serial cardiac MRI exams were performed at fifth day, sixth week, third month, and sixth month. The presence of IFP-labeled stem cells was confirmed using confocal microscopy and immunohisto- chemistry for desmin and connexin-43, the markers of cardiomyogenic differentiation. The total number of cells was counted in both infarcted and non-infarcted tissue and compared to the total number of engrafted IFP-labeled cells.$$a$$aIFP-labeled MSCs were detected from as early as 5 days after injection up to 6 months in infarcted region(the peak at sixth week). IFP-labeled MSCs preferentially home to the site of myocardial injury, with a significantly higher labeled-cell to total cell ratio within the infarct zone compared to normal myocardium(0.62 vs 0.16, p< 0.001). At sixth week the engrafted MSCs expressed sarcomeric and gap junction proteins(desmin and connexin-43), which exhibited the maturation of their structural patterns at third month. In left ventricular ejection fraction, even though there was no statisti- cal significance, there was a trend for the MSCs-treated animals to exhibit greater reco- very of systolic function than that of the control.$$a$$aThis study demonstrates the feasibility of using MRI to track the homing and prefer- ential engraftment of allogeneic mesenchymal stem cells as they traffic to the sites of tissue injury and seem to differentiate into cells with cardiomyocyte phenotype.$$a$$a

전단응력 자극 배양 기반 세포외소포체 치료제 생산 공정 기술 개발

조수민 인천대학교 대학원 2023 국내석사

줄기세포는 질병으로 인해 손상되거나 퇴화된 조직을 재생할 수 있다. 이러한 특징으로 현재 불치/난치질환 극복을 위해 치료제로 다양하게 임상 적용되면서 성공적인 치료 사례들이 다수 보고되고 있다. 하지만 살아있는 줄기세포는 생체 이식 시 낮은 생착률과 생존률, 종양형성 등 다양한 문제가 있다. 최근에 줄기세포에서 분비하는 세포외소포체가(extracellular vesicle, EV) 줄기세포의 주요 치료 효능 기전 중 하나이며 세포 치료제와 유사하거나 더 좋은 치료 효과를 지닌다는 연구 결과들이 발표되었다. 또한 EV는 cell-free therapy로 낮은 면역반응을 보이며, 종양생성, 비이상적인 분화 등 살아있는 줄기세포를 이식해 발생하는 문제점들을 해결할 수 있다는 이점이 있다. EV 치료제는 새로운 치료 패러다임으로 대두되고 있으며 치료제 개발을 위한 임상연구가 활발히 진행중이다. 현재 대부분의 EV 생산공정은 2차원 배양 플레이트에서 배양한 세포의 배양액으로부터 EV를 분리하는 방법이 주가 되고 있으나, 2차원으로 자란 세포에서 분비된 EV는 낮은 생산 효율과 EV 함유 치료인자가 불균일해 EV 치료제 배치마다 치료 효능이 다르다는 문제가 있다. 때문에 치료제로서 상용화되기 위해서는 EV 생산 효율을 높이기 위한 EV 분비능 증폭 기술과 특정 질환을 타켓하는 EV 치료제의 함유 약학 조성물의 조절 기술, 대량생산 공정 기술 개발 및 확립이 필수적으로 요구된다. 이를 해결하기 위해 세포의 유전자 조작 또는 생화학적 배양환경 조절 기법을 통해서 EV 분비능을 강화하고 함유 치료인자를 조절하려는 시도가 많이 이루어지고 있다. 하지만 이러한 방법들은 parental cell의 분화를 유도할 수 있다. 또한 유전자 조작 시 유전자 치료제로 분류되어 엄격한 심사기준이 적용되고 임상 적용이 더욱 어려워질 수 있다. 현재 임상의 가능성을 우선적으로 고려하기 위해서는 국제 세포치료학회(International Society for Cell & Gene Therapy, ISCT)에서 기수립된 parental cell의 줄기세포능을 유지하고 비가역적 분화를 일으키지 않는 생산 공정에 따라 EV의 자연분비를 증폭시키는 방법이 효율적이라고 판단된다. 본 연구에서는 중간엽 줄기세포의 전단응력 자극 배양을 통해 EV 자연 발생을 유도할 수 있는 microchannel 세포 배양 시스템을 개발하여 임상적용이 가능한 EV 대량생산 공정을 확립할 것이다. 또한 전단응력조건에서 줄기세포의 미분화능을 유지하면서 치료인자 분비 potential만을 자극하여 EV 함유 치료인자를 조절할 수 있는 전단응력 자극 기반 배양장치를 개발하고 제작할 것이다. Stem cells can be used to regenerate or repair damaged tissue. Stem cells have been clinically applied as a treatment for overcoming incurable and refractory diseases, and many successful treatment cases have been reported. However, stem cell therapies have several problems, such as tumor formation, low engraftment rate, and short-term survival rate after transplantation. Recently, stem cell derived extracellular vesicles (EVs), one of the main therapeutic mechanisms of stem cells, are emerging as an alternative therapeutic approach for tissue repair and regeneration. The EV therapy as alternative to cell therapy, have advantages such as lower immunogenicity, the ability to cross brain blood barrier (BBB) and higher safety profile. Especially, mesenchymal stem cells (MSCs) derived EV can mimic the therapeutic effects of MSCs including activation of immune effector cells, angiogenesis and differentiation potential. For these reasons, several preclinical studies of MSC derived EV are in progress. However, for clinical application of EV therapy, bioengineering refinement of clinical and commercial limitations such as standardization of production and design is required. Specifically, there are major challenges; low yield of production, standardized potency and EV generation. Engineering approaches including genetic and chemistry modification were introduced to stimulate EV production and enhance EV yield. However, these approaches might lead to differentiation of parental cells. Differentiation of parental cells requires more complex and strict clinical criteria. For clinical application, it is efficient to maintain the undifferentiation of parental cells criterial established by the International Society for Cell & Gene Therapy (ISCT) and to enhance the natural secretion of EVs. Therefore, we developed a micro-fluidic device that can induce natural secretion of EV through stem cell shear stress stimulation. In addition, we manufactured a clinical scale of EV that can control cargo molecule while maintaining the undifferentiation of stem cells under the shear stress condition.

Introduction of integrin-linked kinase gene into mesenchymal stem cells for prevention of anoikis in infarcted myocardium

송석원 Graduate School, Yonsei University 2008 국내박사

Mesenchymal stem cells (MSCs) represent a suitable source of autologous cells in cell therapy for the improvement of cardiac function, but MSCs therapy has limitations due to the poor viability of MSCs after cell transplantation. Integrin-mediated adhesion is a prerequisite for cell survival, and also a key factor for the differentiation of MSCs. As a novel anti-death strategy to improve cell survival in the infarcted heart, MSCs were genetically modified to over-express integrin-linked kinase (ILK). The survival rate of ILK-transfected MSCs (ILK-MSCs) was augmented by about 1.5-fold. In addition, the phosphorylation of ERK1/2 and Akt in ILK-MSCs were increased by about 3- and 2-fold, respectively. Furthermore, ILK-MSCs resulted in increase of 2-fold in ratio of Bcl-2/Bax and inhibited caspase-3 activation, compared with hypoxic MSCs. Adhesion rate of ILK-MSCs also had a 30.0% increase on the cardiac fibroblast-derived 3D matrix. Moreover, ILK-MSCs showed higher retention by about 4-fold than MSCs in infarcted myocardium. In vivo, ILK-MSC transplanted rats had a 12.0% smaller infarct size than MSC-treated animals after ligation of left anterior descending coronary artery. Transplantation of ILK-MSCs not only led to a 15.5% decrease in the fibrotic heart area, but also significantly reduced the apoptotic positive index by about 17.0% compared with ligation only. The mean microvessel count per filed in the infarcted myocardium of ILK-MSCs group (129.1±23.5) was increased relative to sham group (19.3±15.2) and MSCs group (68.9±19.4). In conclusion, ILK-MSCs further assisted cell survival, proliferation and adhesion, and improved myocardial damage compared to MSC only after transplantation. 간엽줄기세포는 심장기능을 향상시키기 위한 세포치료에서 자가이식이 가능한 세포로 알려져 있으나, 이식 후 생존률이 낮다는 문제점이 있다. Integrin에 의해 매개되는 생착은 세포 생존의 선행요건 일 뿐 아니라, 간엽줄기세포 분화의 중요한 요소로 알려져있다. 본 연구에서는 심근경색을 유발한 심장에 이식된 줄기세포의 생존을 향상시키기 위한 새로운 방법으로 세포이식 후 생착능을 향상시키기 위해 integrin-linked kinase (ILK) 유전자를 과발현시켰다. ILK가 함유된 간엽줄기세포는 대조군에 비해 생존률은 약 1.5배, ERK1/2와 Akt 의 인산화반응은 각각 약 3배 및 2배 증가하였다. 또한, ILK가 함유된 간엽줄기세포에서는 저산소 실험군과 비교하여 Bcl-2/Bax의 비가 2배 증가하였으며, caspase-3 활성이 억제되었다. ILK가 함유된 간엽줄기세포는 심장의 섬유아세포로 만든 3-D matrix와의 생착능도 약 30.0% 증가하였으며, 간엽줄기세포 만을 이식한 심근과 비교하여 4배 더 세포 유지를 시킬 수 있었다. 생체실험에서, ILK가 함유된 간엽줄기세포가 이식된 동물에서 좌전하행지 동맥 결찰 후 간엽줄기세포만을 이식한 경우와 비교했을 때 심근경색 범위가 12.0% 감소하였다. ILK가 함유된 간엽줄기세포를 이식한 경우 섬유화의 정도는 15.5% 감소하였을 뿐만 아니라, 세포사멸 비율 지표도 17.0% 정도 감소하였다. 그리고, 단위구획에서의 미세혈관 밀도는 ILK가 함유된 간엽줄기세포 (129.1±23.5)에서 대조군(19.3±15.2)과 간엽줄기세포 (68.9± 19.4)와 비교하여 상승하였다. 결론적으로, 간엽줄기세포만 이식한 경우에 비해 ILK가 함유된 간엽줄기세포에서는 세포 생존과 증식 및 부착능에 향상하여 심근손상을 개선시켰다.

치의학 분야의 줄기세포 연구와 임상적 동향

김현옥 전남대학교 2017 국내석사

연구배경 및 연구목적 : 지난 수십년 사이에 임플란트가 치의학 영역에서 새로운 분야로 급부상 하면서, 치조골의 재형성의 수요가 증가하였다. 또한 구강악안면외과 영역에서는 암 또는 사고로 인한 수술 후 재건의 목적으로 본래의 안모를 회복하기 위해 연조직과 골조직의 회복을 연구하였다. 그와 동시에 의학 분야에서는 줄기세포 연구가 화두가 되었고, 관련 연구 결과가 나올 때마다 학계 안팎의 이목을 집중시키고 있다. 치의학 분야에서 줄기세포 연구는 어디까지 진행되었고, 어느 정도 응용 가능성이 있으며 나아갈 방향은 어떠한지 알아보고자 한다. 연구방법 : 줄기세포의 초기 논문부터 최신 논문에 이르기까지 폭넓게 검색하여 그간의 과정과 현재 연구 수준과 결과를 알아보고자 한다. 현재 임상에서 이용되고 있는 재생 치료에 대해 알아보고, 줄기세포의 필요성과 적합한 줄기세포의 특징에 대하여 논의하고자 한다. 관련된 전임상 연구와 최근 주목받고 있는 면역 조절 요법에 대하여 알아보겠다. 결론 : 현재 치의학에서의 줄기세포 연구는 조직 공학에 기초한 방법과 체어사이드에서 시행 가능한 세포성분을 포함한 조직의 이식 방법에 초점이 맞추어져 있다. 두 연구 모두에서 아직 생물학적 기전은 밝혀지지 않았고, 밝혀져야 할 부분이 많이 남아있다. 기존의 재생 치료방법인 차단막과 지지체를 이용한 치료법으로는 낮아진 치조골의 높이를 증대시킬 수는 없다는 한계점이 있고, 따라서 임플란트와 총의치의 적용에 제한점이 있었다. 이러한 한계를 극복하는 데에는 줄기세포와 지지체, 그리고 성장/영양 인자를 조합한 연구가 반드시 필요하다. 또한 현재 주목받고 있는 임플란트 주위염의 치료에서도 줄기세포를 이용한 면역억제와 함께 지지체에 적용된 세포성분의 역할로 이를 극복 할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 줄기세포 연구의 가장 중요한 점으로는 첫째, 획득한 조직으로부터 목적 줄기세포주를 어떻게 효과적으로 분리할 것인가. 둘째, 분리한 줄기세포를 어떻게 효과적, 효율적으로 분화능을 잃지 않은 상태로 증폭 시킬 것인가. 셋째, 증폭시킨 줄기세포를 이용하여 인체에 매식하는 방법으로 어떤 지지체와 차단막, 성장인자를 이용할 것인가 등이 있다. 최근에는 이와 별개로 줄기세포의 면역 조절의 특성이 부각되고 있고, 이를 전신질환 환자에 적용하는 연구가 이루어지고 있다. 지속적으로 발표되는 연구결과들과 임상 시험 결과들로 볼 때, 줄기세포의 인체 내 역할의 패러다임이 바뀌어 가고 있다. 기존에는 인체 내에서 줄기세포가 직접 역할을 하여 조직과 기관을 형성할 것으로 기대하였으나, 인체 내에서 줄기세포는 면역조절의 역할이 크고, 장기간 생존하여 직접 그 역할을 수행하는 세포의 비율은 낮은 것으로 보여진다. 해당 매식 부위에서 여러가지 성장/영양 인자를 분비하여 주화성을 발현하여 주변의 줄기세포주를 끌어 모아 재생의 동력이 되는 것으로 보여진다. 과거 전통적인 방식의 치과 치료 이후에 임플란트의 도입이 큰 변화의 한 축을 이루었다면, 다음 새로운 변화는 줄기세포를 이용한 연구 결과로 나타날 것으로 기대되고, 이는 치조골과 치은 조직이 특히 중요한 임플란트학, 치주과학, 보철과학, 노인치과학, 심미치과학의 분야에서 큰 변화를 이끌어 낼 것이다.

Generation of xeno-free human embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cell via neural crest stem cell

이상혁 차의과학대학교 일반대학원 2021 국내석사

인간배아줄기세포 (Human embryonic stem cell) 로부터 분화된 신경외배엽은 크게 두 가지로 구분되어지는데 중추신경계 와 말초신경계로 나눠진다. 중추신경계는 뇌 및 척수, 말초신경계는 뇌 및 척수로부터 나오는 신경과 여러 세포로 구성이 되어있다. 말초신경계를 구성하는 세포의 기원은 신경능선세포 (neural crest stem cell)로 부터 시작이 되어 진다. 신경능선세포는 neural ectoderm 으로 부터 유래가 되며, 초기 배아의 발생단계 중 neural tube가 형성이 되어 질 때 생성이 되는 세포이다. 이러한 세포들은 다양한 조직이 형성되는 곳으로 이동하며 신체를 구성하는 세포와 조직으로 분화가 가능하다. 신경능선세포에서 말초신경을 지지해주는 Schwann cell, 멜라닌 세포, 그리고 중간엽 세포군인 세포로 분화가 가능하다. 이러한 분화 결정은 여러 분비인자에 의해 영향을 받는데 BMP, WNT, FGF, RA 등 여러 영향을 받는다. 본 실험에서는 1차적으로 neural ectoderm으로 분화를 시키는데 endoderm 분화 필수 경로인 TGF-beta/Activin/Nodal 경로와 mesoderm 분화 필수 경로인 BMP 경로를 저해함으로써 신경능선세포를 얻어 비교분석을 진행하여 중요 marker인 p75의 발현 량을 분석을 한다. 2차로 중간엽 줄기세포 분화를 들어가 중간엽 줄기세표 표면 marker인 CD43, CD73, CD105의 발현 량을 각각 분석하였다. 이후 MSC의 증식능력 및 다분화능력의 특징 또한 비교분석을 진행을 하였다. 하지만 이러한 분화 방법에 있어 동물유래성분이 들어가는 경우이기에 추후에 세포치료제로써의 재료로 적합하지 않기에 Xeno-free 조건에서의 신경능선세포 및 중간엽 줄기세포의 분화를 이전의 일반적인 분화와 어떠한 차이를 보이는지 비교분석 실험을 진행을 하였다. 본 연구는 인간배아줄기세포로 부터 신경능선세포 및 중간엽 줄기세포의 특징을 이해하고, 다량의 Xeno-free 조건의 세포를 얻는 것을 목표로 하며, 향후 중간엽 줄기세포를 tissue engineering 및 paracrine effect를 이용한 세포 치료제로 활용 및 개발에 크게 기여 할 것으로 생각이 되어 진다.

인간배아줄기세포의 특성 유지를 위한 bFGF 신호전달과 분화 관련 NF-kB 활성의 조절 : Control of bFGF mediated self-renewal and differentiation associated NF-κB activity in human embryonic stem cells

강호범 충남대학교 대학원 2007 국내박사

화장품 유효성분으로써 지방유래 줄기세포 배양액의 생리활성 효과 및 열안정성에 대한 연구

문지선 건국대학교 대학원 2015 국내박사

중간엽줄기세포 분화에 toll-like receptor 2 신호가 미치는 영향

이정근 인제대학교대학원 2010 국내석사

ABSTRACT Effect of toll-like receptor 2 signaling on mesenchymal stem cell differentiation (Director: Sang-Jun Park ) Department of Medicine, Graduate School Inje University Objectives : Mesenchymal stem cells (MSC) are multipotential nonhematopoietic progenitor cells capable of differentiating into multiple lineages of the mesenchyme. MSCs have demonstrated as a promising therapeutic modality for tissue regeneration and repair. In this study I have studied the effect of toll-like receptor 2 (TLR2) signaling on MSC differentiation. Methods : MSCs were purely isolated from adipose tissues of B6 mice and propagated in vitro. The phenotype of cells was analyzed by flow cytometry. TLR mRNA expression by MSCs was examined by RT-PCR. The cells were cultured under osteogenesis with or without TLR2 ligand Pam3CSK4 to assess their capacity to differentiate into osteocytes, that was detected by Alizarin red staining. Results : MSCs displayed the constitutive expression of MHC class I and sca-1 but not MHC class II, CD34, or CD11b. TLR1, 2, 3, 4, 5, 8 was constitutively expressed in MSC.s. However, TLR2 was predominantly expressed in the cells. TLR2 ligand directly enhanced osteogenic differentiation of MSCs in the early phase. Conclusions : Present study demonstrate that TLR2 is predominantly expressed on adiogenic MSCs, and TLR2 engagement on MSC enhances osteogenic differentiation in early phase. Ultimately, my research data provide the possibility to develop a culture system for enhancing MSC differentiation into osteocytes. Key Words : Mesenchymal stem cells, TLR2, osteogenic differentiation 국문초록 중간엽줄기세포 분화에 toll-like eceptor 2 신호가 미치는 영향 (지도교수 : 박상준 ) 인제대학교 대학원 의학과 목적 : 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)는 다양한 중간엽계 세포로 분화 능력을 지닌 비조혈줄기세포로 조직의 재생과 치료를 위한 세포치료제 개발의 중요 세포원으로 알려져 있다. 본 연구에서는 지방유래 중간엽줄기세포의 분화에 toll-like receptor 2 (TLR2) 신호가 미치는 영향을 연구하였다. 방법 : 마우스의 지방조직으로부터 중간엽줄기세포를 순수분리 배양하였다. 배양된 세포의 형태특징과 표현형을 조사하기위해 광학현미경과 유세포분석을 실시하였다. 배양된 간엽줄기세포에서 TLR들의 발현을 확인하기위해 RT-PCR을 실시하였다. 간엽줄기세포에 합성TLR2 리간드인 Pam3CSK4를 처리한 후 alizarin red 염색으로 골세포로의 분화를 조사하였다. 결과 : 마우스의 지방조직으로부터 분리한 중간엽줄기세포는 MHC class I과 sca-1을 발현하고 MHC class II, CD34, CD11b를 발현하지 않는 표현형을 지니고 있었다. TLR1, 2, 3, 4, 5, 8가 발현되었고 그중 TLR2가 가장 우세하게 발현되어있었다. 합성 TLR2 리간드인 Pam3CSK4 처리하였을 때 배양 초기에 골세포로의 분화가 촉진되었다. 결론 : 본 연구에서는 지방에서 분리한 중간엽줄기세포에 TLR2가 우세하게 발현되고 특정 리간드로 신호를 전달시키면 초기분화를 촉진시킬 수 있음을 확인하였다. 본 연구결과는 중간엽줄기세포를 단시간 내에 골세포로 분화시켜 신속하게 조직재생에 사용할 생체시료를 확보하는데 활용될 수 있는 기본 배양조건을 제시하였다. 중심단어: 중간엽줄기세포, TLR2, 골세포분화