줄기세포치료에 관한 공법적 연구

임단비 중앙대학교 대학원 2017 국내석사

Regenerative medicine is a therapeutic concept that fundamentally replaces human cells or organs whose function has deteriorated or restores them to their original function, and has attracted attention as a new alternative to overcome rare and incurable diseases. With the continued interest and research in regenerative medicine, regenerative medicine has been developing remarkably. Especially, in the field of stem cell therapy, it is expected that the related market and industry will grow greatly as six stem cell treatment drugs are licensed worldwide. However, apart from the socio-economic utility and value of stem cell therapies, there still exist problems with bioethical issues and uncertain safety and efficacy. The government is actively intervening in relation to stem cells to safeguard the public from the potential risks arising from these problems. In this paper, the constitutional legitimacy of stem cell regulation is found in the obligation of the government to protect the fundamental rights of the people. As a fulfillment of the obligation to protect the lives and health of the people from the risks arising from stem cell research and stem cell treatment, the government imposes regulations on stem cell research and stem cell therapy. Although the restrictions of the government limit the freedom of occupation and academic freedom of related workers, it is constitutionally legitimate in that it is allowed in the constitution to restrict the basic rights within the scope of not infringing the essence of the fundamental rights, are considered to be legitimate. In fulfilling the obligation of the government to protect the fundamental rights of the people, Korea largely regulates stem cell research, stem cell therapy and stem cell treatment. Stem cell research must comply with the regulations for ensuring bioethics and safety in research according to the "Bioethics Act." Stem cell therapy is a medical treatment under the "Medical Law" and is protected under the Act except treatment by a non-medical person. However, the safety and efficacy of stem cell therapy can be confirmed only in limited cases by the New Health Technology Assessment System. Unlike stem cell therapy, stem cell medicine is basically a drug regulated by the Pharmaceutical Affairs Law. Therefore, a stem cell medication can be applied to a patient after receiving clinical drug approval from the Korea Food and Drug Administration based on the results of the clinical trial with the approval of the clinical trial plan. In the case of the approval of the clinical trial plan and the approval of the item, if the relevant items are designated as "Notification", there are questions about what characteristics the "Notice" shall have in terms of the administrative law, and whether the approval of the clinical trial plan(clinical protocol) and the approval of the item shall be granted. In terms of academic research, the answer can be derived from the administrative legal discussion of whether it should be considered a permit, exceptional approval, or patent. In addition to approval of clinical trial plans and approval of items, as a postmarketing management system, drug review system, drug revaluation system, stability information management system such as pharmaceuticals, and long-term follow-up survey are applied to stem cell treatment. Based on the review of regulations related to stem cells currently being carried out in Korea, we pointed out the problems of the current regulation as follows, and suggested ways to improve them. First, stem cell regulation is operated through various notification regulations, so that the stem cell related laws are complicated. To improve this, a separate law on stem cell research and stem cell treatment should be established and the stem cell related legal system should be rearranged. Second, regulating stem cells into drugs and medical practices on the basis of "minimal manipulation" cannot reasonably discipline the complex and specialized fields of stem cells. Therefore, stem cells should be specifically classified and differentiated according to the inherent risk of stem cells and the risk according to the administration method. Third, because stem cell medicine is a remarkable treatment for its biological characteristics, with consideration of the characteristics of stem cells, it is necessary to improve differentiated clinical trial standards and approval standards from those of general drugs. Fourth, stem cell therapy, except medicines for stem cell treatment, is limited in the current law to guarantee the safety and efficacy of the treatment. There needs to be a way to ensure the safety and efficacy of stem cell therapy so that the public can receive stem cell therapy more safely. In this regard, it is meaningful that the legislation of the "Law on the Support and Management of Advanced Rehabilitation Medicine" has been proposed in the National Assembly, and the legislation is meaningful in that it will enact the area of stem cell therapy which had not been enough for legal standards. However, there are limitations in that the safety standards presented in the bill are unclear, and they are subjected to the same procedure without distinguishing the risk of stem cell treatment. 재생의료는 기능이 저하된 인간의 세포나 장기를 근본적으로 대체하거나 원래의 기능으로 회복시키는 치료개념으로, 희귀ㆍ난치 질환 극복을 위한 새로운 대안으로 주목받고 있다. 재생의료에 대한 지속적인 관심과 연구로, 최근 재생의료는 비약적으로 발전하고 있으며, 특히 줄기세포치료 분야는 전 세계적으로 6개의 줄기세포치료제가 판매허가를 받는 등 관련 시장과 산업이 크게 성장할 것으로 예상된다. 하지만 줄기세포치료의 사회 경제적 효용성 및 가치와 별개로 생명윤리적 문제와 불확실한 안전성과 유효성에 대한 문제는 여전히 존재한다. 이러한 문제들에서 발생하는 잠재적 위험성으로부터 국가는 국민을 안전하게 보호하고자 줄기세포와 관련하여 적극적으로 개입하고 있다. 본 논문에서는 줄기세포 관련 규제의 헌법적 정당성을 국가의 기본권 보호의무에서 찾았다. 줄기세포연구 및 줄기세포치료로 인해 발생할 수 있는 위험으로부터 국민의 생명ㆍ신체의 안전을 확보하기 위한 보호의무의 이행으로서 국가는 줄기세포연구 및 줄기세포치료에 규제를 가하는 것이다. 그리고 그와 같은 국가의 규제는 관련 종사자들의 직업의 자유와 학문의 자유를 제한하지만, 이는 기본권의 본질을 침해하지 않는 범위에서 기본권 제한이 가능하다는 점에서 그러한 기본권 제한이 기본권 침해에는 이르지 않는 것으로서 헌법상 정당한 것으로 인정된다. 국가의 기본권 보호의무 이행에 있어 우리나라는 줄기세포에 관하여 크게 줄기세포연구, 줄기세포치료, 줄기세포치료제에 대하여 규제하고 있다. 줄기세포연구는 「생명윤리법」에 따라 연구에 있어서의 생명윤리 및 안전을 확보하기 위한 규정을 준수해야 한다. 줄기세포치료는 「의료법」상 의료행위에 해당하며, 의료인이 아닌 자에 의한 치료가 금지됨을 제외하고서는 동법에 따라 보호를 받는다. 다만, 신의료기술평가제도에 의해 제한적인 경우에 한하여 줄기세포치료의 안전성과 유효성을 확인할 수 있다. 줄기세포치료와 달리 줄기세포치료제는 의약품으로서 「약사법」에 따라 기본적으로 일반 의약품과 같이 규제된다. 따라서 줄기세포치료제는 임상시험계획승인을 받아 임상시험을 수행하고, 그 결과를 바탕으로 하여 식품의약품안전처의 품목허가를 받아야 환자에게 적용될 수 있다. 임상시험계획승인 및 품목허가에 있어 이와 관련한 사항을 “고시”로 정한 경우, 이때의 “고시”는 행정법상 어떤 성질을 갖는 것인지, 그리고 임상시험계획승인과 품목허가가 강학상 허가, 예외적 승인, 특허 중 어떤 성격을 갖는 것인지가 행정법적 논의로서 도출될 수 있다. 임상시험계획승인 및 품목허가 외에도 줄기세포치료제는 시판 후 관리제도로서 의약품 재심사제도, 의약품 재평가제도, 의약품 등 안정성 정보관리제도, 장기추적조사가 적용된다. 현재 우리나라에서 시행되고 있는 줄기세포와 관련한 규제의 검토를 바탕으로 현행 규제가 가지고 있는 문제점을 다음과 같이 지적하였고, 그에 대한 개선방안을 제시하였다. 첫째, 줄기세포 관련 규제가 각종 고시규정을 통해 운영되고 있어 줄기세포 관련 법 체계가 복잡하게 이루어지고 있음을 알 수 있다. 이를 개선하기 위해서 줄기세포연구 및 줄기세포치료에 관한 별도의 법률을 제정하여 줄기세포 관련 법 체계를 재정비해야 한다. 둘째, 줄기세포를 “최소한의 조작”을 기준으로 하여 의약품 및 의료행위로 구분하여 규제하는 것은 복잡하고 특수한 줄기세포 분야를 합리적으로 규율할 수 없다. 따라서 줄기세포 고유의 위험성과 투여방법에 따른 위험도에 따라 줄기세포를 구체적으로 구분하여 차별적으로 규율해야 한다. 셋째, 줄기세포치료제는 그 생물학적 특성이 두드러지는 치료제이기 때문에 줄기세포의 특성을 고려하여 일반 의약품과는 차별화된 임상시험 기준 및 허가기준으로의 개선이 필요하다. 넷째, 의약품인 줄기세포치료제를 제외한 줄기세포치료는 현행법상 그 치료행위의 안전성 및 유효성을 담보할 수 있는 제도가 제한적으로 운영되고 있다. 국민들이 좀 더 안전하게 줄기세포치료를 받을 수 있도록 줄기세포치료의 안전성과 유효성이 적절하게 확보될 수 있는 방안이 마련되어야 한다. 이와 관련하여 현재 국회에는 “첨단재생의료의 지원 및 관리에 관한 법률안”이 발의된 상태로, 동 법률안은 그 동안 법적인 기준이 미비했던 줄기세포치료 영역을 법제화 하였다는데 의의가 있다. 다만 법률안에서 제시하는 안전성 기준이 불명확하고, 줄기세포치료의 위험도를 구분하지 않고 동일한 절차만을 거치도록 하고 있다는 점에서 한계가 있다.

miR-29a-3p의 발현이 인간중간엽줄기세포의 이동성 촉진에 미치는 영향

강다연 순천향대학교 대학원 2022 국내박사

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are multipotent cells with the capacity to promote tissue regeneration of injured sites. MSCs can improve the microenvironment of damaged tissue by migrating to the injured location by homing effect. MSCs then replace cells at the injury site and/or modulate inflammatory environments. For this reason, hMSCs have significant potential for clinical application. The homing ability and engraftment in the injury site of administered MSCs play important roles in the therapeutic efficacy of stem cell therapy. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying the migratory ability of MSCs to target sites is crucial in this field. MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs (~22 nucleotides long) repressing target mRNAs at the post-transcriptional level. Because miRNAs can target numerous target mRNAs stimultaneously, they can influence a variety of cellular activities in a coordinated integrated manner. In this study, we discovered a miRNA that promotes migration of hMSCs. To understand the role of microRNAs (miRNAs) during hMSCs migration, we depleted DiGeorge syndrome critical region 8 (DGCR8), an essential gene for miRNA biogenesis. Specifically, miR-29a-3p overexpression rescued the migration defects observed in DGCR8 knockdown hMSCs. We also found that the protein phosphatase receptor-like protein tyrosine phosphatase kappa (PTPRK) and Phosphatase and tensin homolog (PTEN) that control hMSCs migration were directly inhibited by miR-29a-3p. Cell migration is an integrated multistep process including polarization, adhsion, and contraction. We found that miR-29a-3p directly and/or indirectly regulated in almost every stage of the migratory processes. Compared with DGCR8 deficient hMSCs, miR-29a-3p overexpressed hMSCs rescued defects observed in cell polarization, adhsion, and contraction. Moreover, we showed that miR-29a-3p overexpression promotes hMSCs migration in vivo toward matrigel plugs that release SDF-1a in immunocompromised mice. Overall, our findings demonstrate that miR-29a-3p promotes hMSCs migration by regulating nearly every stage of cellular migratory processes both in vitro and in vivo. 세포치료제는 특정 환경에서 배양 및 조작하여 환자에게 다시 주입하거나, 세포를 인체조직으로 만들어 사용하는 신개념 의약품을 말한다. 치료목적으로 주입된 성체줄기세포는 혈관을 따라 손상된 부위로 이동하여 치료효과를 나타내게 되므로 성체줄기세포에서의 이동성 조절 연구는 줄기세포의 작용기전에 대한 이해를 높일 뿐만 아니라 세포치료제의 효능을 증진시킬 수 있다는 점에서 임상적, 상업적으로 효용가치가 높다. 마이크로RNA는 약 22개의 뉴클레오티드로 이루어진 짧은 길이의 RNA로서 유전자 발현을 제어하는 중요한 조절인자이다. 하나의 miRNA는 수백 여 개의 표적유전자 및 신호전달체계를 동시다발적으로 조절할 수 있다고 알려지면서 줄기세포를 포함하는 세포운명 결정의 핵심 조절인자로 인식되고 있다. 따라서 본 연구는 줄기세포치료제로 주로 사용되는 성체줄기세포의 이동을 조절하는 miRNA를 규명하고자 하였다. 먼저 miRNA의 생성에 중요한 역할을 하는 마이크로프로세서인 DGCR8를 억제시켜 miRNA의 발현이 전반적으로 저하된 세포와 대조군 세포의 mRNA 마이크로어레이 분석 및 trans-well assay를 수행하였다. 이때 miRNA가 성체줄기세포의 이동에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 또한 성체줄기세포에서 miR-29a-3p의 표적유전자를 찾고 이를 실시간중합효소연쇄반응, 웨스턴블롯, 루시페라아제 실험법으로 확인하였다. 이때 확인된 표적유전자인 PTPRK와 PTEN이 성체줄기세포의 이동을 억제하는 것을 trans-well assay로 확인하였다. 세포의 이동은 세포의 극성화, 접착의 생성, 견인력의 생성이라는 단계를 거쳐 일어난다. 각 단계에서의 miR-29a-3p의 역할을 면역형광염색법 또는 traction force microscopy를 이용하여 확인하였고, 세포의 이동 각 단계에서 miR-29a-3p가 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다. 마지막으로 생체내 세포 이동 평가를 위해 손상부위에서 분비되는 것으로 알려진 케모카인인 SDF-1a를 이용하여 체내 화학적 차이를 수행한 결과, miR-29a-3p를 과발현한 성체줄기세포가 대조군 세포에 비해서 SDF-1a 방향으로 더 많이 이동한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구는 miR-29a-3p가 성체줄기세포에서 세포이동의 다양한 단계에 영향을 미침으로써 이동을 촉진하는 것을 생체외 및 생채내 실험에서 모두 확인하였다. 본 연구를 통하여 중간엽줄기세포의 이동을 촉진함으로써 줄기세포치료제의 효능을 높이는 전략을 제공할 수 있을 것으로 예상된다.

Development of cartilage tissue engineering applications using mesenchymal stem cells

조혜란 인천대학교 일반대학원 2019 국내석사

Osteoarthritis (OA) is a common chronic disease caused damage on focal area of the articular cartilage and caused by extreme exercise and aging. Current surgical treatments for OA had a series of disadvantages such as fibrocartilaginous tissue formation and donor site morbidity. Therefore, in order to overcome these problems, researchers developed advanced treatments with the aid of mesenchymal stem cell (MSCs) including (bone-marrow derived stem cells (BMSCs) and adipose-derived stem cell (ADSCs)). Recent stem cell therapies based on tissue engineering and regenerative medicine have been developed combining with scaffolds and exogenous growth factors. MSC has self renewal ability and multipotency that can differentiate into bone/cartilage tissue, and is well known for pro-inflammatory effect within inner body conditions. Additionally MSC can be isolated easily from bone-marrow or adipose tissue with high yields. Therefore, it has been used as a common cell source utilized under various conditions in tissue engineering. For enhanced stem cell differentiation, exogenous growth factors (GFs) are administrated by using various delivery carriers (i.e., micelle, liposome, synthetic polymeric platform etc.). Especially, transforming growth factor-beta family (TGF-β) and insulin-like growth factor (IGF) are widely used as an exogenous growth factor for chondrogenesis of stem cell. IGF-1 and TGF- β could enhance the chondrogenesis of stem cells by developing morphological changes and inducing excretion of extracellular matrix (ECM) components. Hence, tissue engineering strategies for chondrogenesis of stem cells have been developed by varying (1) cell culture methods, (2) exogenous biological cues, (3) composition of ingredients, and (4) modification of scaffolds. This article summarized engineering applications for cartilage regeneration using stem cells, by suggesting (1) co-culture stratgies using MSC and chondrocytes, (2) recent clinical trials for ADSC-mediated joint repair, and (3) optimization of serum types (i.e., bovine serum (BS), new-born calf serum (NCS)) for enhanced chondrogenesis of ADSC. Administration of a single cell population of either stem cells or chondrocytes does not guarantee a full recovery of cartilage defects. Therefore, current tissue engineering approaches using co-culture techniques have been developed to mimic complex and dynamic cellular interactions in native cartilage tissues and facilitate changes in cellular phenotypes into chondrogenesis. Therefore, this article introduces recently developed co-culture systems using two major cell populations of, MSCs and chondrocytes. Furthermore, the present article also summarizes the recent clinical applications utilizing ADSC and its clinical and therapeutic efficacy which evaluated by scoring systems for OA treatment. Current ADSC treatments in clinical system have been developed by direct injection of ADSC with additional compounds such as platelet-rich plasma (PRP) and stromal vascular fraction (SVF) for enhancing differentiation of stem cells. In addition, optimization of serum types for a large-scale stem cell production/culture is also critical parameter to develop a cost-effective and biologically functional chondrogenesis process. Fetal bovine serum (FBS) is the most essential supplement in culture media for cellular proliferation, metabolism, and differentiation. However, due to a limited supply and subsequently rising prices, a series of studies have investigated a biological feasibility of replaceable serums to substitute FBS. Along with the increasing interests to manufacture stem cell-based cellular products, optimizing the composition of culture media including serums and exogenous GFs is of importance. Hence, the effect of BS and NCS on proliferation and chondrogenic differentiation capacity of human ADSCs was evaluated, especially in the chondrogenically supplemented culture condition. Our findings demonstrated that (1) co-culture methods using stem cells with chondrocytes could effectively augment chondrogenesis and stem cell differentiation as compared with monoculture, (2) clinical ADSC treatment could be an effective cell therapy by improving physical function of damaged cartilage sites, and (3) serum types and exogenous supplements of GFs could also be important parameters to optimize culture media composition, especially in order to maintain the enhanced levels of both proliferation and chondrogenic differentiation of ADSCs during expansion. Therefore, it could be speculated that stem cell therapy utilizing stem cell population could be an effective OA treatment in tissue engineering and regenerative medicine. 골관절염은 흔한 만성 질환으로 관절 연골의 국소 부위에 손상을 주며 심한 운동과 노화로 인해 생기는 질병이다. 관절의 특성상 한번 다치면 회복되기 어렵다는 점으로 인해, 관절을 치료하기 위해서는 물리적, 외과적 방법들이 이용되고 있다. 현재 사용하고 있는 골관절염의 치료 방법들은 (미세 천공술, 관절세포 이식 등) 공여 부위의 또 다른 관절염 유발이 된다는 것과 섬유조직으로 잘못 재생되는 것과 같은 많은 단점을 가지고 있다. 따라서 이 문제를 극복하기 위해 연구자들은 앞서서 중간엽 줄기 세포와 지방 세포 유래 줄기 세포를 활용한 치료법을 개발했다. 중간엽 줄기 세포는 뼈 / 연골 조직으로 분화 할 수 있는 능력과 자가 재생 능력을 가지고 있으며, 신체 내부에 이식 되었을 때에는 염증을 억제하는 효과까지 있다고 잘 알려져 있다. 또한 중간엽 줄기 세포는 혈액이나 지방 조직으로부터 쉽게 분리 될 수 있고 그 수율 또한 다른 줄기세포에 비해 높다는 장점으로 인해 조직 공학 분야의 다양한 조건에서 활용되는 일반적인 세포원으로 사용되어왔다. 줄기 세포의 분화 가능성을 높여 주기 위해, 일반적으로 많은 연구가 다양한 전달 매체 (엑소좀, 리포솜, 합성 중합체 등)에 외인성 성장 인자를 담지 하여, 줄기세포와 함께 투여한다. 특히, 줄기 세포의 연골 형성을 위한 외인성 성장 인자로는 형질전환생장인자-베타 계열과 인슐린 유사 성장 인자가 널리 사용된다. 이전의 많은 연구에서 형태학적 변화를 일으키고 세포 외 기질 성분의 배설을 유도함으로써 줄기 세포의 연골 형성을 향상시킬 수 있는 인슐린 유사 성장 인자와 형질전환생장인자-베타의 효능을 제안했고, 따라서 줄기 세포를 활용한 연골 형성 전략은 (1) 세포 배양 방법, (2) 외인성 성장 인자의 첨가, (3) 성분 조성의 변화, (4) 지지체의 개발과 같은 방향으로 개발되었다. 이 논문에서는 (1) 중간엽 줄기 세포와 연골 세포를 이용한 공동 배양법, (2) 지방 세포 유래 줄기 세포를 이용한 임상 시험 및 결과, 그리고 (3) 중간엽 줄기세포를 이용한 연골 재생 전략을 요약하고 소개하고 있다. (1)에서는 줄기 세포 또는 연골 세포와 같은 단일 유형의 세포 집단을 환부에 투여한다고 해서 연골 결손의 완전한 회복이 보장되는 것은 아니다. 따라서 공동 배양 기술을 사용하는 조직 공학적 접근법은 생체 연골 조직에서의 복잡하고 역동적인 세포 상호 작용을 모방하고 있으며, 세포 표현형의 연골 형성으로의 변화를 촉진하기 위해 개발되었다. 따라서 이 주제는 최근에 개발 된 두 가지 주요 세포 집단 (중간엽 줄기 세포 두 종류와 연골 세포 등)을 이용한 공동 배양 시스템을 소개한다. 다른 한편, (2) 지방 세포 유래 줄기 세포는 손상된 연골 부위를 치료하기 위해 임상 분야에서 이용되어 왔다. 이 부분에서는 지방 세포 유래 줄기 세포를 이용하여 임상에 적용시켰다. 채점 시스템으로 평가 하여 임상 효능을 요약했다. 또한 줄기 세포의 분화를 촉진하기 위해 혈소판 풍부 혈장 및 지방조직 유래 세포기질 분획과 같은 추가 화합물을 지방 세포 유래 줄기 세포와 주사하여 임상 시스템에서의 현재 지방 세포 유래 줄기 세포 치료법이 개발되었다. 또한 송아지 혈청과 소 혈청을 사용하여 다른 접근 방식을 도입했다. (3)에서는 혈청에 따른 지방 세포 유래 줄기 세포의 연골 세포로의 분화 효과를 확인하기 위해, 송아지 혈청과 소 혈청을 처리하여 기존에 사용하고 있는 소 태아 혈청과 비교하였다. 소 태아 혈청은 세포 증식, 신진 대사 및 분화를 위한 배양 배지에서 가장 필수적인 보충 물이다. 그러나 제한적인 공급과 그에 따른 가격 상승으로 인해 일련의 연구가 소 태아 혈청을 대체 할 수 있는 대체 가능한 혈청의 생물학적 타당성을 연구했다. 줄기 세포 기반 세포 제품을 제조하는 데 대한 관심 증가와 함께 혈청 및 외인성 성장인자를 포함한 배양 배지의 조성을 최적화하는 것이 중요하다고 여겨지고 있어, 이 실험에서 인간 지방 세포 유래 줄기 세포의 증식 및 연골 분화 능력에 대한 송아지 혈청과 소 혈청의 효과가 평가되었으며, 특히 연골 보충 배양 조건에서 평가되었다. 연구 결과 (1) 연골 세포를 이용한 줄기 세포를 이용한 공 배양 방법이 단일 배양법에 비해 줄기 세포 분화에 효과적인 연골 형성이 될 수 있음, (2) 줄기 세포를 이용한 임상에서의 지방 세포 유래 줄기 세포 치료가 통증, (3) 송아지 혈청과 소 혈청은 소 태아 혈청과 비교하여 지방 세포 유래 줄기 세포의 증식에는 영향을 미쳤지만, 연골 세포로의 분화 분석한 결과에서는 기존의 혈청과 차이가 나지 않았다. 이러한 연구결과들은 다양한 연골재생치료제의 개발 방향에 많은 단서를 던져주고 있고, 따라서 지방 세포 유래 줄기 세포 혹은 골수유래 중간엽 줄기세포를 이용한 줄기 세포 치료가 향후에 효과적인 골관절염 치료가 될 수 있음을 시사한다.

Improvement of adherence and therapeutic effect of PSGL-1 transfected mesenchymal stem cells in myocardial infarction model

임창휘 Graduate School, Yonsei University 2020 국내석사

중간엽줄기세포는 많은 임상분야에서 치료제로 쓰이고 있다. 또한 이러한 줄기세포치료는 심근경색이나 심부전 같은 심장질환에서 이용하고 있다. 기존의 줄기 세포 치료법에서 흔히 발생하는 문제는 주입 된 줄기 세포가 병변부위로 제대로 이동하지 않고 다른 장기에 분산되어 퍼진다는 것이다. 실제로 혈관에 주입 된 줄기 세포가 병변 부위로 이동하는 효율은 2 % 미만이며 나머지 세포는 주로 폐 또는 신장에서 발견되고 이마저도 단기간(4주 이내) 내에 사라지는 것으로 보고되었다. MSC의 이러한 낮은 생착률을 증가시키기 위해, 본 연구에서는 초기 면역 반응 동안 혈관에서 순환하는 면역 세포가 염증부위로 이동하는 기작에 관여하는 단백질을 줄기 세포에 적용하였다. 세포 괴사와 같은 조직 손상이 발생하면, 인터류킨과 같은 신호 물질이 관련 부위로부터 분비되어 혈관 내피 세포를 자극하고, 셀렉틴 및 CAM과 같은 단백질이 표면에 발현된다. 면역 세포의 표면에서 발현되는 P- 셀렉틴 당 단백질 리간드 -1 (PSGL-1) 또는 L- 셀렉틴은 혈관 내피 세포의 자극에 의해 발현되는 단백질에 결합하며, 혈관 내 이동하는 줄기 세포의 속도를 늦춰 병변부위의 혈관 안으로 들어오는 세포의 양을 증가시킬 수 있다. 우리는 이 원리를 이용하여, 유전자 형질도입을 통해 중간엽줄기세포 표면에 PSGL-1을 발현시키고 치료효과를 증가시켰다. 유전자 형질도입은 바이러스성이나 비 바이러스성 운반체를 통해 진행할 수 있다. 우리의 최종 목표 이 치료법을 임상에 적용하는 것이기 때문에 비 바이러스성 운반체인 ABP를 통하여 PSGL-1을 형질도입 하였다. 그 후, PSGL-1을 발현하는 MSC를 심근 경색 랫드 모델에 주사하고 각 기간 및 단계에서 유전자 도입 줄기 세포의 효과를 검증 하였다. 심근 경색 모델을 만들고 줄기 세포를 주입 하여 3주 후에 심장 조직을 얻어, 경색 부위에 남아있는 MSC를 측정하기 위해 면역 형광 염색을 수행 하였다. 또한 트라이크롬 염색과 TTC 염색, H&E염색을 통해 경색률과 석화화 비율이 감소된 것을 확인하였다. 마지막으로 심초음파를 확인하여 심장 기능의 개선을 확인하였다. Mesenchymal Stem Cell(MSC) is used as a therapeutic agent in many clinical fields. These stem cell therapies are also used in heart diseases such as myocardial infarction and heart failure. A common problem in many of the existing stem cell therapies is the fact that the injected stem cells are not properly transferred to the diseased area and are dispersed to other organs. In fact, it has been reported that the efficiency with which stem cells injected into the blood vessels migrate to the lesion site is less than 2%, and the remaining cells are found mainly in the lungs or kidneys and also disappear within a short period(4 weeks). In order to increase these low engraftment rate of MSCs, we have applied to the stem cells a protein involved in the mechanism of migration of the immune cells circulating in the blood vessels during the initial immune reaction to the inflammatory site. When tissue damage occurs such as cell necrosis, a signal substance like interleukin is secreted from the relevant site to stimulate vascular endothelial cells, and proteins such as selectin and CAM are expressed on the surface. P-Selectin Glycoprotein Ligand-1(PSGL-1) or L-selectin, which is expressed on the surface of immune cells, binds to proteins expressed by stimulation in vascular endothelial cells and it is possible to increase the number of stem cells migrating to the lesion site by moving on the inner wall of the vessel and showing a decrease in the moving speed. We use this principle, to increase MSC therapeutic efficiency, make PSGL-1 express on MSC surface by gene transfection. For gene transfection, viral or non-viral carrier is used to deliver the gene. Our final goal is clinical application, so PSGL-1 transfer was performed using non-viral carrier ABP. In order to improve low transfection efficiency, which is a problem of non-viral carrier, we separated the transfected and untransfected cells by flow cytometry through GFP(Green Fluorescent Protein), a widely used fluorescent protein. Through this method, the effect of the gene was increased by using only the transfected cells for treatment. After that, MSC expressing PSGL-1 was injected into myocardial infarction rat model and verified the effect of transgenic stem cells in each period and step. After injection of stem cells into the myocardial infarction model, we harvested heart tissue 3 weeks later after operation, performed Immunofluorescence staining to measuring remained MSC on infarct site. And also confirmed the infarct rate and petrification rate were reduced thorough trichrome staining, TTC staining, and H & E staining. In addition, confirmed the improved cardiac function after stem cell therapy using echocardiography.

만성신장질환 모델에서 인간 중간엽 줄기세포의 항섬유화 효과에 대한 특성 분석

김윤지 순천향대학교 2023 국내석사

Chronic kidney disease (CKD) is defined as functional nephron loss and/or structural abnormalities of the kidney for more than 3 months. CKD progression leads to renal dysfunction, which eventually progresses to end-stage renal disease. Mesnechymal stem cell (MSC) -based therapy is being used as a clinical application in CKD. To evaluate the effectiveness of stem cell therapy, a proper CKD model is required. However, the current animal models are limited because of genetic differences between humans and animals, high costs and a lengthy process. To overcome this limitation, we established a CKD model that can evaluate the effectiveness of MSC therapy in vitro. To model the fibrotic environment, we adjusted the substrate as normal kidney (3.9 kPa, soft) and CKD kidney (32.7 kPa, stiff) stiffness using polyacrylamide (PAA) gels. Then, we examined the phenotypes of CKD including oxygen species (ROS). We found that cell proliferation, fibrosis marker expression and ROS levels were increased in the stiff group. These results suggest that the established model can mimic CKD in vitro. To assess the efficacy of MSC therapy, next, we treated conditioned medium (CM) of MSC on the CKD in vitro model. The levels of fibrosis markers were decreased in the CM-treated stiff group. These results suggest that CM may have anti-fibrotic effects in this condition. To investigate underling molecular mechanisms of CM impact in the CKD in vitro model, we performed miRNA profiling. We selected differently expressed miRNAs between the stiff and the CM-treated stiff group, then mRNA targets of these miRNAs were selected using Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software. Next, we performed core analysis with those performed core analysis with those predicted target mRNAs. IPA analysis indicated that the canonical pathways including senescence pathways and fibrosis-telated pathways are significantly enriched in the CM-treated stiff group. Interestingly, the senescence pathway was identified as the most significant signaling pathway in this condition. Therefore, we then examined intracellular and mitochondrial ROS levels. We found that ROS levels were reduced in the CM-treated stiff group. In addition, the expression of DNA repair markers was also decreased. By varying the substrate’s stiffness, it has been demonstrated that CKD can be established in a stiff environment in vitro. Addtionally, when this model was treated with CM of MSCs, differently expressed miRNAs were identified. Pathway analysis with target mRNAs of those selected miRNAs demonstrated that senescence pathways were significantly enriched. This work demonstrates that the CKD model built through this process can be a new tool for promptly assessing the effectiveness of stem cell therapy. 만성신장질환 (Chronic kidney disease, CKD)은 신장의 구조적 이상 또는 기능적 네프론의 손실이 나타나는 신장질환이다. CKD가 진행되면 신장 기능 이상으로 인해 몸속 노폐물이 축적되어 심각한 질병을 유발하며 이는 최종적으로 말기 신부전으로 진행된다. 이러한 CKD 치료하기 위해서 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell, MSC)기반의 치료제에 대한 연구가 진행 중이다. 줄기세포치료제의 효능을 평가하기 위해서 CKD 모델이 필요한데 현재 사용되고 있는 동물모델은 구축하는 데 오랜 시간과 큰 비용이 들며 동물과 인간은 종간의 차이가 있다는 단점이 있다. 따라서 동물 모델의 한계점을 극복하기 위해 본 연구는 체외 환경에서 단기간에 CKD 모델을 구축하고 해당 모델에서 MSC의 치료 효과에 대한 특성 분석을 수행하였다. 체외 환경에서 CKD의 병리학적 징후인 섬유화 환경을 모방하기 위해서 polyacrylamide gel (PAA gel)을 이용하여 기질의 강성을 조절하였다. 정상 신장의 강성인 3.9 kPa (soft)와 CKD 신장의 강성인 32.7 kPa (stiff)로 기질의 강성을 조절하고 강성 차이에 따른 human RPTEC/TERT1 세포의 특성을 분석하였다. CKD를 모델링한 stiff 군에서 질병의 표현형인 세포의 증식과 섬유화 마커의 증가, 세포 내 활성산소의 증가를 확인했다. 이렇게 구축한 CKD 모델에서 줄기세포치료제의 효능을 평가하기 위해서 MSC의 배양액인 conditioned media (CM)을 처리하고 그 변화를 확인하였다. CM을 처리한 stiff 군에서 섬유화 마커의 감소가 나타났고 CM이 CKD 모델에서 항섬유화 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다. CKD 모델에서 CM 효과에 대한 기전을 연구하기 위해 miRNA profiling을 진행하였다. Stiff 군에 CM을 처리하였을 때 유의한 증가를 나타내는 miRNA의 예상 타겟의 관련 신호 전달 경로를 생물정보학적 분석을 통해 분석하였고 그중 가장 유의도가 높은 senescence pathway를 실험을 통해 확인했다. CM을 처리했을 때, CKD 모델에서 세포 내 활성산소가 감소하며 DNA 손상을 나타내는 DNA 손상 복구 마커의 발현 감소를 확인했다. 따라서 이러한 결과를 통해 체외 환경에서 기질의 강성을 조절하여 stiff 한 환경에서 CKD를 모방하는 모델을 구축할 수 있음을 확인했으며, 해당 모델에 MSC의 CM을 처리했을 때, senescence pathway 등을 조절함으로 항섬유화 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 이를 통해 구축한 CKD 모델이 줄기세포치료제의 효능평가와 특성 분석을 단기간에 수행할 수 있는 새로운 도구가 될 수 있음을 보여준다.

신경줄기세포치료제의 특성분석 및 품질평가항목 설정

강소영 충북대학교 2021 국내박사

Neurodegenerative diseases are caused by a loss of neurons within the central or peripheral nervous system, and is a chronic rare incurable disease for which there is no therapy for complete recovery. Therefore, research to treat neurodegenerative diseases using cell-based therapy has been actively conducted recently. Especially, because of the regenerative potential of neural stem cell (NSC), cell-based therapy using NSCs is an emerging therapeutic approach targeting neurodegenerative diseases. Cell therapy products including NSCs belong to advanced biopharmaceuticals, and due to their unstable, complex characteristics, characterization and quality control(QC) of products are very important. However, there are currently few QC test methods to refer to for the development of NSCs as a therapeutics, which is an obstacle to the development of therapeutic agents. Therefore, in this study I try to provide characterization and QC test items that can be used for NSC based therapeutics. I investigate literature research such as domestic and foreign guidelines and papers regarding the QC of cell therapy product, and some items were confirmed through experiments. Among several methods for obtaining NSCs, I used direct reprogramming technology. To generate NSC, human fibroblasts were directly reprogrammed by introducing pluripotent factors (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) withSendai virus using optimized media and growth factors at each step. Using these NSCs, the applicability of characterization items was confirmed through experiments on the main QC items of cell therapeutics, such as identity, purity, and potency. To identify the properties of NSCs, I assessed microscopic cell morphology, doubling time calculation, Short Tandem Repeat (STR) profiling. The expression of NSC-specific markers (Nestin, PAX6, SOX1, SOX2, and N-Cadherin) was also detected by immunostaining and qPCR. Genetic stability is very important in cell therapy products. I have confirmed that the NSCs in this study have normal karyotype, and the removal of Sendai virus used during gene introduction was also confirmed. At the purity test, the detection of non-target cells and impurities during the process can be set. In this study, a test that detects induced pluripotent stem cell(iPSC) as non-target cells was set as the purity test. As a potency test, it is possible to set the differentiation ability of NSCs and quantify growth factors and neurotrophic factors secreted by NSCs. In this study, after differentiating NSCs into neurons, it was confirmed that NSCs differentiate into functional neurons by verifying the expression of neuronal-specific markers and electrophysiological activity of neurons. Some of the various characterization tests such as identity, purity, and potency suggested in this study can be used as the QC test items of the drug substance and drug product. For the QC test item of the drug product, it can be used in the release test after verifying its validity through method validation The characterization analysis and QC test items of NSCs presented in this study are expected to be used as basic data for NSCs to be developed as therapeutics for incurable neurological diseases.

배양 조건에 따른 만성 신장 질환 체외 모델의 구축 및 특성 분석

김상대 순천향대학교 대학원 2021 국내석사

만성 신장 질환 (CKD, chronic kidney disease) 은 병리학적 검사 결과에서, 단백뇨와 같은 신장 손상의 증거가 있거나, 신기능이 저하되어 있는 상태를 지칭한다. 다양한 원인에 의한 신장질환을 모두 포함하고 있으며, 정의상으로는 아직 신기능이 정상인 환자도 CKD에 속할 수 있다. CKD는 말기 신장 질환으로 진행하는 상태이다. 말기 신장 질환에 도달하면 더 이상 신장이 기능을 할 수 없기 때문에 신장 이식과 투석으로 치료를 한다. 그 중 신장 이식은 공여자를 구하기 힘들다는 점과 면역 거부 반응과 같은 부작용이 존재한다. 그래서 신장 이식 이외의 치료 방법으로 줄기세포 치료가 연구되고 있다. 줄기세포 치료를 위해서는 CKD 동물 모델을 통해 줄기세포의 치료 효능을 입증해야 한다. 하지만 CKD 동물 모델을 만들기 위해서는 많은 시간이 필요하기 때문에 빠른 시간 내에 줄기 세포의 효능을 입증할 수 있는 체외 CKD 모델 구축이 필요하다. 본 연구에서는 배양조건에 따른 신장 세포의 질환 모델 구축 및 특성 분석에 대한 연구를 목표로 하였다. 가장 먼저, 질병 신장을 대변할 수 있는 신장 세포를 선정하였다. CKD의 주요 원인인 신장 섬유증을 모방할 질병으로 선정하였고, 그 중 섬유증이 잘 발생하는 근위 세뇨관을 목적 부위로 선택하였다. 그에 따라 세포는 근위 세뇨관 상피 세포로 설정하고, 관상 상피 세포에서 나타나는 마커 발현 패턴을 확인하였다. 그 후 신장 섬유증을 모방하기 위한 환경을 디자인하였다. Polyacrylamide gel (PAA) 젤의 조성 변화를 통하여 섬유증과 같은 질병 신장을 대표할 수 있는 강성으로 젤을 제작하였으며, 이렇게 만들어진 젤에 신장 세포를 배양하였다. 이 때 신장 세포의 생존율과 발현되는 섬유증 마커, 분비되는 단백질을 확인하였다. 결과적으로 질병 신장 조건에서 배양된 신장 세포의 생존율을 측정했을 때 세포 생존율이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 질병 신장 조건에서 배양된 신장 세포에서 섬유증 마커의 과발현을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 체외 섬유증 모델을 제작하여, 질병 환경에서 신장 세포가 발현하는 마커들의 특성을 확인할 수 있었으며, 이 때 신장 세포 배양은 강성과 같은 주변부 환경조성에 의해서 영향을 받는다는 것을 알 수 있다. Chronic kidney disease (CKD) refers to a condition in which there is evidence of kidney damage such as proteinuria in pathological and laboratory results, or that renal function is reduced. It includes all kidney diseases due to various causes, by definition, patients with normal renal function can also belong to CKD. Methods of treating these CKD include dialysis and kidney transplantation. However, kidney transplantation has a difficulty in donor availability and shows side effects such as immune rejection. Stem cell therapy is being studied as a treatment method for CKD replacing dialysis and kidney transplantation. In order to apply stem cell therapies, it is necessary to demonstrate the therapeutic efficacy of stem cells through a CKD animal model. However, since it takes a lot of time to make a CKD animal model, it is necessary to build an in vitro CKD model that can be used to prove the efficacy of stem cells more efficiently. The aim of this study is to establish the in vitro CKD disease model and analyze characteristics. First, kidney cells capable of representing diseased kidneys were selected. renal fibrosis, a major cause of CKD, was selected as a disease to mimic, and accordingly, the cells were set as proximal tubular epithelial cells. We confirmed that these cells exhibit the characteristics of renal proximal tubule epithelial cells. The environment was then designed to mimic the proximal tubular fibrosis. A polyacrylamide (PAA) gel was prepared with a stiffness that could represent the diseased kidney, and kidney cells were cultured on the gel. We then analyzed the cell viability, fibrosis markers expression, and proteins secreted by the kidney cells. As a result, we observed that the survival rate of the kidney cells cultured under stiff condition was decreased. In addition, abnormal expression of proximal tubule markers and increased expression of fibrosis markers were confirmed in kidney cells cultured under diseased kidney conditions. And it was confirmed that the increased secretion of TNF, which is highly secreted in the disease state. Based on these results, an in vitro fibrosis model was constructed, and the characteristics of the markers expression and a protein secreted by kidney cells under disease condition were confirmed.

줄기세포치료제의 CTD module 3 품질평가 자료 작성에 대한 연구

정혜경 연세대학교 대학원 2021 국내석사

The market for regenerative medicine technology, which offers alternatives to the treatment of many diseases, including rare incurable diseases, is growing rapidly around the world. Among them, stem cell technology provides treatments in various fields, and many companies around the world are jumping into development. The need for the regulatory management of regenerative medicine emerged, and 「the Act on the Safety and Support for Advanced Regenerative Medicine and Advanced Biopharmaceuticals」was enacted and implemented in 2020. There is a limit to applying regulations such as the current Pharmaceutical Affairs Act to regenerative medicine technology. It is one of the factors behind the enactment of the Advanced regenerative medicine and Biopharmaceuticals Act, which requires a different approach from evaluating of synthetic drugs for regenerative medicine and advanced biopharmaceuticals. CTD, common technical documents is focused on synthetic medicine. It was found that there was a lack of domestic guidelines for the preparation of CTD reflecting the latest regulations of the Advanced Regenerative medicine and Biopharmaceuticals Act for advanced biopharmaceuticals, including stem cell therapies. So, the research is conducted to enhance the understanding of CTD quality part for regulatory affairs based on mesenchymal stem cells among advanced biopharmaceuticals. This study is based on the published CTD guidelines of domestic and foreign authorities and ICH guidelines. Detailed examples and content of CTD are a comprehensive description of domestic and foreign guidelines on cell therapy, review comments of approved products, and related papers. Through this study, the existing method of CTD preparation focused on synthetic drugs was reinterpreted to follow the characteristics of advanced biopharmaceuticals to enhance the understanding of regulatory documents for the person in charge. It also reflected the requirements and considerations under the latest acts and guidelines and explained with examples to make it easier to apply. Starting with this study, further research is needed on the preparation of authorization documents of advanced biopharmaceuticals such as gene therapy and tissue engineering products, which are emerging as innovative treatments in addition to stem cell therapy. I hope that this research will be supplemented in the future to provide advanced biopharmaceuticals developers and regulatory affairs in related industries with convenience in writing common technical documents and lead to rapid commercialization. 난치성 희귀 질환을 포함한 여러 질병의 치료 대안을 제시하는 재생의료 기술 시장은 전 세계적으로 빠르게 성장하고 있는 추세이다. 그 중 줄기세포 기술은 다양한 분야에서 치료법을 제공하고 있으며 전 세계적으로 많은 기업이 개발에 뛰어들고 있다. 이에, 재생의료 및 첨단바이오의약품에 대해 규제적으로 차별화된 안전관리의 필요성이 대두되었고 「첨단재생의료 및 첨단바이오의약품의 안전, 지원에 관한 법률」(약칭: 첨단재생바이오법)이 제정되어 2020년 8월부터 시행되었다. 그러나, 재생의료 기술에 현행 의료법 및 약사법 등의 규제를 적용하는 것에는 한계가 있다. 이는 첨단재생바이오법이 제정된 요인 중 하나로, 재생의료 및 첨단바이오의약품에 대한 평가는 합성의약품의 평가와 다른 접근 방식이 필요하다. 그 중에서도 품목 허가 시 제출되는 CTD 자료는 기존의 합성의약품 중점적으로 양식화 되어 있으며, 첨단재생바이오법의 최신 규격을 반영한 CTD 관련 가이드라인의 발간이 필요한 상황이다. 이에, 첨단바이오의약품 중 중간엽 유래 줄기세포치료제를 기반으로 인허가 담당자의 CTD 품질 자료 작성에 대한 이해를 높이고자 본 연구를 수행하였다. 본 연구는 국내외 규제기관에서 발간된 CTD 해설서 및 ICH 가이드라인 등을 바탕으로 작성하였다. CTD 항목에 대한 세부적인 예시 및 내용은 국내외 세포치료제 품질 관련 가이드라인 및 기허가 제품의 검토의견, 관련 논문을 종합하여 기술한 것이다. 본 연구를 통하여, 기존의 합성의약품 중심의 CTD 작성 방법을 첨단바이오의약품의 특성에 맞도록 재해석함으로써 관련 담당자의 규제기관 허가 자료 작성에 대한 이해를 높이고자 하였다. 또한, 최신의 규정 및 가이드라인에 따라 각 항목에 기재해야 하는 사항 및 고려 사항을 반영하고, 이를 실제 업무에 쉽게 적용할 수 있도록 예시를 들어 설명하였다. 본 연구를 시작으로 중간엽 유래 줄기세포치료제 외에 획기적인 치료법으로 대두되고 있는 유전자 치료제, 조직공학제제 등의 첨단바이오의약품 허가 자료 작성에 대한 연구가 필요할 것이다. 향후 본 연구를 추가, 보완하여 첨단바이오의약품 개발자 및 관련 업계의 인허가 담당자들에게 국제공통기술문서 작성의 편이성을 제공하고 빠른 제품화를 이끄는 기회가 되기를 기대한다.

(The) effects of intra-lesional injection of neural and mesenchymal stem cell and rehabilitation therapy on edogenous neurogenesis and recovery of motor function in motor area corticectomy rat model

이도헌 서울대학교 대학원 2010 국내박사

창상치료를 위한 세포치료제의 개발 및 화상시험법 확립

이동혁 한남대학교 대학원 2014 국내박사

This study was described in five chapter: lecture review, composite skin equivalents for wound healing, multi-phase cell carriers, ASCs differentiation into keratinocytes, and experimental burn methods for the study of burn healing. The first chapter involved a lecture review of tissue engineering and wound healing and a general description of ASCs. The second and third parts described medicines developed for skin wound healing. Chapter 2 Application of a Composite Skin Equivalent using Collagen and Acellular Dermal Matrix as the Scaffold in a Mouse Model of Full-thickness Wound. The aim of this study was to develop a composite human skin equivalent for wound healing. Collagen type1 and acellular dermal matrix powder were utilized as the scaffold with dermal fibroblasts and keratinocytes for the development of a composite human skin equivalent. Fibroblast maintained the volume of composite skin equivalent and also induced keratinocytes to attach and proliferate on the surface of composite skin equivalent. The composite human skin equivalent had a structure and curvature similar to those of real skin. Balb-C nu/nu mice were used for the evaluation of full-thickness wound healing effect of the composite human skin equivalent. Graft of composite skin equivalent on full-thickness wound promoted re-epithelialization and granulation tissue formation at 9 days. Given the average wound-healing time (14 days), the wound in the developed composite skin equivalent healed quickly. The overall results indicated that this three-dimensional composite human skin equivalent can be used to effectively enhance wound healing. Chapter. 3. The application of a multi-phase cell carrier using plasma polymerized surfaces as the scaffold in a mouse model of full-thickness wound. The aim of this study was to develop a cell carrier system for delivery of skin cell to promote wound healing in full thickness wound. We utilized Plasma polymer surface containing 20% carboxylic acid as the cell carrier with human keratinocyte and fibroblast for the development of a multi-phase cell carrier system. Attachment cell morphology and cell migration aspect was observed by scanning electron microscopy. Balb-C nu/nu mice were used for the evaluation of full-thickness wound healing effect of the cell carrier. Graft of cell carrier on full-thickness wound promoted re-epithelialization and granulation tissue formation at 12 days. Given the average wound-healing time (14 days), the wound in the cell carrier healed quickly. The overall results indicated that this cell carrier can be used to effectively enhance wound healing. Chapter. 4 Differentiation of adipose stem cell into keratinocyte in vitro. Adipose tissue contains a large number of adult stem cells(Adipose stem cells:ASCs) with multipotent properties suitable for tissue engineering and regenerative medical applications. ASCs are a heterogeneous population of cells that proliferate in vitro as plastic-adherent cells, have fibroblast-like morphology, form colonies in vitro and can differentiate into mesoderm such as bone, cartilage and fat cells. Recent studies have shown that ASCs can be differentiated into ectoderm lineages. For ASC differentiation, epidermal growth factor and serum-free keratinocyte media were applied to the fibroblast co-culture. As a result, typical surface antigen KRT14 expression of keratinocytes was confirmed. In addition, the high pure isolation was proven using MACs. The completely differentiated cells confirmed not only keratinocyte markers but also weaker ASCs markers. Therefore, it was expected that the allotype-cell therapy medicine would be developed using the ASCs differentiation method. Chapter. 5 Development of the experimental burn methods for induction of progressive burn depth. It is not easy to control and measure the burn depth on in vivo burn model, because burn depth induced by experimental burn depends on the burning method, skill of the experimentor and thickness of the skin. Furthermore, there is little agreement on the method for measuring burn depth. The objective of this study was to develop a standard method for inducing in vivo burn. The induction of burn on the skin of SD rat using three burning methods such as 100℃water, gas torch flame, and hot iron was compared. Hot iron burning method was found to give the linear burn depth when compared with 100℃water or gas torch flame methods at the same application time. The hot iron method (i.e., 100℃ iron) induced a reproducible burn. Furthermore, the feasibility of the burn-induction methods was confirmed for application in research and medical evaluations. 본 논문은 창상치료를 위한 혼합형 인공피부, 실리콘 cell carrier, 지방줄기세포의 각질세포로의 분화 그리고 화상치료 및 연구를 위한 화상유발법 확립에 관한 내용으로 총5부분으로 작성되었다. 1부 에서는 조직공학, 창상치료 그리고 지방줄기세포에 관한 일반적인 내용을 서술 하였다. 2부의 내용은 피부 구성물 중 가장 많이 존재하는 1형 콜라겐을 기본으로 한 창상치료용 인공피부를 개발한 것으로 사람 피부에서 채취한 피부세포와 분쇄한 무세포진피를 적용해 개발하였다. 피부세포는 각질세포와 섬유아세포로 각각 피부의 상피와 진피층에 존재하며 구조 유지 및 창상 치료를 담당한다. 피부세포를 1형 콜라겐으로 제작한 인공피부와 혼합 했을 때 섬유아세포는 인공피부의 부피를 유지하였고 각질세포가 인공피부 표면에서 부착 및 생장이 되도록 유도해 실제 피부와 동일한 구조를 보였다. 분쇄 무세포진피를 인공피부의 진피층에 첨가 후 단면을 확인한 결과 실제 피부와 유사한 구조 및 굴곡을 나타냈다. 치료능을 평가하기 위해 동일한 방식으로 콜라겐 대신 피브리노겐을 사용해 피브린 타입 인공피부를 제작하였다. 콜라겐 인공피부는 9일만에 인공창상의 재상피화를 유도했으며 이는 일반적인 창상치료 기간인 14알보다 빠른 결과이다. 3부는 각질세포를 기본으로 한 창상세포치료제의 개발을 서술하였다. 기존의 각질세포치료제는 창상에 적용후 드레싱 및 시술자의 숙련도에 따라 재현성 없는 치료효과를 나타냈다. 또한 진피형성 전에 각질세포를 처리하여 치료 성공율이 낮았다. 이러한 단점을 해결을 위해 실리콘 cell carrier 에 각질세포와 섬유아세포를 각각 배양 하였으며, 창상부의 진피형성을 위해 섬유아세포를 적용한 후 각질세포를 적용하는 방식의 치료법을 개발 하였다. 인공창상에 적용한 결과 단일세포를 적용한 케이스에 비교해 빠른 창상치료효과가 나타났으며 실제 피부와 유사한 구조로 리모델링되었다. 4부는 줄기세포를 활용해 창상치료 및 자유로운 조직, 기관 재생연구의 기반을 다지기 위해 지방줄기세포 분화를 연구하였다. 일반적으로 중배엽 기원인 지방줄기세포를 같은 배엽 기원인 지방, 근육, 연골, 뼈 등으로 분화를 유도한 연구는 활발하게 진행되었으나 배엽을 넘어선 분화는 아직 많은 연구가 이루어지지 않았다. 분화유도를 위해 지방줄기세포와 섬유아세포의 혼합배양, 상피생장인자와 각질세포전용 무혈청배지를 적용하였다. 그 결과 분화물에서 각질세포의 대표적인 표면 항원인 KRT14 의 발현을 확인 하였으며 MACs 를 활용한 순도 높은 분리도 가능함을 증명하였다. 특이하게도 분화가 완료된 세포에서 각질세포의 특이적 항원뿐만 아니라 약하지만 지방줄기세포의 특이적 항원도 나타났다. 완벽한 분화법 개발 및 분화 후 남은 줄기세포의 특징이 끼치는 재생의학적 가능성의 연구가 필요할 것으로 사료된다. 5부는 인공화상을 유발한 동물모델을 개발한 내용을 서술하였다. 인공화상 유발은 인공창상에 비교해 재현성이 현저하게 떨어져 피부결손 치료제를 개발할 경우 대부분 창상 중심으로 연구가 이루어지며 임상수탁기관에서도 화상치료 검증관련 모델이 없는 경우가 많은 실정이다. 재현성 있는 인공화상 유발을 위해 인두, 열수, 화염 법을 비교해 화상 유발법을 확립하였으며 100℃인두로 1도, 2도, 3도 화상을 재현성 있게 유발시킬 수 있었다. 또한 화상조직의 자연치유, 세포치료제 적용을 통해 연구 및 치료제 평가용 인공화상유발법으로서의 가능성을 확인 하였다.