Nesfatin-1: Investigating its expression and functional role in mouse reproductive organs

선소정 서울여자대학교 일반대학원자연계열 2024 국내박사

NUCB2/nesfatin-1 has been known to be expressed in the hypothalamus, playing a role in the regulation of energy metabolism and appetite. Recent studies have revealed its expression has been identified in various organs in addition to the hypothalamus, suggesting diverse physiological functions. However, the precise mechanisms of action and functions in each organ remain poorly understood. In this study, the expression of NUCB2/nesfatin-1 was investigated in the pituitary gland and reproductive organs of mice, including the ovary, uterus, oviduct, testis, and epididymis, aiming to elucidate its functions. First, the expression of NUCB2/nesfatin-1 in the pituitary gland was confirmed in male and female mice. Subsequently, in castrated mice, the expression of Nucb2 mRNA in the pituitary gland, which had decreased following the procedure, was found to increase due to testosterone. Similarly, in ovariectomized mice, the decrease in Nucb2 mRNA expression in the pituitary gland was observed to be restored by administering estradiol (E2) and progesterone (P4). This demonstrates that each sex steroid hormone directly regulates Nucb2 mRNA expression in the pituitary gland. Moreover, using GH3 pituitary cell line, lacto-somatotrophs in the pituitary gland, it was confirmed that treatment with nesfatin-1 and simultaneous treatment with E2 led to an increase in the mRNA expression of growth hormone (GH) and prolactin (PRL). These results suggest that the hypothalamus-pituitary-gonad axis, which regulates reproductive functions in mice, can also modulate the expression of NUCB2/nesfatin-1 in the pituitary gland. This modulation may potentially impact the production of growth hormone and prolactin. Next, the expression of NUCB2/nesfatin-1 was examined in the reproductive organs of male and female mice. Specifically, variations in expression were observed in the female reproductive organs, including the ovary, uterus, and oviduct, across the estrous cycle, with the highest expression of Nucb2 mRNA and nesfatin-1 protein during estrus phase. Administration of the PMSG, like a gonadotropin, increased Nucb2 mRNA expression in the female reproductive organs; however, in the uterus and oviduct post-ovariectomy, only E2, not PMSG, elevated the decreased expression of Nucb2 mRNA. In male mice, administration of PMSG and hCG increased NUCB2/nesfatin-1 expression in both the testis and epididymis, but in the epididymis post-castration, only testosterone, not PMSG and hCG, restored the decreased Nucb2 mRNA expression. These results indicate that estradiol and testosterone directly regulate the expression of NUCB2/nesfatin-1 in the reproductive organs of both male and female mice. Furthermore, strong expression of NUCB2/nesfatin-1 was observed in Leydig cells of the testes and their cell line TM3 cells, and treatment with nesfatin-1 led to increased expression of enzymes involved in steroid hormone production in these cells. This suggests that NUCB2/nesfatin-1 expressed in Leydig cells may influence steroid hormone production. In this study, it was confirmed that NUCB2/nesfatin-1 produced in the pituitary gland and reproductive organs regulates the secretion of growth hormone and prolactin in the pituitary gland via autocrine mechanism. Additionally, NUCB2/nesfatin-1 played a role in the production of sex steroid hormones in the reproductive organs. Moreover, NUCB2/nesfatin-1 may serve as a crucial local regulator in various reproductive and physiological functions, such as fertilization, implantation, pregnancy, embryogenesis, spermatogenesis, and sperm maturation, through the hypothalamus-pituitary-gonad axis. NUCB2/nesfatin-1은 시상하부에서 발현하면서 식욕과 에너지 대사를 조절하는 것으로 잘 알려져 있으며 최근 연구에서는 시상하부 이외에도 체내 다양한 기관에서 nesfatin-1이 발현하면서 다양한 생리적 기능을 하는 것으로 밝혀졌다. 그러나 아직까지 각 기관에서의 정확한 작용 기전과 기능에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 이에 본 연구에서는 생쥐의 뇌하수체와 생식 기관인 난소, 자궁, 난관, 정소, 부정소에서 NUCB2/nesfatin-1 발현을 조사하고 그 기능을 확인했다. 먼저 수컷과 암컷 생쥐의 뇌하수체에서 NUCB2/nesfatin-1의 발현을 확인했다. 이후 수컷 생쥐에서는 정소 절제술 이후 testosterone에 의해, 암컷 생쥐에서는 난소 절제술 이후 에스트라디올(E2)과 프로게스테론 (P4)에 의해, 절제술 이후 감소되었던 뇌하수체에서의 Nucb2 mRNA 발현이 다시 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 각각의 성 스테로이드 호르몬이 뇌하수체에서의 Nucb2 mRNA 발현을 직접적으로 조절한다는 것을 입증하였다. 또한, 뇌하수체의 성상자극세포주인 GH3 세포를 사용하여 nesfatin-1 처리 및 E2와의 동시처리 후 성장호르몬과 프로락틴의 mRNA 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 생쥐에서 생식기능을 조절하는 시상하부-뇌하수체-생식선 축이 뇌하수체의 NUCB2/nesfatin-1 발현도 조절할 수 있으며 이는 성장호르몬과 프로락틴 생성에도 영향을 미칠 수 있음을 제시한다. 다음으로, 수컷과 암컷 생쥐의 생식 기관에서 NUCB2/nesfatin-1의 발현을 확인하였다. 특히 암컷 생식 기관인 난소, 자궁, 난관에서 발정 주기에 따라 발현에 변화가 있었고, 특히 발정기에 Nucb2 mRNA와 nesfatin-1 단백질 발현이 가장 높은 것을 확인하였다. 생식소자극호르몬인 PMSG 투여에 의해 암컷 생식 기관에서의 Nucb2 mRNA 발현이 증가하는 것을 확인하였으나, 난소 절제술 이후의 자궁과 난관에서는 PMSG가 아닌 E2만이 절제술로 인해 감소되었던 Nucb2 mRNA 발현을 증가시켰다. 수컷 생쥐에서도 PMSG와 hCG 투여에 의해 정소와 부정소에서 NUCB2/nesfatin-1 발현이 증가하였으나, 정소 절제술 이후의 부정소에서는 PMSG와 hCG가 아닌 테스토스테론만이 절제술 이후 감소되었던 Nucb2 mRNA 발현을 증가시켰다. 이러한 결과는 에스트라디올과 테스토스테론이 암컷과 수컷 생쥐의 생식기관에서 NUCB2/nesfatin-1 발현을 직접적으로 조절함을 의미한다. 뿐만 아니라 정소의 라이디히 세포와 그 세포주인 TM3 세포에서도 NUCB2/nesfatin-1이 강하게 발현하였으며 nesfatin-1을 처리하였을 때 각 세포에서 스테로이드 호르몬 생성에 관여하는 효소의 발현이 증가하였다. 이러한 결과는, Leydig 세포에서 발현되는 NUCB2/nesfatin-1이 스테로이드 호르몬 생성에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 본 연구에서는, 뇌하수체 및 생식기관에서 생성되는 NUCB2/nesfatin-1이 자가분비 조절 방식을 통해 뇌하수체에서 성장호르몬과 프로락틴 생성을 조절하고 생식기관에서 성 스테로이드 호르몬 생성에 관여한다는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 NUCB2/nesfatin-1이 시상하부-뇌하수체-생식선 축을 통해 수정과 착상, 임신, 배아 발달, 정자 형성 및 성숙 등의 다양한 생식∙생리적 기능에 중요한 국부조절인자로서 역할을 할 수 있음을 시사한다.

호랑가시나무 잎 추출물/분획 및 성분의 화장품 원료로서의 효능과 유효성분을 담지한 탄성 리포좀의 제형 연구

오초희 서울여자대학교 일반대학원자연계열 2024 국내석사

The holly tree (Ilex cornuta Lindl. & Paxton) is an evergreen small tree in the persimmon family, widely distributed in Korea and southern China. Its leaves have traditionally been used in folk medicine to treat ailments such as rheumatism. The leaves of holly contain triterpenoids, flavonoids, and their glycosides, which have been reported to have antioxidant and anticancer effects. In this study, holly leaf extracts and fractions were prepared to investigate their antioxidant, anti-inflammatory, and tyrosinase inhibitory activities (whiteness), and the active ingredients in the extracts were isolated and identified to determine their potential application as cosmetic ingredients. Next, deformable liposomes containing holly leaf extracts/fractions and active ingredients were prepared, and the stability of the liposomes and skin absorption of the active ingredients were checked to determine whether holly leaf extracts/fractions and active ingredients have the potential to show their efficacy in the skin. The 50% ethanolic extract, ethyl acetate fraction and aglycone fraction of holly leaves were prepared and evaluated for their antioxidant capacity. The radical scavenging activity (FSC50) using 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) was 14.25 µg/mL, 2.63 µg/mL, and 1.89 µg/mL for the 50% ethanol extract, ethyl acetate fraction, and aglycone fraction, respectively, which all showed significant antioxidant activity, especially the aglycone fraction showed the greatest antioxidant capacity. Anti-inflammatory evaluation was performed on NO radical production in lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW 264.7 cells, and the 50% ethanolic extract, ethyl acetate fraction, and aglycone fraction all inhibited NO radical production in a concentration-dependent manner in the range of 50 to 200 µg/mL. In terms of tyrosine-based tyrosinase inhibitory activity, the 50% ethanol extract, ethyl acetate fraction, and aglycone fraction all exhibited concentration dependence, with the aglycone fraction exhibiting the greatest tyrosinase inhibitory activity (IC50, 63.29 µg/mL). To enhance the dermal absorption of holly leaf extracts / fractions or main components, 10 liposomes loaded with fractions / main components were prepared. In the stability evaluation of liposomes measured by liposome size and entrapment efficiency during a period of 4 weeks, liposomes loaded with ethyl acetate fraction, DLE-2 (lecithin : edge activator = 90 : 10), and quercetin loaded liposomes DLQ-2 (90 : 10) and DLQ-3 (85 : 15) were selected as the most stable formulations. Variable deformability measurements showed that the DLE(Q)-2 formulation was the most favorable; therefore, the optimal formulation conditions were identified for the DLE(Q)-2 formulation. In vitro skin permeation experiments were conducted using this deformable liposome formulation and classical liposomes as a control. The skin penetration of the active ingredient was higher with deformable liposomes than with classical liposomes. Including the stability of the liposomes, DLE(Q)-2 showed great potential for application in cosmetics as an optimized formulation that can effectively deliver the active ingredients of holly leaf extract to the skin to enhance its efficacy.

화장품소재로서 신나무 잎 추출물의 효능과 유효 성분 함유 탄성 리포좀의 물리화학적 특성 연구

정지원 서울여자대학교 일반대학원자연계열 2024 국내석사

This study measured the antioxidant activity, cytoprotective effects against reactive oxygen species, skin whitening effects, anti-inflammatory activity, and antimicrobial activity of Acer ginnala (A. ginnala) leaf extract and fractions. In addition, to improve the skin penetration ability of the extract, elastic liposomes were prepared using polyglyceryl-10 stearate (PS) as an edge activator, and their physicochemical properties were investigated. The antioxidant activity was evaluated using the ABTS and DPPH assays, and the free radical scavenging activity (FSC50) of the ethyl acetate (EtOAc) fraction showed the highest antioxidant activity at 12.50 µg/mL in both assays. In H2O2-induced HaCaT cell damage, the EtOAc fraction showed concentration-dependent cytoprotective activity in the range of 50 to 200 µg/mL, and at 200 µg/mL, cell viability increased to 125%. Regarding NO production induced by lipopolysaccharie (LPS) in RAW 264.7 cells, all extracts and fractions inhibited NO production in a concentration-dependent manner in the range of 1∼20 µg/mL. Among these, the EtOAc fraction showed the greatest NO production inhibition effect. In the mushroom tyrosinase inhibition assay, the EtOAc fraction showed superior inhibitory activity compared to the whitening agent arbutin. As a result of measuring the antibacterial activity against skin flora, the aglycone fraction had a minimum inhibitory concentration (MIC) value of less than 500 µg/mL for all strains used in the experiment, showing very high antibacterial activity. Based on these results, elastic liposomes containing the most effective EtOAc fraction were prepared. These elastic liposomes were prepared in five formulations depending on the ratio of phospholipid (lecithin, 0.5 w/v%) and PS content (0 to 0.1 w/v%; AECL1, AEEL2-5). The physical properties (particle size, zeta potential, storage stability, entrapment efficiency, and deformability index) and in vitro skin penetration ability of these elastic liposomes were evaluated. Elastic liposomes containing the EtOAc fraction of A. ginnala extract showed constant particle size without being affected by surfactant concentration. Among the five formulations, AEEL3 with a particle size of 85.32 nm, zeta potential of -32.77 mV, entrapment efficiency of 80.2%, and deformability index of 8.2 was selected as the optimal elastic liposome formulation. The in vitro skin penetration ability of the selected optimal formulation AEEL3 showed better skin permeability compared to conventional liposomes and the control group (1,3-BG) in the order of elastic liposomes > conventional liposomes > control group. These results indicate that the A. ginnala extract has excellent antioxidant activity, cytoprotective effects, skin whitening, anti-inflammatory, and antimicrobial activities, and elastic liposomes prepared using polyglyceryl-10 stearate can be used as a useful skin delivery vehicle to enhance the skin penetration of A. ginnala leaf extract.

Cellular uptake and organelle trafficking of GV1001 in cancer cells and normal cells

황지혜 서울여자대학교 일반대학원자연계열 2024 국내석사

hTERT에서 유래된 GV1001은 다중기전을 갖는 16-mer의 짧은 펩타이드 약물이다. GV1001은 질환의 종류에 따라 작용기전이 다르게 나타난다. GV1001이 전립선비대증 치료제로 사용되는 경우에는 GV1001이 세포 내로 유입된 뒤, cytosol에서 effector protein으로 작용해 전립선 비대증을 완화시킨다. GV1001이 전립선암 치료제로 사용되는 경우에는 전립선 암세포의 membrane에 있는 GnRHR (Gonadotropin releasing hormone receptor)에 리간드로서 작용해 signal transduction을 일으키는 기전으로 항암 효과를 나타낸다. 또한 GV1001이 면역항암치료제로 사용되는 경우에는 면역 시스템을 활성화시키는 기전으로 항암 효과를 나타낸다. 따라서 signal transduction만 유도하는 경우에는 세포 내로 유입되지 않는지, 세포 내로 유입되는 경우에는 signal transduction을 유도하지 않는지 확인이 필요하다. GV1001은 다중기전을 갖기 때문에 세포 종류에 따른 signal transduction을 모두 살펴보기는 어렵다. 따라서 본 논문에서는 세포에 FITC가 표지된 GV1001을 처리한 뒤, 세포의 종류에 따른 GV1001의 유입 및 흡수에 중점을 두고 연구를 진행하였다. 본 연구에서는 quantitative real time PCR을 통해 확인한 GnRHR 발현양과 세포주의 특징을 바탕으로 하여 서로 다른 특징을 갖는 3가지 세포를 사용했다. 췌장암세포로는 BxPC-3, 전립선 암세포로는 LNCap, 전립선 기질세포로는 WPMY-1 세포를 사용하였다. GV1001-FITC의 세포흡수는 confocal laser scanning microscopy와 flow cytometry를 통해 확인되었다. flow cytometry를 통해 세포 흡수 비율이 정량되었다. Confocal laser scanning microscopy를 통한 live cell imaging으로 세포 내에서 GV1001-FITC의 거시적인 특징을 관찰했다. 뿐만 아니라 세포로 흡수된 GV1001과 세포 소기관과의 localization 및 상관성도 Confocal laser scanning microscopy를 통해 분석되었다. BxPC-3, LNCap, WPMY-1이라는 3가지 세포주를 선택한 후, GV1001이 각 세포의 생존률이나 증식에 미치는 영향을 비교하고 각 세포에 대한 GV1001의 유효농도를 파악하였다. BxPC-3에 0 μM, 1 μM, 10 μM, 100 μM 농도로 GV1001을 처리했을 때 cell viability에 소폭의 증감이 확인되었다. 하지만 모든 농도에서 증감의 비율이 10% 이내로 나타났기 때문에 GV1001은 BxPC-3의 cell viability에 영향을 미치지 못함이 확인되었다. 모든 농도에서 증감의 비율이 10% 이내로 나타나고 cell viability에 영향을 미치지 못하는 경향성은 BxPC-3뿐만 아니라 LNCap, WPMY-1에서도 동일하게 관찰되었다. 따라서 GV1001은 대부분의 농도에서 세포독성을 보이지 않기 때문에 비교적 안전한 약물이며, 유효농도가 뚜렷하게 나타나지 않는 농도-비의존적이고 약물이라고 할 수 있다. 본 연구에서는 GV1001의 세포흡수에 초점을 맞춰 연구를 진행하고자 했기 때문에 약물 처리농도를 비독성인 임의의 농도 10 μM로 설정하였다. GV1001의 세포흡수와 관련해 GnRHR와의 연관성도 확인하였다. GV1001은 GnRH 리간드와 구조적 유사성을 갖기 때문에 GnRHR이 GV1001의 세포흡수에 관여할 가능성에 대해 확인하였다. GnRH agonist인 Triptorelin accetate와 GnRH antagonist인 Cetrorelix acetate를 전처리하여 일시적으로 GnRHR의 작용을 차단한 뒤, GV1001-FITC의 흡수량을 정량하였다. GnRHR 발현양이 높은 BxPC-3, LNCap의 경우는 Triptorelin accetate와 Cetrorelix acetate를 전처리한 그룹 모두에서 GV1001의 흡수가 55% 이상 저해되었다. 반면, GnRHR 발현양이 매우 낮은 WPMY-1의 경우는 세포 내로 흡수되는 GV1001의 양이 GnRH analaogue에 의해 10~15% 정도 감소했다. 즉, GnRHR 차단에 의한 GV1001 흡수량 감소는 세포의 GnRHR 발현양에 비례한다. 이는 GnRHR이 GV1001의 세포흡수를 매개함을 시사한다. 처리시간을 다르게 하여 세포에 GV1001-FITC를 처리한 결과 BxPC-3, LNCap, WPMY-1 모두에서 대부분의 GV1001-FITC가 vesicle의 형태로 유입되고 대사됨이 확인되었다. Flow cytometry로 GV1001-FITC의 형광 강도를 정량해보면 BxPC-3의 경우는 GV1001-FITC를 처리하고 3시간이 경과한 시점, WPMY-1은 9시간이 경과한 시점에 가장 높은 강도를 보이며 이후 빠르게 분해되고 배출되는 양상을 보인다. 이와 비교해 LNCap은 GV1001-FITC를 처리하고 24시간이 경과한 시점까지 형광 강도가 감소하지 않으며 증가 및 유지되는 양상을 보인다. 이는 세포의 종류에 따라 GV1001-FITC가 세포 내에서 성숙, 분해 및 배출되는 속도가 다양하게 나타남을 시사한다. 세포 내로 유입된 후 GV1001-FITC의 이동을 확인하기 위해 GV1001-FITC가 전처리된 세포를 organelle tracker로 염색해 공동국소화 여부와 정도를 파악했다. GV1001-FITC는 mitochondria, endoplasmic reticulum, lysosome과 모두 공동국소화됨이 확인되었으며 이는 BxPC-3, LNCap, WPMY-1 모든 세포에서 동일하게 관찰되었다. GV1001-FITC가 각 세포소기관과 공동국소화를 이루는 정도를 Pearson's correlation coefficient로 정량해본 결과 수치가 모두 다르게 나타났지만 모든 세포에서 lysosome과의 상관성이 가장 높게 나타났다. 이는 GnRHR을 통해 세포 내로 유입된 GV1001이 mitochondria와 endoplasmic reticulum 모두에서 작용한 뒤, 대부분 lysosome을 통해 분해 및 배출됨을 시사한다. 오늘날 GnRHR가 ligand와 결합한 receptor-ligand complex 상태로 receptor-mediated endocytosis되는 기전을 활용해 새로운 drug-delivery system이 개발되고 있다. 본 연구는 GV1001의 새로운 유입기전을 확인했을뿐만 아니라 GV1001을 활용해 다른 약물도 세포 내로 흡수시킬 수 있는 가능성을 제시한다. GV1001, derived from hTERT, is a 16-mer short peptide drug with multiple mechanisms. GV1001 has different mechanisms of action depending on the type of disease. When used as a treatment for benign prostatic hyperplasia, GV1001 is taken up by cells and acts as an effector protein in the cytosol to alleviate benign prostatic hyperplasia. When used as a treatment for prostate cancer, GV1001 acts as a ligand for GnRHR (gonadotropin releasing hormone receptor) on the membrane of prostate cancer cells and induces an anti-cancer effect through a signal transduction mechanism. In addition, when GV1001 is used as an immunotherapy, it has anti-cancer effects through a mechanism that activates the immune system. So if it is just inducing signal transduction, it is necessary to confirm that it is not getting into the cell, and if it is getting into the cell, it is necessary to confirm that it is not inducing signal transduction. Because GV1001 has multiple mechanisms, it is difficult to study all the signal transduction depending on the cell type. Therefore, in this thesis, cells were treated with FITC-labelled GV1001 and then research was carried out focusing on the influx and uptake of GV1001 depending on the type of cell. In this study, three types of cells with different characteristics were used based on the GnRHR expression level confirmed by quantitative real-time PCR and the characteristics of each cell line. BxPC-3 cells were used as pancreatic cancer cells, LNCap cells were used as prostate cancer cells, and WPMY-1 cells were used as prostate stromal cells. Cellular uptake of GV1001-FITC was confirmed by confocal laser scanning microscopy and flow cytometry. Cellular uptake rates were quantified by flow cytometry. Macroscopic features of GV1001-FITC within cells were observed by live cell imaging using confocal laser scanning microscopy. In addition, the localization and correlation between GV1001 taken up into cells and cell organelles was analysed using confocal laser scanning microscopy. After selecting three cell lines, BxPC-3, LNCap and WPMY-1, the effect of GV1001 on the survival rate and proliferation of each cell was compared and the effective concentration of GV1001 for each cell was determined. When BxPC-3 was treated with GV1001 at concentrations of 0 μ M, 1 μM, 10 μM and 100 μM, a slight increase or decrease in cell viability was confirmed. However, as the rate of increase or decrease was within 10% at all concentrations, it was confirmed that GV1001 did not affect the viability of BxPC-3 cells. The rate of increase or decrease was within 10% at all concentrations and the tendency not to affect cell viability was observed not only in BxPC-3 but also in LNCap and WPMY-1. Therefore, GV1001 is a relatively safe drug as it does not show cytotoxicity at most concentrations and it can be said to be a concentration-independent drug with no clear effective concentration. Since the purpose of this study was to focus on the cellular uptake of GV1001, the drug treatment concentration was set to 10 μM, an arbitrary non-toxic concentration. Regarding the cellular uptake of GV1001, an association with GnRHR was also confirmed. Since GV1001 has structural similarity to the GnRH ligand, the possibility that GnRHR is involved in the cellular uptake of GV1001 was confirmed. After temporarily blocking the action of GnRHR by pretreatment with triptorelin accetate, a GnRH agonist, and cetrorelix acetate, a GnRH antagonist, the uptake of GV1001-FITC was quantified. In the case of BxPC-3 and LNCap with high GnRHR expression, the uptake of GV1001 was inhibited by more than 55% in both groups pre-treated with triptorelin accetate and cetrorelix acetate. On the other hand, in the case of WPMY-1, which has very low GnRHR expression, the amount of GV1001 absorbed into cells was reduced by about 10 to 15% by GnRH analogue. In other words, the reduction in GV1001 uptake by blocking GnRHR is proportional to the level of GnRHR expression in the cell. This suggests that GnRHR mediates the cellular uptake of GV1001. As a result of treating cells with GV1001-FITC at different treatment times, it was confirmed that most of the GV1001-FITC was imported and metabolized in the form of vesicles in all BxPC-3, LNCap and WPMY-1. The fluorescence intensity of GV1001-FITC was quantified using flow cytometry. BxPC-3 shows the highest intensity 3 hours after treatment with GV1001-FITC, and WPMY-1 shows the highest intensity 9 hours after treatment. The fluorescence intensity rapidly decomposes and is released after it peaks. In comparison, the fluorescence intensity of LNCap does not decrease until 24 hours after processing GV1001-FITC, but increases and remains stable. This indicates that the rates at which GV1001-FITC matures, decomposes, and is released within cells vary depending on the cell type. To confirm the movement of GV1001-FITC after entering the cells, cells pretreated with GV1001-FITC were stained with an organelle tracker to determine the presence and extent of colocalization. GV1001-FITC was confirmed to colocalize with mitochondria, endoplasmic reticulum, and lysosomes, and this was equally observed in all BxPC-3, LNCap, and WPMY-1 cells. When quantifying the degree of co-localization of GV1001-FITC with each organelle using Pearson's correlation coefficient, it was found that the correlation with lysosomes was the highest in all cells. This suggests that GV1001, which enters the cell through GnRHR, affects both mitochondria and endoplasmic reticulum before being mostly decomposed and released through lysosomes. A new drug-delivery system is currently being developed by utilizing the mechanism of receptor-mediated endocytosis. This involves the formation of a receptor-ligand complex bound to a ligand, with GnRHR playing a key role in the process. This study not only confirmed the new uptake mechanism of GV1001, but also suggests the possibility of using GV1001 to absorb other drugs into cells.

Deep Learning Model with Tumor-Guided Attention for the Prediction of Prostate Cancer Aggressiveness in Multiparametric MR Images

김윤조 서울여자대학교 일반대학원자연계열 2024 국내석사

Development of genetic methods for edible pufferfish identification at species levels

김건희 서울여자대학교 일반대학원자연계열 2024 국내석사

Pufferfish, renowned for their culinary value and as a vital fishery resource in Asia, have recently emerged as a public health concern due to the risks of tetrodotoxin (TTX) poisoning from mislabeled or improperly processed products. Given the rapid speciation of pufferfish, which complicates genomic identification, and the restriction to only 21 edible species in South Korea, there is an urgent requirement for accurate species-level identification methods. This study is divided into two main parts, each addressing a critical aspect of pufferfish identification and safety. In the first part of this study, a systematic approach was developed to identify pufferfish based on DNA barcoding method, employing a combination of genetic markers including cytochrome oxidase subunit I (CoI), cytochrome b (Cytb), 16S ribosomal RNA, and rhodopsin genes. Among these, CoI and Cytb showed superior resolution in distinguishing species. To identify Takifugu species that are not identified by this method, simple sequence repeat markers were also employed. This integrated approach allowed us to systematically identify and authenticate a total of 11 pufferfish species, including T. niphobles, T. poecilonotus, T. pardalis, T. vermicularis, T. porphyreus, T. xanthopterus, T. stictonotus, Lagocephalus cheesemanii, L. lagocephalus, L. spadiceus, and Sphoeroides pachygaster. Applying this approach to 73 commercial pufferfish products revealed a high mislabeling rate (60.3%), underscoring the need for improved regulatory measures in the South Korea markets. The second part of the study focused on differentiating cultured T. rubripes from its wild relatives of T. rubripes, T. pseudommus, T. chinesis, and T. xanthopterus. Takifugu rubripes, T. pseudommus, and T. chinesis was not identified at species level in part Ⅰ due to its high genetic similarities and are considered the same species by previous studies. The differentiation is particularly vital as cultured T. rubripes are preferred by consumers for their TTX-free nature, and command a higher market price due to the costs associated with their cultivation. Through whole genome sequencing of wild T. pseudommus and comparative analysis with the reference T. rubripes genome (fTakRub1.2) from National Center for Biotechnology Information, a total of 297 in-silico deletions exceeding 1 kb were identified. Utilizing 55 deletion-specific primer sets, the combination of four primer sets were able to successfully differentiated cultured T. rubripes from the wild T. rubripes. These primer sets were also applied to the multiplex ultrafast quantitative real-time polymerase chain reaction system which can identify within 30 min. This research significantly advances the understanding of pufferfish genetics and public health by introducing a genome-based species identification method. The findings are crucial for ensuring accurate edible pufferfish species identification, enhancing consumer safety, and maintaining market authenticity. 복어는 아시아에서 중요한 수산 자원으로, 테트로도톡신이라는 신경독을 포함하고 있어 한국에서는 식용 가능 복어를 21종으로 엄격히 규제하고 있다. 이러한 식용 복어의 판별은 형태학적인 특징을 기반으로 이루어진다. 복어의 경우 급속한 종 분화로 인해 형태학적 및 유전적으로 매우 유사한 근연종이 많이 존재한다. 최근 수입 및 가공 복어 제품 증가에 따라 전통적인 분류 방법으로 식용 가능 21개 복어종을 정확히 판별하기는 어려우며, 이를 보완하기 유전체 기반의 판별법이 필요한 실정이다. 본 연구의 Part I에서는 식용 가능 복어의 종 판별을 위해 미토콘드리아, 핵 DNA 및 단순반복염기서열 마커 분석법에 기반한 체계적인 분석법을 개발했다. 이를 통해 11종의(Takifugu niphobles, T. poecilonotus, T. pardalis, T. vermicularis, T. porphyreus, T. xanthopterus, T. stictonotus, Lagocephalus cheesemanii, L. lagocephalus, L. spadiceus, and Sphoeroides pachygaster) 복어종 판별이 가능했다. 또한 개발된 분석법을 사용해서 73개의 유통 복어 제품의 사용원재료 모니터링을 수행하였으며, 60.3%의 높은 허위표시 비율이 확인되었다. Part II에서는 형태학적으로는 구별이 가능하나, Part I에서 유전적으로 구별할 수 없었던 자주복, 참복, 흰점참복을 대상으로 추가 연구를 진행하였다. 흰점참복의 전장유전체 분석 및 자주복 참조 유전체와의 비교를 통해, 1 kb 이상의 흰점참복 결손 부위 297개를 찾았다. 그 중, 55개의 결손부위 특이 프라이머를 설계하였으며, PCR 결손 검증과정을 통해 양식 및 자연산 자주복 판별이 가능한 프라이머 조합을 개발하였다. 또한 해당 프라이머를 multiplex ultrafast qPCR에 적용하여 30분 만에 양식 자주복을 자연산 자주복, 흰점참복, 참복, 그리고 까치복과 구분할 수 있었다. 이러한 복어 종 판별 및 양식 자주복 판별법은 소비자의 안전과 시장의 신뢰성을 향상시키는데 기여할 수 있다.

The effects of calorie restriction and intermittent fasting on muscle mass and function in obese mice

양유라 서울여자대학교 일반대학원자연계열 2024 국내석사

비만은 체내에 지방 조직이 비정상적으로 축적된 상태로, 건강을 위협할 수 있다. 비감염성 질환의 위험을 초래하는 비만은 현재 세계적으로 중요한 공중보건 문제로 대두되고 있다. 근감소증은 노화가 진행되면서 나타나는 근육량과 근력의 상실을 의미하며, 노인에서 흔히 나타나는 질환이다. 근육의 감소는 신체기능을 변화시켜 삶의 질을 낮추고 사망률을 증가시킨다. 최근에는 다양한 연령대에서 비만이 증가함에 따라 노인 뿐만 아니라 성인에서도 비만에 의한 근감소증이 늘어나는 추세이다. 또한, 비만에 의해 나타날 수 있는 근육 내 지질 침착과 근육 섬유화는 근육의 기능과 대사를 악화시켜 근육의 질을 저하시킨다. 건강한 삶을 유지하기 위해서는 근육을 유지하고 손실을 최소화하는 것이 필수적이다. 열량 제한식은 전반적인 섭취 열량의 30~40%를 제한하고, 간헐적 단식은 제한된 시간 또는 기간 동안 공복을 유지하는 식이 중재 방법이다. 열량 제한식과 간헐적 단식의 중재가 근육에 미치는 영향에 대한 연구가 이루어지고 있으나, 비만에서 근위축과 근육의 질에 미치는 영향과 그 기전에 대한 연구는 부족한 실정이다. 따라서 본 연구는 열량 제한식과 간헐적 단식이 비만 마우스 모델에서 근육량 및 근기능에 미치는 영향과 그에 대한 기전을 조사하고자 하였다. 6주령의 마우스 모델을 1주간 적응시킨 후, 8주 동안 고지방식이를 공급하여 비만을 유도하였다. 비만이 유도된 마우스 모델을 무작위로 비만군, 섭취 열량의 30%를 제한하는 열량 제한군, 하루의 16시간 동안 공복을 유지하는 간헐적 단식군으로 나누어 6주간 각 군의 조건에 맞게 고지방식이를 공급하였다. 모든 개체를 희생하기 전에 경구포도당내성검사, 악력 검사를 시행하였다. 부검을 통해 수집된 근육 조직은 조직학적 분석을 위해 H&E와 Masson’s trichrome으로 염색하거나, 유전자 발현 분석에 사용하였다. 비만군은 대조군과의 유의적인 체중 차이를 보였고, 근육량과 악력 및 근섬유 단면적이 감소하는 등 근육 위축과 기능장애를 보였다. 6주간의 열량 제한식과 간헐적 단식 중재를 시행하였을 때, 유의하게 체중이 감소되었고, 혈당조절능력이 개선되었다. 중재군의 공복 혈당은 다소 높았지만, 포도당 주입 후에는 비만군 대비 혈당 증가 폭이 낮았으며, 혈당 반응 곡선 아래 면적 또한 유의하게 감소함을 확인하였다. 열량 제한군과 간헐적 단식군은 비만군에 비해 근육 백분율과 악력이 유의미하게 높았다. 또한, 열량 제한군은 비만군보다 허벅지 근육 섬유의 단면적이 유의미하게 증가하였다. 이는 열량 제한식과 간헐적 단식이 근육량과 근육 강도의 저하를 보호할 수 있음을 의미한다. 자세한 기전을 확인하기 위해 근육 단백질 항상성에 기여하는 소포체 스트레스와 유비퀴틴-프로테아좀 시스템과 관련한 지표를 분석하였다. 열량 제한식이 비만 마우스에서 소포체 스트레스와 단백질 분해 기전 관련 유전자 발현을 억제함을 알 수 있었다. 본 연구 결과는 비만 마우스 모델에서 열량 제한식과 간헐적 단식이 체중 감량에 효과적이며, 동시에 근육량과 근기능을 보존한다는 것을 입증하였다. 이는 열량 제한식과 간헐적 단식이 비만에서 근육량과 근기능을 보존하고 근육의 질을 유지하기 위한 영양 섭취 전략으로 적용될 수 있음을 시사한다.

The effects of ketogenic diet and beta-hydroxybutyrate supplementation on kidney function in diabetic mice

송지원 서울여자대학교 일반대학원자연계열 2024 국내석사

당뇨병은 인슐린을 충분히 생산하지 못하거나 인슐린에 정상적으로 반응하지 못하여 혈당이 비정상적으로 높아지는 대사 질환으로, 지속적인 고혈당증은 눈, 신장, 신경계, 심혈관계 및 기타 전신 조직을 손상시켜 합병증을 유발한다. 당뇨병성 신장 질환은 말기 신장 질환의 가장 흔한 원인이며 이로 인해 환자들의 삶의 질이 낮아지고 사망률이 증가하므로 당뇨병성 신장 질환의 진행을 억제하거나 개선하는 것이 필요하다. 신장 간질에서 세포외 기질 단백질의 과도한 생성 및 침착을 특징으로 하는 신장 섬유증은 신장 질환에서 나타나는 병리학적 변화이며, 이는 신장의 정상적인 구조와 기능을 손상시킨다. 최근 연구에 따르면 케톤생성식이와 베타-하이드록시뷰티레이트 보충이 신장 기능 장애를 개선시켰다. 그러나 케톤생성식이와 베타-하이드록시뷰티레이트 보충이 당뇨병 유도 쥐 모델의 신장 기능과 섬유증에 미치는 영향에 대한 연구는 부족하다. 따라서, 본 연구는 케톤생성식이와 베타-하이드록시뷰티레이트 보충이 당뇨병 쥐의 신장 기능과 섬유증에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. C57BL/6J 쥐를 일주일 동안 환경에 적응시킨 후 표준식이를 섭취하는 대조군과 고지방식이를 섭취하는 실험군으로 나누었다. 4주차에 실험군에게 니코틴아마이드와 스트렙토조토신을 복강으로 주입하였다. 8주차에 당뇨병 상태가 유도된 동물모델을 당뇨병군, 케톤생성식이군, 베타-하이드록시뷰티레이트군, 케톤생성식이와 베타-하이드록시뷰티레이트를 같이 제공한 군으로 나누었다. 실험 동물을 희생하기 전에 경구당부하검사와 혈중 케톤 농도 검사를 시행하였고, 소변, 신장, 그리고 혈액을 수집하여 후속 분석에 사용하였다. 실험 결과, 당뇨병군의 혈당은 케톤생성식이의 공급에 의해 개선되었으나, 베타-하이드록시뷰티레이트군은 당뇨병군과 혈당 값의 유의한 차이가 없었다. 케톤생성식이와 베타-하이드록시뷰티레이트의 보충은 동물모델의 신장과 혈청의 중성지방 농도를 증가시키지 않고 생리학적 케 토시스를 유도하였다. 소변 알부민-크레아티닌 비율을 이용하여 당뇨병군에서 신장 기능 장애를 확인하였다. 케톤생성식이와 베타-하이드록시뷰티레이트를 공급한 모든 군에서는 당뇨병군보다 신장 기능 장애가 유의하게 개선되었다. 또한, 신장 콜라겐 면적의 정량화 분석을 통해 당뇨병군에서의 신장 섬유증을 확인하였다. 베타-하이드록시뷰티레이트군에서는 당뇨병군에 비해 신장 콜라겐 면적이 유의하게 감소하였다. 케톤생성식이와 베타-하이드록시뷰티레이트 보충이 신장 기능 장애와 섬유증을 억제한 기전을 확인하고자 당뇨병성 신장 질환과 관련된 지표를 분석하였다. 케톤생성식이와 베타-하이드록시뷰티레이트 보충은 미토콘드리아 생합성 관련 지표인 Sirt3와 Pgc-1α의 발현을 증가시키지 못하였다. 또한 산화 스트레스의 조절에 관여하는 지표의 분석 결과, 케톤생성식이와 베타-하이드록시뷰티레이트 보충은 Sirt1의 발현량을 증가시키지 못하였으나 베타-하이드록시뷰티레이트의 보충은 Nfe2l2의 발현량을 유의하게 증가시켰다. 당뇨병군과 비교하여 항산화 기능을 가진 Nqo1과 Hmox1의 발현량은 케톤생성식이와 베타-하이드록시뷰티레이트군에서 유의한 차이가 없었다. 이러한 결과는 케톤생성식이와 베타-하이드록시뷰티레이트 보충이 신장의 기능 장애와 섬유증을 개선시켰으나 그 기전이 미토콘드리아 생합성의 증가와 산화스트레스의 감소에 의한 것이 아니었음을 보여주었다. 본 연구를 통해 케톤생성식이와 베타-하이드록시뷰티레이트 보충이 당뇨병 쥐의 신장 기능 장애와 섬유증의 개선 효과가 있음을 확인하였다. 그러나 본 연구는 당뇨병 유도 쥐 모델 연구이며 중재 기간이 6주로 부작용을 관찰하기에는 다소 짧았으므로 추후 인체 연구를 통해 장기간의 케톤생성식이와 베타-하이드록시뷰티레이트 보충 공급 시 발생하는 문제를 확인하는 것이 필요하다. 더불어, 케톤생성식이와 베타-하이드록시뷰티레이트 보충이 당뇨병 유도 쥐 모델의 신장에 미치는 효과에 대한 세부적인 기전 분석이 부족하므로 케톤생성식이와 베타-하이드록시뷰티레이트가 신장 기능과 섬유증에 미치는 효과를 설명할 수 있는 기전 분석에 대한 추가 연구가 필요하다. 본 연구의 결과는 케톤생성식이와 베타-하이드록시뷰티레이트 보충이 당뇨병에서 신장 기능과 섬유증을 개선하기 위한 영양학적 치료 방법으로 적용될 수 있음을 시사한다.

The enhancement effects of soyasapogenol B and apigenin and their molecular mechanisms in C2C12 myotubes

노유란 서울여자대학교 일반대학원자연계열 2024 국내석사

근감소증은 노화, 무활동, 비만 등으로 유도된 근육량 및 근력 감소 현상으로, 삶의 질을 떨어뜨리고 낙상 사고의 위험성을 높인다. 하지만 근감소증은 아직 치료제가 개발되지 않아 운동 및 식이요법으로 관리가 필요하나, 운동을 하기 어렵다면 운동 모방 물질을 섭취하는 것이 도움이 된다. 대두의 유효성분인 대두사포닌의 아글리콘 형태인 soyasapogenol B는 항암 및 항염 등에 효능이 있다고 알려졌지만, 근육에 대한 연구는 진행되지 않았다. C2C12를 면역형광법을 통해 Myosin heavy chain (MHC)를 염색하였을 때, soyasapogenol B를 통해 myotube 내의 핵 수가 증가하였다. Soyasapogenol B의 근육 분화 및 단백질 합성 능력은 Phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/AKT 경로를 매개로 하며, PI3K 억제제인 LY294002를 통해 증명되었다. 그리고 soyasapogenol B는 핵 개수 대비 미토콘드리아의 면적을 증가시켰으며, 미토콘드리아 생성 및 운동 지구력 향상에 도움을 준다고 알려진 PPARG coactivator 1 alpha (PGC-1a) 단백질 발현을 상승시켰다. 이러한 현상은 Sirtuin 1 (Sirt1)/PGC-1a 경로를 통해 이루어지며, Sirt1 억제제인 EX527을 사용한 면역침강 실험으로 증명되었다. 따라서 soyasapogenol B는 운동 모방 기능성 성분으로서 활용될 수 있으며, 임상 실험에서의 증명이 필요하다. 악액질은 칼로리 보충 후에도 영양학적으로 비가역적인 체질량 소실이 발생하는 전신 쇠약 증세로, 암환자의 악액질은 화학항암요법으로 악화된다. 캐모마일의 유효성분인 apigenin은 노화와 비만으로 유도된 근감소증 마우스 모델에서 근감소증을 완화했지만, 악액질에 대해서는 아직 연구되지 않았다. 악액질 세포모델을 구현하기 위해 마우스 대장암 세포인 CT26과 1세대 항암제인 cisplatin을 C2C12 세포와 함께 배양하였고, 근육 분화와 단백질 합성을 감소하고, 단백질 분해와 관련된 MuRF 단백질 발현을 촉진했다. C2C12 악액질 모델에서 apigenin은 IGF1 receptor/AKT/FOXO3a 경로를 통해 근위축을 완화했다. 그러므로 apigenin은 암환자의 화학항암요법으로 인한 부작용을 완화할 수 있는 메디푸드로 활용될 수 있으며, 추가적인 동물실험과 임상 실험이 필요하다.

Evaluation of safety, probiotics properties, and functionality of lactic acid bacteria isolated from jeotgal, a traditional Korean fermented seafood

백지현 서울여자대학교 일반대학원자연계열 2024 국내석사