Comparative Study on Components and Activities of Sperm Head Plasma Membrane in Active and Hibernating Animals

오영근,안병식,최인호,정노팔,신형철,곽병주,Oh, Yung-Keun,Ahn, Byung-Sik,Choi, In-Ho,Jung, Noh-Pal,Shin, Hyung-Cheul,Kwak, Byoung-Ju Korean Society of Electron Microscopy 1999 Applied microscopy Vol.29 No.2

북부 온대지방에 서식하는 박쥐는 그 대부분이 동면을하며, 그 생식유형은 특이하여 가을에 교미하여 사정된 정자는 자성생식도내에 긴 동면기간 동안 저장되어 있는 것으로 알려져 있다(예: 한국큰관박쥐). 환언하면 저장되어 있던 정자는 이듬해 봄에 배란되는 난자와 수정하여 초여름에 출산하게 된다. 본 연구는 월동하는 정자 두부 Plasma membrane의 성분과 활성 등 형태적 및 기능적 특성을 관찰 분석함으로써, 인공임신율을 높일 수 있는 보다 효과적인 한냉온도 정자저장방법을 모색하기 위하여 시도되었다. 동면하는 한국큰관박쥐와 햄스타 및 비동면동물(마우스)의 정자 Plasma membrane이, 실온과 한냉온도(박쥐-동면온도)에서, 생존율, 첨체반응을, 단백질분포, 능동수송에 관여되는 효소$(Na^+-K^+-ATPase)$의 활성 및 주사전자현미경적 조직화학상을 분석하였다. 본 연구에서 얻은 실험결과에 의거하면, 동면동물인 한국큰관박쥐와 햄스타 및 비동면동물인 마우스 정자의 생존율과 첨체반응율은, 실온과 한냉(박쥐-동면)온도간에 의의있는 차이를 발견할 수 없었고, 단백질 분포와 $Na^+-K^+-ATPase$ 효소활성 및 주사전자현미경적 조직화학적 소견에 있어서도 두 온도간에 의의있는 차이는 없었다. 이와 같이 실온과 한냉온도 간에 형태적 기능적 차이가 없다고 하는 사실은, 동면동물이든 비동면동물이든 Spermatozoa plasma membrane이 동면중 또는 동면 이후에 안정적인 수정을 보장해 주는 형태적 및 기능적 보호구조임을 시사해 준다. Fertilization pattern of north temperate bats is known to be unique for their sperm storage in the female reproductive tract during hibernation (e.g. Korean greater horseshoe bats). They copulate in fall but their ejaculated spermatozoa survive until the next spring. In another words they can persist to survive during long hibernation under the cold condition $(8\sim13^{\circ}C)$ and are to be fertilized with the ovum ovulated in the next spring, so called delayed fertilization. The present study was designed to observe morphological and functional changes of spermatozoa plasma membrane of the bats, hamsters which are hibernators, and mice which are non-hibernators in the room and the cold (bat-hibernation) temperatures and to confirm influence of the temperature on spermatozoa; survival rate, acrosome reaction rate, protein distribution, $Na^+-K^+-ATPase$ activities and scanning electron microscopic histochemistry. Based on the experimental results obtained in the present study, there were no significant morphological and functional differences in the spermatozoa plasma membrane in both the room and cold (bat-hibernation) temperatures and such an absence of difference suggests that the spermatozoa plasma membrane might play a pertinent role as a protector for consistent fertilization during and after hibernation.

In Vitro 고삼투압이 정자 원형질막의 Protein Tyrosine Phosphorylation에 미치는 영향

오영근(Yung-Keun Oh),장재호(Jae-Ho Chang),최인호(In-ho Choi),정노팔(Noh-Pal Jung),신형철(Hyung-Cheul Shin),곽병주(Byoung-Ju Kwak) 대한의생명과학회 2000 Biomedical Science Letters Vol.6 No.4

정자의 원형질막은 삼투압에 의해서 영향을 받는다고 보고되고 있다. 이중 세포막내 분자구조의 변화 특히 막지질 구조의 변화와 동반되는 이온채널의 변화 그리고 Ca²?과 HCO?₃의 유동성과도 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. 지금까지의 연구보고에 의하면, 정자의 첨체반응 (acrosome reaction)이 일어날 경우 protein tyrosine phosphorylation이 증가되는데 이것은 cAMP, protein kinase A 등을 통하여 작용되는 것으로 보고되고 있다. 막의 지질변화를 유도하는 물질로 일종의 sterol acceptor인 BSA가 알려져 있는 바, 실제로 BSA가 막지질 성분에 미치는 영향을 관찰한 결과 cholesterol이 유출되고 이온 등의 유동성 변화가 일어나, 이 유동성 변화가 정자의 adenylyl cyclase를 활성화시켜 cAMP를 증가시키고, PKA가 활성화되어 결과적으로 protein tyrosine phosphorylation이 유도된다고 보는 것이다. 첨체반응과 protein tyrosine phosphorylation과는 밀접한 관계가 있는 것으로 사료되고 있다. 본 연구는 정자 원형질막에서 cholesterol이 유출되어 protein tyrosine phosphorylation이 유도될 때, BSA와 같은 sterol acceptor가 작용할 것이라는 전제하에, 고삼투압 하에서 탈수로 인해 원형질막이 위축되더라도 sterol acceptor가 존재한다면 막지질 성분의 구조적 변화가 억제될 수 있을 것이라는 가설을 설정하였다. 실험결과, 저온 및 고삼투압 하에서 정자운동은 감소되지만 원형질막의 구조적 변화는 없고, 삼투압에 대한 반응정도는 원형질막을 통한 수분이동과 세포용적 변화에 따라 비례적으로 일어난다고 하는 사실이 발견하였다. 이 결과는 정자보존에 있어서 저온변화에 영향을 미치는 여러 인자들 특히 protein tyrosine phosphorylation의 증가와 밀접한 관계가 있음을 시시해 준다. 도한 sterol acceptor로 알려진 BSA는 삼투압이 변화되더라도 역시 중요한 인자로 작용할 수 있음을 알 수 있었으며, 특히 고삼투압으로의 변화는 cAMP와 protein kinase A를 거치는 신호전달과정에 있어서 중요한 요인이라는 사실을 확인할 수 있었다. It has been reported that plasma membrane activity of the spermatozoa may be susceptible to be influenced by extracellular osmolality and such membranous changes involve intracellular molecular changes, special regard to the structure of membranous lipids, and the accompanying ion-channel of which are closely related with their fluidity of Ca²? and HCO?₃. It is of common recognition that a certain kind of sterol acceptor player an important to induce lipid fluctuation of the sperm plasma membrane which have been influenced by BSA administration and came in effect to outflow of cholesterol from the spermatozoa and resulted in changes of ionic fluidity to facilitate adenylyl cyclase, and to induce protein tyrosine phosphorylation by increase of cAMP and activation of PKA. Thus it seems likely that an augmentation of the acrosomal reaction is closely related with protein tyrosine phosphorylation. The following experimental results were obtained in the present study; Under the high osmolality conditions, the spermatozoa motility declined significantly and the structural change of the plasma membrane diminished to confirm that the response degrees to the osmolality depended upon the water transfer volume through the plasma membrane and the changes of cellular volume. Those experimental results suggest that a physiological parameter such as low temperature condition played an important role for presentation of spermatozoa and that inducement of spermatozoa activation for reinforcement of protein tyrosine phosphorylation. On the other hand, it seemed likely that the BSA administration as one of sterol acceptors might represent a key role also under the high osmolality condition and their result also suggests that osmolality change, special regard to high osmolality condition may play an important role also in the processes of signal transmission.

Effect of Extracellular Ca<SUP>2+</SUP> and Ca<SUP>2+</SUP>-ATPase on the Acrosome Reaction of Spermatozoa

Yung-Keun Oh(오영근),Jae-Ho Chang(장재호),In-Ho Choi(최인호),Noh-Pal Jung(정노팔),Hyung-Cheul Shin(신형철),Byoung-Ju Kwak(곽병주) 대한의생명과학회 1998 Biomedical Science Letters Vol.4 No.1

세포내, 외 Ca²? 농도구배 유지에는 Ca²?ATPase와 Ca²?-Na? exachangers가 주요한 기능을 한다고 알려져 있는데 특히 Ca²?-ATPase의 기능에 대해 많은 연구가 행해지고 있다. Ca²?-ATPase는 체세포에서 세포막에 위치하고 있으며 Ca²?을 세포외부로 배출하는 기능을 함으로써 세포내부의 Ca²?농도를 낮게 유지할 수 있도록 하는 기능을 담당하고 있다. 이러한 Ca²?-ATPase는 포유동물의 정자에도 존재하고 있지만 그 기능에 대해서는 아직 많은 설명이 되어있지 않다. 본 연구에서 정자가 수정을 하기위한 기능적인 능력이 Ca²? 농도와 관련된 변화와 얼마나 연관되어 있는가를 규명하고, 이러한 Ca²?농도 조절이 원형질막의 중요인자인 Ca²?-ATPase와는 어떠한 연관성이 있는가를 알기위해 시도한 결과, Ca²?-ATPase는 세포내, 외 Ca²?의 농도구배를 조절함으로써 세포내 Ca²?의 농도를 증가시켜 정자가 수정능 획득과정으로 빨리 전환하도록 유도하고 첨체반응에 중요한 역할을 하는 것으로 판단되며, 세포외 Ca²?농도가 높게 유지될 경우에도 정자의 첨체반응이 유도됨으로써 난자와 용이하게 수정을 할 수 있는 생리적 환경이 제공될수 있다고 사료된다. This study has been designed in order to examine a physiological role of Ca²? which has been known as an essential factor for capacitation, to confirm whether the enzyme activity of Ca²?-ATPase on capacitation is important or not, and to clarify relationship between various levels of the Ca²? concentration and Ca²?-ATPase which has been known to be an important factor of the plasma membranes. In the present study applying quercetin, a Ca²?-ATPase inhibitor, the enzymatic effect of Ca²?-ATPase on capacitation was found to be remarkable: a significant increase of the transition from the original type (type A) to the type B and the type AR of the spermatozoa. This finding suggests that Ca²?-ATPase plays an important role in the efflux and the influx of the Ca²? which has been known to be an essential factor the capacitation and acrosome reaction, and that the inhibitory action of the Ca²?-ATPase might be a prerequsite step toward the acrosome reaction. The conclusion reached can be deduced as follows: increment of the intracelluar Ca²? concentration occurred by controlling the slope of Ca²? concentration through Ca²?-ATPase activities in both the intra- and extracelluar fluid may be an important procedure for capacitation and acrosome reaction, and ultimately for fertilization of the spermatozoa and the ova.

In Vitro 고삼투압이 정자 원형질막의 Protein Tyrosine Phosphorylation에 미치는 영향

오영근,장재호,최인호,정노팔,신형철,곽병주 대한의생명과학회 2000 Journal of biomedical laboratory sciences Vol.6 No.4

정자의 원형질막은 삼투압에 의해서 영향을 받는다고 보고되고 있다. 이중 세포막내 분자구조의 변화 특히 막지질 구조의 변화와 동반되는 이온채널의 변화 그리고 Ca2+과 HCO-3의 유동성과도 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. 지금까지의 연구보고에 의하면, 정자의 첨체반응 (acrosome reaction)이 일어날 경우 protein tyrosine phosphorylation이 증가되는데 이것은 cAMP, protein kinase A 등을 통하여 작용되는 것으로 보고되고 있다. 막의 지질변화를 유도하는 물질로 일종의 sterol acceptor인 BSA가 알려져 있는 바, 실제로 BSA가 막지질 성분에 미치는 영향을 관찰한 결과 cholesterol이 유출되고 이온 등의 유동성 변화가 일어나, 이 유동성 변화가 정자의 adenylyl cyclase를 활성화시켜 cAMP를 증가시키고, PKA가 활성화되어 결과적으로 Protein tyosine phosphorycation이 유도된다고 보는 것이다. 침체반응과 protein tyrosine phosphorylation과는 밀접한 관계가 있는 것으로 사료되고 있다. 본 연구는 정자 원형질막에서 cholesterol이 유출되어 protein tyrosine phosphorylation이 유도될 때, BSA와 같은 sterol acceptor가 작용할 것이라는 전제하에, 고삼투압 하에서 탈수로 인해 원형질막이 위축되더라도 sterol acceptor가 존재한다면 막지질 성분의 구조적 변화가 억제 될 수 있을 것이라는 가설을 설정하였다. 실험결과, 저온 및 고삼투압 하에서 정자운동은 감소되지만 원형질막의 구조적 변화는 없고, 삼투압에 대한 반응정도는 원형질막을 통한 수분이동과 세포용적 변화에 따라 비례적으로 일어난다고 하는 사실을 발견하였다. 이 결과는 정자보존에 있어서 저온변화에 영향을 미치는 여러 인자들 특히 protein fgrosine phosphorylation의 증가와 밀접한 관계가 있음을 시시해 준다. 또한 sterol acceptor로 알려진 BSA는 삼투압이 변화되더라도 역시 중요한 인자로 작용할 수 있음을 알 수 있었으며, 특히 고삼투압으로의 변화는 cAMP와 protein kiname A를 거치는 신호전달과정에 있어서 중요한 요인이라는 사실을 확인할 수 있었다. It has been reported that plasma membrane activity of the spermatozoa may be susceptible to be influenced by extracellular osmolality and such membranous changes involve intracellular molecular changes, special regard to the structure of membranous lipids, and the accompanying ion-channel of which are closely related with their fluidity of Ca2+ and HCO-3. It is of common recognition that a certain kind of sterol acceptor player an important to induce lipid fluctuation of the sperm plasma membrane which have been influenced by BSA administration and came in effect to outflow of cholesterol from the spermatozoa and resulted in changes of ionic fluidity to facilitate adenylyl cyclase, and to induce protein tyrosine phosphorylation by increase of cAMP and activation of PKA. Thus it seems likely that an augmentation of the acrosomal reaction is closely related with protein tyrosine phosphorylation. The following experimental results were obtained in the present study; Under the high osmolality conditions, the spermatozoa motility declined significantly and the structural change of the plasma membrane diminished to confirm that the response degrees to the osmolality depended upon the water transfer volume through the plasma membrane and the changes of cellular volume. Those experimental results suggest that a physiological parameter such as low temperature condition played an important role for presentation of spermatozoa and that inducement of spermatozoa activation for reinforcement of protein tyrosine phosphorylation. On the other hand, it seemed likely that the BSA administration as one of sterol acceptors might represent a key role also under the high osmolality condition and their result also suggests that osmolality change, special regard to high osmolality condition may play an important role also in the processes of signal transmission

Effect of Extracellular Ca²+ and Ca²+-ATPase on the Acrosome Reaction of Spermatozoa

Kwak,Byoung-Ju,Shin,Hyung-Cheul,Chang,Jae-Ho,Jung,Noh-Pal,Choi,In-Ho,Oh,Yung-Keun THE KOREAN SOCIETY FOR BIOMEDICAL LABORATORY SCIEN 1998 Journal of biomedical laboratory sciences Vol.4 No.1

세포내, 외 Ca²+ 농도구배 유지에는 Ca²+-ATPase와 Ca²+-Na+ exachangers가 주요한 기능을 한다고 알려져 있는데 특히 Ca²+-ATPase의 기능에 대해 많은 연구가 행해지고 있다. Ca²+-ATPase는 체세포에서 세포막에 위치하고 있으며 Ca²+을 세포외부로 배출하는 기능을 함으로써 세포내부의 Ca²+농도를 낮게 유지할 수 있도록 하는 기능을 담당하고 있다. 이러한 Ca²+-ATPase는 포유동물의 정자에도 존재하고 있지만 그 기능에 대해서는 아직 많은 설명이 되어있지 않다. 본 연구에서 정자가 수정을 하기위한 기능적인 능력이 Ca²+농도와 관련된 변화와 얼마나 연관되어 있는가를 규명하고, 이러한 Ca²+농도 조절이 원형질막의 중요인자인 Ca²+-ATPase와는 어떠한 연관성이 있는가를 알기위해 시도한 결과, Ca²+-ATPase는 세포내, 외 Ca²+의 농도구배를 조절함으로써 세포내 Ca²+의 농도를 증가시켜 정자가 수정능 획득과정으로 빨리 전환하도록 유도하고 첨체반응에 중요한 역할을 하는 것으로 판단되며, 세포외 Ca²+농도가 높게 유지될 경우에도 정자의 첨체반응이 유도됨으로써 난자와 용이하게 수정을 할 수 있는 생리적 환경이 제공될수 있다고 사료된다. This study has been designed in order to examine a physiological role of Ca²+ which has been known as an essential factor for capacitation, to confirm whether the enzyme activity of Ca²+-ATPase on capacitation is important or not, and to claarify relationship between various levels of the Ca²+ concentration and Ca²+-ATPase which has been known to be an important factor of the plasma membranes. In the present study applying quercetin, a Ca²+-ATPase inhibitor, the enzymatic effect of Ca²+-ATPase on capacitation was found to be remarkable: a significant increase of the transition from the original type (type A) to the type B and the type AR of the spematozoa. This finding suggests that Ca²+-ATPase plays an important role in the efflux and the influx of the Ca²+ which has been known to be an essential factor the capacitation and acrosome reaction, and that the inhibitory action of the Ca²+-ATPase might be a prerequsite step toward the acrosome reaction. The conclusion reached can be deduced as follows: increment of the intracelluar Ca²+ concentration occurred by controlling the slope of Ca²+ concentration through Ca²+-ATPase activities in both the intra- and extracelluar fluid may be an important procedure for capacitation and acrosome reaction, and ultimately for fertilization of the spematozoa and the ova.