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방선균이 생산하는 인산화타이로신 단백질 포스파타아제의 분자생물학적 연구
최학선,신용국,김춘성,김시욱 한국생명과학회 2002 생명과학회지 Vol.12 No.1
방선균에 존재하는 단백질 타이로신 포스파타아제의 기능을 알아보기 위하여 우선 이 유전자를 대장균에 클로닝하여 대량으로 발현시킨 결과, 발현된 단백질은 soluble형태로 존재하여 자신의 효소활성을 가지고 있었으나, 효소활성부위에 대한 변이주의 경우에는 기질과 결합은 하였으나 활성이 없는 것으로 나타났었다. 방선균에서 이 효소의 세포내 기작 및 결합 단백질을 파악하기 위해 대장균에 클로닝한 유전자를 방선균 발현벡터(pIJ6021)에 클로닝을 하였다. 이렇게 만든 유전자를 in-ducer인 thiostrepton을 이용하여 발현시킨 결과, 활성형의 단백질 타이로신 포스파타아제가 대량으로 생산되었다. 그리고 이들 유전자를 방선균에서 과잉 발현시킨 결과 항생제 생산 및 형태 변화 등의 표현형은 나타나지 않았다. 이효소와 반응하는 기질 및 결합 단백질을 찾기 위해서 이들과 결합은 하지만 반응하지 않는 돌연변이 단백질 타이로신 포스파타아제 (PtpA(C9S))를 유전자 조작하여 방선균에서 과잉 발현시켰다 그 결과 표현형은 없었지만 인산 타이로신 단백질의 패턴변화를 알 수 있었고, 단백질 타이로신 포스파타아제에 의하여 인산화 조절되는 단백질 3개 찾을 수 있었다. 이들 세 단백질(p65, p90 그리고 p200)은 ptpA(C9S)가 발현된 방선균에서 보다 더 많은 인산화 패턴을 나타내었으며, 이들은 가능한 단백질 타이로신 포스파타아제의 표적이라고 생각되었다. 만약 이들의 구조가 밝혀진다면, 방선균의 타이로신 포스파타아제의 기능 및 신호전달 과정의 역할을 파악할 수 있으리라 생각된다. The cloning and expression of Phosphotyrosine Protein Phosphatase into E. coli provides important tools of understanding of its functions and signal transduction mechanisms. The abundant soluble protein of the Phosphotyrosine Protein Phosphatase A (PtpA) and the active site mutant PtpA(C9S) were produced using the expression vector pET26 in E. coli and pIJ6021 with the thiostrepton in S. lividans. The enzyme activity of both proteins extracted by Ni-NTA column had same results from the expression vector pET26 and pIJ6021. The enzyme activity of phosphatase was found in the protein of PtpA, but not in that of C9S. The western blot detected by penta His-tag antibody resulted in the inducer, thiostrepton was not a good trigger to induce a large amount of PtpA protein. The overexpression of both proteins had no significantly different effect on the A factor cascade related to the secondary metabolite and mycelium formation between PtpA and C9S. However, overproduction of PtpA protein using pIJ6021 in S. lividans brought about a dramatic decrease in the amount of phosphotyrosine proteins (p200, p90, and p65), but no significantly phenotypic variation in S. lividans. This indicates that PtpA has an important proteome role in signal transduction mechanism of producing massive amount of phosphotyrosine protein in Streptomyces sp.
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최학선(Hack-Sun Choi),최경희(Kyong-Hee Choi),이춘환(Choon-Hwan Lee),류태형(Tae-Hyoung Rhew) 한국식품영양과학회 1999 한국식품영양과학회지 Vol.27 No.6
순수한 핵산 분리가 어려운 김종에서 염색체를 정제하는 효과적이고 시간이 적게 소요되는 방법을 개발하였다. Isopropanol 농도를 조절하고 각 step의 protocol을 새로 작성한 결과 정제된 핵산의 총 당오염도가 유의성있게 줄었고(탄수화물 1.0㎎/1g 건조중량(7) vs. 0.108㎎/1g), 단백질 오염도도 개선되었으며(A_(260)/A_(280): 1.89), polyphenol화합물 오염도도 크게 개선(A_(260)/A_(230): 160)할 수 있었다. 또 이 방법으로 정제한 DNA를 사용했을 때, 일반적으로 분자분류에 사용하는 small nuclear DNA를 증폭하기 위해 기존의 상동성있는 primer를 사용하여 PCR 증폭한 결과 약 500bp의 intron을 갖는 (18) 2.3kb정도의 PCR product를 얻었다. 김에서 핵산을 정제할 때에는 불순물 오염정도(다당류오염, polyphenol화합물 오염, 이차 대사산물 오염 등)가 김엽체부위, 성장시기 등에 따라서 상이하므로 건조된 엽체중 장기간(1년 이상) 보관된 엽체를 무작위적으로 섞어서 시료로 사용하면서 이 DNA정제방법이 모든 김종류에 유용하게 쓰여질 수 있는지 확인하기 위해서 다양한 종류의 김으로부터 DNA를 정제해 보았을 때 특히 가장 불순물 오염도가 크고, 핵산정제가 어려운 긴잎돌김, 모뮈늬돌김에서도 시험한 결과 순수한 DNA를 정제할 수 있었다(Fig. 6). A method for the isolation and purification of DNA from a red algae, Porphyra was innovated. The innovation of the method consists mainly of three steps that include sodium acetate treatment, chloroform extraction, and 0.2 volume isopropanol precipitation step. The sodium acetate treatment was designed to remove polysaccharide contamination, and the isopropanol step to remove proteins and salts contaminents. Genomic DNA's of several species(for example, P. tenera, P. yezoensis, P. seriata, and P. pseudolinearis) was successfully isolated by the innovated method. The amount of DNA purified from one g of sample material with the innovated method was 53㎍ in average. The resulting DNA was characterized to include high molecular weight and showed no nuclease activity. The DNA was pure enough to be digested directly by various restriction enzymes without any difficulties. Porphyra DNA was pure enough and adequate for amplification reaction through the polymerase chain reaction (small nuclear rDNA PCR amplification).
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양식 참김(Porphyra tenera)에서 분리한 Circular Plasmid DNA
최학선(Hack-Sun Choi),최경희(Kyong-Hee Choi),이춘환(Choon-Hwan Lee),류태형(Tae-Hyoung Rhew) 한국식품영양과학회 1999 한국식품영양과학회지 Vol.27 No.6
참김(P. tenera)의 total DNA를 Hoechst dye/CsCl 농도구배 초고속 원심분리로 분리하였을 때, 두개의 band가 분리되었다. Hoechst dye는 핵산염기서열중 AT가 풍부한 배열에서만 결합하는 염색시약으로서 상부 band는 세포소기관(엽록체, 미토콘드리아) 핵산 및 plasmid 부분이 염색되고, 하부 band는 chromosome의 핵산을 나타내는 부분이다. 이 plasmid는 엽록체나 미토콘드리아와 함께 분리되었으므로 엽록체나 미토콘드리아 유래의 plasmid일 가능성이 매우 높다. 이 plasmid는 다른 홍조류나 북미산의 김종류보다 핵산분리가 힘들고, 또 DNA의 농축이 어려운 한국산 양식김에서(참김)에서 처음으로 분리된 plasmid DNA이었다. 이 plasmid가 선형(linear) conformation인지 구형(circular) conformation인지 확인하기 위해 0.8% agarose 젤+TBE 완충액과 1.2% agarose 젤+TAE(Tris-acetic acid EDTA)전기영동 완충액으로 따로 전기영동해 본 결과 각각의 전기영동 시스템에서 서로 다른 결과를 가져왔다. 0.8% gel에서는 1.8kb의 marker자리로 그리고, 1.2% gel에서는 2.0kb marker의 자리로 영동되었다. 따라서 이 plasmid는 전기영동 조건에 따라 영동거리가 변화함으로써 linear가 아닌, circular plasmid로 확인되었다. 그리고 소량의 김(0.05g)으로 plasmid을 분리한 결과 상당량의 plasmid를 분리할 수 있었던 것으로 보아 본 plasmid는 high copy plasmid로 추산되었다. 이 plasmid의 제한효소 mapping을 하기 위해 agarose gel의 plasmid band부분을 칼로 절단하여 gel elution을 실시한 후에 선택된 여러 가지 제한효소를 처리하여 본 후 unique한 제한효소을 선택하여 절단 반응시켜 본 결과 EcoRI, SacI, SalI의 처리에서는 2.5kb 정도의 크기로 나타났으며, PstI과 BglI을 혼합 처리한 결과에서는 2.2kb 크기로 판정되었다. 따라서 이 plasmid는 최소 2.5kb이상 크기를 가진 고리형 plasmid라 결론지었다(Fig. 4). 이플라스미드를 이용해서 김형질전환벡터작성이 진행중이다. When total cellular DNA was isolated from Porphyra tenera by ultracentrifugation on Hoechst dye/CsCl gradients method, plasmid-like DNA's were concentrated at the upper band which were characterized with a A+T rich organelle DNA's in the CsCl gradients. Based on their electrophoretic migration in different concentration of agarose gel, buffer system, and electric power etc. and the results of restriction digestion, the plasmid-like DNA's were concluded to have circular conformation. This is the first report of putative circular plasmid DNA from the P. tenera, which is a autonomously replicating plasmid existing with a high copy number plasmid in the cell. The minimum size of this plasmid estimated by restriction endonuclease digestion was appeared to be 2.5kb in size.
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