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고나연,임현섭,유용만,윤영남,Ko, Na Yeon,Lim, Hyoun Sub,Yu, Yong Man,Youn, Young Nam 한국응용곤충학회 2015 한국응용곤충학회지 Vol.54 No.2
담배가루이(Bemisia tabaci)는 외래해충으로 바이러스벡터로 작용하여, 토마토의 토마토황하잎말림병바이러스(TYLCV)를 비롯한 약 100여종의 바이러스를 매개하는 중요한 해충이다. 본 연구에서는 VIGS vector를 이용하여 담배가루이 방제를 위한 target 유전자들을 선발하기 위해 gateway system을 이용한 담배가루이 cDNA library 제작을 시도하였다. 첫 번째 방법으로 oligo d(T) primer를 사용하였을 때, 평균 약 1 kb의 insert와 $1.4{\times}10^4cfu$의 titer를 확인하였다. 그러나 insert size가 너무 커서 적절하지 않았다. 두 번째 방법으로 attB-N25 random primer를 이용하고, sonication을 6초 실시하여 다시 진행하였다. 그러나 확인되는 insert size는 다소 컸고, 몇몇은 insert가 너무 작아서 밴드가 확인 되지않았으며, $1.04{\times}10^54cfu$의 titer를 확인할 수 있었다. 세 번째 방법으로는 oligo d(T) primer를 이용하였고, sonication을 2초 실시하였다. 그 결과 300 bp~600 bp size의 insert가 확인되었으나, electro transformation을 사용한 첫번째, 두번째 방법에 비해 heat shock transformation을 사용하여 titer가 $5.2{\times}10^24cfu$로 매우 낮은 것을 확인 할 수 있었다. 결과적으로 cDNA library를 만들 때 먼저 random primer를 사용하여 First strand를 합성하여 poly A를 제거하고, 다음으로 sonication을 1초 실시하여 300~700 bp정도의 적절한 size의 insert를 생성하고, 마지막으로 electro-transformation을 실시하여 transformation 효율을 높인다면 VIGS vector에 적합한 cDNA library를 만들 수 있을 것으로 사료 된다. The sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci, is the major insect pest that transmitted over 100 plant viruses including tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) of tomato plant as virus vector in the world. In this study, cDNA library of whitefly was constructed using Gateway system for selecting target gene in order to control of B. tabaci using virus-induced gene silencing (VIGS) vector with RNAi. First of all, when using oligo d(T) rimer, the calculated titer of cDNA library was confirmed with $1.4{\times}10^4$ clones and average insert sizes was confirmed with 1 kb. However, insert size was very big for construction of cDNA. Otherwise, when using attB-N25 random primer and sonication for 6 sec, the calculated titer of cDNA library was confirmed with $1.04{\times}10^5$ clones. But mostly insert band wasn't identified on the electrophoresis, because it seemed that insert size is too small (${\leq}100bp$), also the size of identified insert was somewhat big. Finally, when using oligo d(T) primer and sonication for 1 sec, cDNA insert of whitefly was appropriated for VIGS with 300-600 bp. However, cDNA sequence included a poly A and titer was very low to $5.2{\times}10^2$ clones. It was supposed that heat shock transformation was used instead of electro-transformation. It is considered that when constructing cDNA library for using VIGS vector, (1) random primer should be used for First strand cDNA synthesis in order to remove poly A and (2) sonication for 1 sec should be performed in order to get appropriated insert size and (3) electro-transformation should be performed in order to improve transformation efficiency.
RNAi 기법으로 담배가루이 방제를 위해 선발된 유전자의 식물체내 발현
김정희(Jeong-Hee Kim),서은영(Eun-Young Seo),김정규(Jung-Kyu Kim),임현섭(Hyoun-Sub Lim),유용만(Yong-Man Yu),윤영남(Young-Nam Youn) 충남대학교 농업과학연구소 2015 농업과학연구 Vol.42 No.2
Three genes selected from cDNA library of tobacco whitefly, Bemisia tabaci, were checked whether these genes expressed in plant or not, and confirmed the change of gene expression using qRT-PCR in the tobacco whitefly. First of all, three genes were inserted in Tobacco rattle virus (TRV) RNA2 vector using Sac I and Xho I restriction enzymes, and conducted agro-infiltration in tobacco plants (Nicotiana benthamianana). And then, it was confirmed that TRV RNA2 vector and genes inserted in TRV RNA2 vector were expressed in plant. So, after feeding the tobacco whitefly the plants inoculated the genes and induced RNAi of the genes, we plan to confirm the RNAi in the whitefly and investigate the changes of gene expression through the qRT-PCR.
초분광 영상 시스템을 이용한 수박종자(Capsicum annuum L)의 오이 녹반 모자이크 바이러스(CGMMV) 감염의 비파괴 판별 시스템 개발
배형진 ( Hyung-jin Bae ),산토스로후미 ( Santosh Lohumi ),라릿칸트발 ( Lalit Mohan Kandpal ),박찬환 ( Chanhwan Park ),임현섭 ( Hyoun-sub Lim ),조병관 ( Byoung-kwan Cho ) 한국농업기계학회 2017 한국농업기계학회 학술발표논문집 Vol.22 No.1
종자산업은 농작물 생산에 중요한 역할을 끼치는 좌우하는 요소 중에 하나로, 우량종자의 확보는 농작물 수급에 중요한 역할을 하는 농업부문의 원천산업이다. 오이 녹반 모자이크 바이러스(CGMMV)는 박과류에 가장 많은 피해를 끼치는 바이러스로 종자전염을 방지하고, 우량종자의 공급을 위해서는 감염종자와 비 감염종자의 판별은 필수적이다. 이에 본 연구에서는 초분광 영상 시스템을 이용하여 수박종자의 CGMMV의 감염 및 비 감염종자를 판별할 수 있는 기술을 개발하고자 하였다. 본 연구에서 사용된 바이러스 감염 종자는 CGMMV 바이러스 감염 수박종자를 사용하였으며, 생산된 종자를 초분광 영상 시스템을 통해 스크린 후, RNA를 추출하여 PCR분석법으로 바이러스의 감염유무를 확인하였으며, 이후 바이러스의 감염유무와 획득된 스펙트럼을 비교·분석하여 판별모델을 개발하고 이를 선별 시스템에 적용하였다. 모델개발에 사용된 초분광 영상 기술은 초분광 SWIR(Shortwave infraed : 1000-2500nm)영상 기술이다. 획득된 초분광 SWIR 영상을 분석한 결과 바이러스 감염 종자가 유의미한 정확도로 판별이 되는 것으로 나타났다. 초분광 SWIR 영상기술이 바이러스 감염종자와 비감염종자를 비파괴적으로 선별하는데 효과적으로 적용이 가능할 것으로 판단된다.