국내 허가된 유전자재조합의약품 품질시험에 사용되는 전하변이체 분석법 조사연구

엄준호(Joon Ho Eom),백정희(Jounghee Baek),홍영기(Young Ki Hong),손애라(Aera Son),강소영(Soyeong Kang),오호경(Hokyung Oh),김민정(Min-Jung Kim),우정남(Jeong-Nam Woo),안치영(Chiyoung Ahn) 대한약학회 2020 약학회지 Vol.64 No.1

Analysis on approval documents of recombinant DNA-derived biopharmaceuticals (172 items) marketed in Korea showed as followed. First of all, antibody drugs are about 37% among the biopharmaceuticals and most of antibodies as a major ingredient (about 92%) are humanized or human type. Second, charge variant assays using in quality (purity) test are distinctly different between antibody drugs and non-antibody drugs. The former prefer CEX and cIEF, the latter IEF and CZE. The preference difference may be related to size and complexity of target molecules. Third, the result of analysis on usage of 4 assays (CEX, CZE, IEF, and cIEF) in accordance with approval period indicated that cIEF usage got increased since 2010 and was about 50% after 2015. And finally, acceptance criteria of charge variant assays showed a few distinguished patterns independent of drug products. In the light of these facts, whether or not to establish a charge variant method and acceptance criteria as a quality test, and which method to use may depend on the characteristics of the product and analysis conditions of other manufacturers. In particular, in biopharmaceuticals that contain polymer proteins as the main component, such as antibodies, charge variant analysis is important, and the use of modern analytical methods such as the icIEF method is expected to increase.

Salmonella typhimurium에서 SPI2의 ssaK와 ssaJ의 발현조절

최혁진,엄준호,이인수,박경량,박용근,Choi, Hyuk-Jin,Eom, Joon-Ho,Lee, In-Soo,Park, Kyeong-Ryang,Park, Yong-Keun 한국미생물학회 1998 미생물학회지 Vol.34 No.3

Salmonella typhimurium에서 병독성 발현, 특히 숙주세포내로의 침입에 중요한 역할을 하는 유전자들의 집단(gene cluster)인 Salmonella Pathogenicity Island 2(SPI2)의 발현에 대한 다양한 환경요인들의 영향을 조사하였다. 이를 위해 SPI2의 주요 유전자인 ssaJ와 ssaK의 promoter를 포함하는 regulatory region을 promoterless lac operon과 융합시켜 reporter를 제조하였다. 그리고 산소농도, 삼투압, pH, 탄소원 결핍 및 glycerol 참가 등 여러 환경요인들의 변화가 이 reporter 유전자의 발현에 미치는 효과를 조사한 결과 저산소, 낮은 삼투압, 약 알칼리 등이 ssaJ와 ssaK의 발현을 증가시켰으며 위의 세조건이 함께 존재할 때 그 발현이 가장 크게 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 탄소원 결핍이나 glycerol 첨가는 이 두 유전자들의 발현에 영향을 주지 않았다. 또한 이상과 같은 환경인자들의 효과는 S. typhimurium의 세 가지 야생형인 LT2, UK1과 SL1344 모두에서 동일한 양상을 보였다. 다른 한편 SPI1의 transcriptional activator를 암호화하는 조절유전자인 hilA의 돌연변이는 ssaJ와 ssaK의 발현에 영향을 미치지 않음도 밝혀냈다. 따라서 이상의 결과는 SPI1과 SPI2가 서로 별개의 조절계에 의해 그 발현이 조절됨을 보여준다. Salmonella Pathgenicity Island 2 plays an important role in Salmonella pathogenicity, especially invasion into host cell. We have investigated the effect of various environmental factors, such as oxygen level, osmolarity, pH, carbon starvation and glycerol addition on the expression of SPI2. For this research, we constructed the reporter plasmids, in which the promoter-less lac operons are fused with the regulatory regions (including promoter) of ssaJ and ssaK, major genes in SPI2. The study using the reporters showed that low oxygen, low osmolarity, or weak alkali conditions increased the expression levels of ssaJ and ssaK and when these three conditions exist simultaneously, the expression levels of ssaJ and ssaK are the highest. However carbon starvation and glycerol addition did not affect the expression of ssaJ and ssaK. These environmental effects on the expression levels of ssaJ and ssaK are the same in three Salmonella typhimurium wild types, LT2, UK1, and SL1344. In addition, we confirmed that the mutation in hilA, a regulatory gene encoding a transcriptional activator of SPI1, had no effect on the expression of ssaJ and ssaK. Thus, these results strongly suggest that the expressions of SPI2 and SPI1 are regulated by different control systems.

Salmonella enterica serovar Typhimurium에서 Type III 분비장치의 표적단백질들의 분비신호 확인 및 Type III 분비장치를 이용한 Secretion Vector의 개발

최혁진,엄준호,조정아,이선,이경미,이인수,박용근,Choi, Hyuk-Jin,Eom, Joon-Ho,Cho, Jung-Ah,Lee, Sun,Lee, Kyoung-Mi,Lee, In-Soo,Park, Yong-Keun 한국미생물학회 2000 미생물학회지 Vol.36 No.4

소장의 상피세포내로 세균 세포가 들어가는 과정(invasion)은 Salmonella의 감염에서 중요한 단계이다. invasion은 Salmonella type III 분비장치에 의해 분비되는 단백질들에 의해 유도된다. type III 분비단백질들은 특이하게, 일반적인 분비단백질들이 가지는 N-말단 분비 신호 펩타이드를 가지고 있지 않는 것을 알려져 있다. Yersinia에서의 최근 연구에서 type III 분비장치에 의해 인지되는 분비신호는 분비 단백질을 암호화하는 mRNA의 5'말단부의가 형성하는 2차 구조에 있을 것이라는 보고가 있다. 본 연구에서는 Salmonella type III 분비장치의 분비신호를 조사하기 위해 type III 분비단백질중 하나인 sopE를 택하여 ompR과의 translational fusion을 만들었다. translational fusion을 위해 사용된 sopE DNA절편은 프로모터와 시작 콘돈으로부터 10, 15 코돈을 포함하는 절편이다. Immunoblot으로 확인한 결과, OmpR을 포함하는 fusion 단백질이 형질전환 Salmonella 세포로부터 분비되었다. 이러한 결과는 Salmonella의 type III 분비신호가 분비단백질을 암호화하는 mRNA의 5'말단에 위치할 가능성을 제시하고 있다. 또한, 이러한 분비신호를 활용하여 유용한 외래 단백질을 세균 세포 내에서 효과적으로 생산, 분비할 수 있는 secretion vector의 원형을 개발하였다. Invasion process of bacterial cell into intestinal epithelium is important in Salmonella infection. The invasion is induced by the proteins secreted by type III secretion appratus of Salmonella. It has been known that the proteins do not have N-terminal signal peptide existing in general secreted proteins. Recent studies on Yersinia reported that secretion signal of type III appratus may lie on 5'end secondary structure of mRNA of secreted protein. In this study, we constructed translational fusion of ompR and sopE, encoding type III secretion protein of Salmonella, and observed secretion of the fusion protein for investigating the secretion signal of Salmonella type III appratus. The sopE DNA fragments of the translational fusion contain the region of promoter and from start code to tenth or to fifth code. These translational fusions indicate that type III secretion signal of Salmonella is located on 5'end of mRNA encoding secreted protein. We constructed prototype of secretion vector using this signal to produce useful foreign protein.

영ㆍ유아용 식품원료의 Bacillus cereus와 일반세균 모니터링 및 제조공정 중 미생물 품질제어

정우영(Woo-Young Jung),엄준호(Joon-Ho Eom),김병조(Byeong-Jo Kim),주인선(In-Sun Ju),김창수(Chang-Soo Kim),김미라(Mi-Ra Kim),변정아(Jung-A Byun),박유경(You-Gyoung Park),손상혁(Sang-Hyuck Son),이은미(Eun-Mi Lee),정래석(Rae-Seok Jung),나미 한국식품과학회 2010 한국식품과학회지 Vol.42 No.4

영ㆍ유아용 식품에 주로 사용되는 원료에 대한 미생물 오염도를 조사한 결과, 총 10종(n=20)의 원료 중 B. cereus가 검출된 원료는 2종(n=4, 20%) 이었고, 1.02±1.36 log CFU/g으로 나타났으며, B. cereus가 검출된 원료로는 organic brown rice powder(C사)와 mixed orgarnic vegetable powder(C사) 이었다. 미생물이 검출되지 않거나 낮게 검출된 원료는 제조공정에 살균, 분무건조, 팽화 및 압출 등의 열처리 공정이 있었다. 각 원료에 대한 일반세균수를 알아보기 위해 10종(n=20) 검사결과 4종(n=8) 검출(40%) 되었으며, 3.21±3.64 log CFU/g으로 나타났다. 원료에서 분리한 미생물 분포를 조사한 결과 총 11종이 분리 되었으며, 분리된 일반세균 중 76%를 차지하는 우점종은 S. paucimobilis, P. fluorescens, R. radiobactor, St. maltophilia 순으로 나타났다. 본 연구에서는 영ㆍ유아식의 미생물 안전성 확보를 위해 원료 생산공정에 살균 등의 열처리 공정이 필요하며, 미생물에 오염된 원료를 사용할 경우에도 생산공정에 드럼건조(drum surface temperature: 100-135℃), 분무건조(inlet air temperature: 135-204℃), 살균(pasteurization, UHT 130-150℃/1-4 sec), 미생물 저감화 방안의 제조 공정을 거쳐 생산된 제품은 일반세균, 대장균군, B. cereus가 검출되지 않아 안전한 제품의 생산이 가능하였다. 또한, 영ㆍ유아용 식품을 제조할 경우 명확한 살균조건을 설정하고, 공정품의 품질평가를 거쳐야만 제품의 안전성을 확보할 수 있을 것으로 보인다. The purpose of this study was to examine the presence of Bacillus cereus, aerobic bacteria and coliforms in the raw material of infant formulas and investigate the manufacturing process in terms of microbial safety. Among ten kinds of raw infant formula material samples (n=20), Bacillus cereus appeared in two (n=4). Aerobic bacteria were not detected in raw infant formula material or maximum 4.15 log CFU/g. Eleven species of aerobic bacteria were isolated and 76% of them were Sphingomonas paucimobilis, Pseudomonas fluorescens, Rhizobium radiobactor, or Stenotrophomonas maltophilia. A Pearson’s correlation analysis revealed that the most influential factors for detecting Bacillus cereus were aerobic bacteria and coliforms. In other words, when the measured values of aerobic bacteria and coliforms were higher, the possibility that Bacillus cereus would appear increased. In a regression model to predict Bacillus cereus, the rate of appearance was correlated with aerobic bacteria and coliforms, and its contribution rate for effectiveness was 86%. Improving microbial quality control by pasteurization, spray dry, popping and extrusion resulted in a decrease in the numbers of Bacillus cereus, aerobic bacteria and coliforms in the raw materials. The results suggest that a hazard analysis and critical control point system might be effective for reducing microbiological contamination.

자외선 흡광도를 이용한 유전자재조합의약품 함량 결정과정 분석

강소영(Soyeong Kang),최진실(JinShil Choi),엄준호(Joon Ho Eom) 대한약학회 2020 약학회지 Vol.64 No.2

This study summarizes the theoretical background of the protein concentration determination process using UV absorbance and proposes the standard calculation formular. We analyzed the protein concentration determination process of recombinant DNA-derived biologics that is inspected by the Ministry of Food and Drug Safety for the last three years (2017-2019) and we found some errors in calculation formular. In addition, we analyzed parameters and acceptance criteria of system suitability test (SST), and we proposed the direction for setting the SST. If the results of this study are widely understood and utilized by product manufacturers and research developers, the calculation of protein concentration using UV absorbance for each product would be simplified and standardized, and contribute to efficient communication between product manufacturers and regulatory authority.

대전ㆍ충청지역 초ㆍ중학교 급식의 당 함량 및 급식을 통한 당류의 섭취실태 연구

박유경(You-Gyoung Park),이은미(Eun-Mi Lee),김창수(Chang-Soo Kim),엄준호(Joon-Ho Eom),변정아(Jung-A Byun),선남규(Nam-Kyu Sun),이진하(Jin-Ha Lee),허옥순(Ok-Soon Heo) 한국식품영양과학회 2010 한국식품영양과학회지 Vol.39 No.10

본 연구에서는 대전과 충남북 지역에서 지역별로 8개의 학교를 선정하고 각 학교당 4주간의 급식을 수거하여 842개 메뉴의 당 함량을 분석하였고, 수거된 급식메뉴에 대해 초등학교 2학년과 5학년, 중학교 2학년 남녀학생의 급식섭취량을 직접 측정하여 급식을 통한 2,806건의 당 섭취량을 산출함으로써 해당학교 및 지역의 당 섭취 특성을 대표할 수 있는 자료를 확보하였다. Fructose, glucose, sucrose, maltose, lactose의 함량 합으로 구한 총 당류의 함량은 가공식품에서와 달리 학교별로 임의의 조리법에 의해 조리된 음식이므로 그 범위가 넓게 나타났다. 주식류의 당 함량은 급식 100 g당 평균 0.20 g, 부식류는 2.08 g, 후식류는 5.13 g으로 과일음료와 유제품, 과일 등을 포함한 후식류의 당 함량이 다른 군에 비해 훨씬 높은 것으로 나타났으며, 부식류 중에서는 소스류와 조림류의 당 함량이 높았다. 급식메뉴 중 가장 많은 양을 섭취하는 음식은 일품식류, 음료 및 차류, 탕 및 전골류, 찌개류 순이었으며, 주스나 식혜와 같은 음료는 정해진 규격이 있어 다른 부식류에 비해 섭취량이 높게 나타났다. 부식류중에서는 국 종류를 제외하면 30~50 g 범위에서 찜류, 튀김류, 볶음류, 부침류, 조림류, 구이류 순으로 많이 섭취하였으나 무침ㆍ나물류와 김치류는 각각 13 g, 10 g만을 섭취하였다. 급식메뉴 중 후식류, 특히 음료 및 차류, 유제품류섭취로 인한 당 섭취량이 가장 많았으며 이들 식품은 당 함량도 높고 규격화된 중량으로 인해 섭취량도 많았기 때문이다. 일품식류는 낮은 당 함량에 비해 급식섭취량이 많아 후식류 다음으로 당 섭취에 크게 기여하였으며, 부식류에서도 조림류에 비해 당 함량이 낮은 튀김류의 급식섭취량이 많으므로 튀김류로 인한 당 섭취량이 조림류로 인한 것보다 높게 나타났다. 급식 한 끼니를 통한 당 섭취량은 평균 4.22 g으로, 학년이 높을수록 급식섭취량과 함께 끼니당 당의 섭취량도 많아 중학생이 5.31 g, 초등학생이 4.03 g을 섭취하였으며, 성별이나 수거시기에 의한 차이는 크지 않았다. 학교급식을 통한 한 끼니의 당 섭취량은 열량섭취량을 기준으로 정한 한국인총 당류 섭취기준이나 한국인영양조사 결과의 하루 총 당류섭취량의 10분의 1 이하 수준으로, 한 끼니 해당량으로서도 높지 않은 것으로 판단된다. 다만 과일주스, 식혜 등의 음료나 요구르트 등의 당 함량이 높은 식품이 제공되거나 이러한후식류가 일품식류와 함께 제공되어 한 끼니당 당의 섭취량이 높은 급식일이 없도록 하는 데에는 관심을 가질 필요가 있을 것으로 판단된다. Korean government will set up the nationwide food safety system with strict control of hazardous nutrients like sugar, fatty acids and sodium as well as advanced nutrition education system. In addition, almost one hundred percent of school food service rate forced the government to consider more effective ways to upgrade the nutritional status of school meals. The object of our study was to provide the data on content and consumption of sugar in school meal for the nationwide project. For this purpose, we surveyed the sugar content of 842 school meal menus and their intake level for 154 days in 8 schools in Daejeon and Chungcheong Province. Sugar contents, the sum of the quantity of 5 sugars commonly detected in food, were analysed with HPLC-RID (Refractive Index Detector). Sugar intakes were calculated by multiplying the intake of each menu to the sugar content of that menu. The sugar content was highest in the desserts, which include fruit juices, dairy products and fruits. Sugar content of side dish was high in sauces and braised foods. Sugar intake from one dish is high in beverage and dairy product, and one dish meals contribute greatly to sugar intake because of their large amount of meal intake. The average lunch meal intakes of second grade and fifth grade elementary school students were 244 g/meal and 304 g/meal, respectively. The meal intake of middle school student was 401 g/meal. The average sugar intake from one day school lunch was 4.22 g (4.03 g on elementary and 5.31 g on middle school student), which is less than 10% of daily sugar reference value for Koreans. The result of this study provides exact data of sugar intake pattern based on the content of sugar which is matched directly to the meals consumed by the students.

유전자재조합 필그라스팀 국가표준품 확립 연구

백정희(Joung Hee Baek),유지혜(Ji hye Yoo),홍영기(Young Ki Hong),박태환(Tae Hwan Park),강소영(So yeong Kang),김민정(Min Jung Kim),김 호(Ho Kim),우정남(Jeong nam Woo),허지연(Ji yeon Heo),박기대(Ki Dae Park),엄준호(Joon Ho Eom),서수경(Soo 대한약학회 2018 약학회지 Vol.62 No.5

We have established a new National Reference Standard(NRS) of filgrastim to be used for the quality management of domestic genetic recombinant drugs. Filgrastim is a recombinant human granulocyte colony stimulating factor( G-CSF) and one of the first-generation biosimilars used as the hematopoietic agent. At first, the candidate substance for the NRS was manufactured on consignment in accordance with the manufacturing process of filgrastim. The identity, purity, potency and protein contents of the candidate substance were assessed using electrophoresis, HPLC systems and a biological assay, which showed it was comparable to filgrastim in quality. In addition the stability test showed it was stable for 12 months. We performed a collaborative study with other institutes to endow it with the labelled protein content and potency values. From the data, it has been assigned with the protein content of 0.240 mg/mL(95% confidence intervals: 0.238~0.242 mg/mL) and the potency value of 2.94 × 107 IU per vial. We had finally enrolled it as the first Korean NRS of filgrastim as approved by Working Committee on Development of Testing and Inspection in Korea Ministry of Food and Drug Safety.

지역특산품 중 잔류농약 실태조사

김미라(Kim Mi Ra),나미애(Na Mi Ae),정우영(Jung Woo Young),김창수(Kim Chang Soo),선남규(Sun NamKyu),서은채(Seo Eun Chae),이은미(Lee Eun Mi),박유경(Park You-Gyoung),변정아(Byun Jung Ah),엄준호(Eom Joon Ho),정래석(Jung Rae Seok),이진하(Lee 한국농약과학회 2008 농약과학회지 Vol.12 No.4

Streptoalloteichus hindustanus ATCC 31219로부터 아미노글라이코사이드계 항생제에 내성을 지정하는 유전자의 클로닝 및 염기서열 결정

김종우,한재진,최영내,엄준호,윤성준,현창구,서주원 한국산업미생물학회 1995 한국미생물·생명공학회지 Vol.23 No.4

Nebramycin 복합체를 생산하는 Stall. hindustanus ATCC 31219로부터 아미노글라이코사이드계 항생제(특히 kanamycin, apramycin에 대해 높은 내성(500 ㎍/㎖)을 보임)에 대해 다제내성을 나타내는 유전자를 cloning하였다. Cloning된 유전자의 염기서열을 결정한 결과 16S ribosomal RNA methylase인 KamA, KamB와 아미노산 서열이 63%와 80%로 매우 높은 상동성을 보였다. 따라서 clone된 유전자는 16S ribosomal RNA methylase 임을 알 수 있었다. Streptoalloteichus hindustanus ATCC 31219, a nebramycin complex producer, is similar to Streptomyeces tenebrarius in a viewpoint of resistance to a wide range of aminoglycoside antibiotics. S. tenebrarius has resistance mechanisms of 16s rRNA methylation and aminogycoside modification. However, it is not know whether resistance mechanisms of Stall. hindustanus are the same as in S. tenebrarius. Therefore, we tried to isolate resistance determinants from Stall. hindustanus. Two different types of aminoglycoside resistance determinants were isolated from Stall. hindustanus and expressed in Streptomyces lividans TK24. The apramycin resistance gene (amr) and the tobramycin resistance gene (tmr) isolated from Stall. hindustanus showed broad resistance spectrum against a dozen of aminoglycoside antibiotics. The complete nucleotide sequences of apramycin resistance gene (amr) were determined. The deduced amino acid sequence of the amr gene of Stall. hindustanus ATCC 31219 showed extensive sequence homology to the 16s rRNA methylase gene (kamB) of S. tenebrarius.