완두콩 ( Pisum sativum ) 에서 Ribulose - 1 , 5 - Bisphosphate Carboxylase Small Subunit 유전자 cDNA 클로닝과 광유도성 발현에 관한 연구

장무웅(Moo Woong Chang),구용범(Yong Bum Koo),김한집(Han Jip Kim) 한국식물학회 1989 Journal of Plant Biology Vol.32 No.1

Polysomal polyadenylated mRNAs which were purified from pea leaves were fractionated by sucrose grandient sedimentation. Fractions corresponding to the peak at 11.5S were found to contain mostly mRNA encoding the precursor polypeptide to the small subunit of ribulose bisphosphate carboxylase (rbcS) by in vitro translation in wheat germ extract. Double-stranded cDNA which was synthesized from the 11.5S mRNA was cloned into Hind Ⅲ site of plasmid pBR 325. A cDNA clone, H24, was identified to code for rbcS. In vitro translation product of the hybridization-selected mRNA was molecular weight 20,000, presumably the precursor of rbcS. The nucleotide sequences of the H24 showed almost complete homology with the sequences encoding the transit peptide of the rbcS-3A gene which was reported by Fluht et al. (1986).

Avian Influenza H9N2 Virus의 HA와 NA 단백질 발현, 정제 및 항혈청 생산

이현지,송병학,김정민,윤상임,김진경,강영식,구용범,전익수,변승준,이윤정,권준헌,박종현,주이석,이영민,Lee, Hyun-Ji,Song, Byung-Hak,Kim, Jeong-Min,Yun, Sang-Im,Kim, Jin-Kyoung,Kang, Young-Sik,Koo, Yong-Bum,Jeon, Ik-Soo,Byun, Sung-June,Lee, Youn-Je 한국미생물학회 2008 미생물학회지 Vol.44 No.3

조류 독감바이러스(avian influenza virus, AIV)는 사람에게서 발생하는 인플루엔자 대유행에 중요한 역할을 한다. 특히 최근 AIV H9N2형에 의한 가금류 감염이 빈번히 나타나고 있어 인체 감염이 상당히 우려되는 실정이다. 본 연구에서는 최종적으로 AIV의 HA와 NA 단백질에 특이적으로 반응하는 항혈청을 생산하고자 하였다. 먼저 감염된 닭에서 분리된 AIV H9N2 한국분리주 A/Ck/Kr/MS96/96의 게놈RNA로부터 RT-PCR 방법으로 HA와 NA 단백질 N-말단부위에 해당하는 염기서열을 증폭하였다. 이렇게 증폭된 DNA단편은 E. coli 발현벡터 pGEX4T-1에 삽입한 후, BL21 세포에서 각각의 GST fusion protein (GST-HAln와 GST-NAn) 형태로 발현하였다. GST-HAln와 GST-NAn은 모두 glutathione sepharose column을 사용하여 분리 및 정제하였으며, 정제된 단배질을 항원으로 사용하여 토끼 항혈청을 생산하였다. 생산된 항혈청의 항원특이성은 AIV H9N2 한국분리주 A/Ck/Kr/MS96/96로 감염된 MDCK 세포의 cell extract를 사용하여 immunoblotting을 수행함으로써 확인하였다. 본 실험결과AIV H9N2의 HA와 NA단백질 N-말단부위에 해당하는 재조합GST fusion protein과, 이들 각각의 단백질에 특이적으로 반응하는 항혈청은 앞으로AIV 감염의 진단 뿐만 아니라, AIV에 대한 기초연구에 중요한 재료로 사용될 것으로 기대한다. Avian influenza virus (AIV) is recognized as key to the emergence of pandemic influenza for humans; there are growing concerns that AIV H9N2 may become more efficient to transmit to humans in the near future, since the infection of poultry with AIV H9N2 has been common in recent years. In this study, we aimed to produce antisera recognizing the HA and NA proteins of AIV H9N2. Initially, coding sequences corresponding to the N-terminal regions of the HA and NA proteins of the Korean AIV H9N2 (A/Ck/Kr/MS96/96) isolated from a domestic chicken were amplified from the genomic RNA. Following cloning of the amplified cDNA fragments into pGEX4T-1 vector, two GST-fusion proteins (GST-HAln and GST-NAn) were expressed in E. coli BL21 and purified with glutathione sepharose columns; the recombinant GST-HAln and GST-NAn proteins were both used as immunogens in rabbits. The antigenicity of the rabbit antisera was analyzed by immunoblotting of the cell lysates prepared from AIV H9N2-infected MDCK cells. Overall, the recombinant HAln and NAn proteins fused to the C-terminus of GST and the rabbit antisera raised against the corresponding recombinant proteins would provide a valuable reagent for AIV diagnosis and basic research.

배양세포에서 Semi-quantitative RT-PCR에 의한 조류인플루엔자 H9N2의 전사활성 분석 최적 시기 결정 및 전사체 분석

나기윤,이영민,변승준,전익수,박종현,조인수,주이석,이윤정,권준헌,구용범,Na, Gi-Youn,Lee, Young-Min,Byun, Sung-June,Jeon, Ik-Soo,Park, Jong-Hyeon,Cho, In-Soo,Joo, Yi-Seok,Lee, Yun-Jung,Kwon, Jun-Hun,Koo, Yong-Bum 한국미생물학회 2009 미생물학회지 Vol.45 No.3

The transcription of mRNA of avian influenza virus is regulated temporally during infection. Therefore, the measurement of transcript level in host cells should be performed before viral release from host cells because errors can occur in the analysis of the transcript levels if the viruses released from the infected cells re-infect cells. In this study, the timing of viral release was determined by measuring the level of viral RNA from viruses released from H9N2-infected chicken fibroblast cell line UMNSAH/DF-1 by semi-quantitative RT-PCR. The viral genomic RNA was isolated together with mouse total RNA which was added to the collected medium as carrier to monitor the viral RNA recovery and to use its GAPDH as an internal control for normalizing reverse transcription reaction as well as PCR reaction. It was found that viral release of H9N2 in the chicken fibroblast cell line UMNSAH/DF-1 took between 16 and 20 h after infection. We measured all 8 viral mRNA levels. Of the 8 transcripts, 7 species of viral mRNAs (each encoding HA, NA, PB1, PB2, NP, M, NS, respectively) except PA mRNA showed robust amplification, indicating these mRNA can be used as targets for amplification to measure transcript levels. These results altogether suggest that the method in this study can be used for screening antiviral materials against viral RNA polymerase as a therapeutic target. 조류인플루엔자 바이러스 mRNA의 전사는 감염 동안에 시간적으로 조절되어진다. 감염 후 세포 내에서 증식된 바이러스가 방출되어 세포를 다시 감염하게 되면 전사 수준 분석에 오차가 발생할 수 있으므로 바이러스가 방출 되기 이전에 전사 수준의 측정이 이루어져야 한다. 본 연구에서는 조류인플루엔자 H9N2를 감염시킨 닭의 섬유아세포주 UMNSAH/DF-1에서 바이러스 감염 후 증식된 바이러스의 방출까지의 시간을 측정하기 위하여 배양액 중에 방출되는 바이러스 RNA 게놈 수준을 semi-quantitative RT-PCR에 의해 측정하였다. 배양액 중의 바이러스 RNA 게놈의 분리 과정에서 발생할 수 있는 RNA 회수율의 오차를 보정하기 위해 mouse의 전체 RNA를 배양액 시료에 넣어서 바이러스 RNA 분리에 carrier로 사용하고 그 속에 포함된 mouse의 GAPDH를 RNA를 역전사 반응 및 PCR의 내부 대조 RNA로 사용하였다. 그 결과 감염 후 방출까지 16~20시간이 소요됨을 알 수 있었다. 따라서 감염 후 12시간 후에 세포 내에서 합성된 8종의 전사체의 수준을 측정하였다. 8종의 mRNA 중 PA를 제외한 7종의 mRNA (HA, NA, PB1, PB2, NP, M, NS를 암호화하는 mRNA)는 뚜렷한 증폭 band를 보였으며, 이것은 이들이 전사활성 측정에 사용될 수 있는 것으로 나타났다. 이상과 같은 전사수준의 측정 방법은 조류인플루엔자 바이러스의 RNA polymerase를 표적으로 한 항바이러스제의 검색에 사용할 수 있을 것으로 보인다.

PCR-Select cDNA Subtraction을 이용한 Allomyces macrogynus의 팡이실의 성장 관련 유전자의 분리

박중규,구용범 인제대학교 1998 仁濟論叢 Vol.14 No.1

Allomyces macrogyuns의 이배체 꼬리홀씨들은, 공세포로 전환된 후, 실뿌리에 이어 팡이실을 형성하는데, 팡이실로 성장하는 과정에서 대기중의 산소의 고갈로 인하여 길이 성장이 급격히 촉진된다. 본 연구에서는, 길이 성장에 관련하는 유전자를 분리하기 위해서 보통의 대기 조건에서 자란 팡이실(Normoxia)과 하나의 탈산소제를 처리한 조건에서 자란 팡이실(Hypoxia)을 수확하여 PCR을 이용한 cDNA subtraction(PVR-select cDNA subtraction)을 수행하였다. PCR로 선택된 subtracted cDNA는 pGEM-T vector에 삽입 후, 대장균에 클로닝하여, 115개의 형질전환체를 무작위적으로 골라 slot blot hybridization을 하였다. 그 결과, 대부분의 클론이 Normoxic 조건에서 보다 Hypoxic 조건에서 다량 발현되는 유전자로나타났으며, 이들 중에서 60개의 클론을 DNA 염기 서열 분석하였더니 19가지의 서로 다른 염기 서열로 동정되었다. 이 유전자들을 Genbank Database와의 유사성을 조사했을 때, 염기 서열상 이미 알려진 유전자와의 유사성이 적었으나, 아미노산 서열상으로는 몇 가지 단백질들과 유사한 것으로 나타났다. 60개의 클론 중에서 높은 빈도로 나타나는 4가지 클론을 northern hybridization하였더니, 대략적으로 각각 0.9kb, 1.9kb, 1.9kb, 2.8kb의 mRNA로 전사되는 것으로, Hypoxic 조건의 팡이실에서 특이적으로 발현되는 것으로 나타났다. Diploid zoospore of Allomyces macrogynus form hyphae after encystment and rhizoid formation. It was the linear growth of hyphae that was stimulated on their growth by oxygen depletion in the atmosphere. In this study, CDNA subtraction with PCR(PCR-select cDNA subtraction) between hyphae incubated under normal atmosphere(Normoxia) and hyphae incubated with an oxygen absorbent(Hypoxia) were performed in order to isolate the genes related to the linear growth. PCR-select Subtracted cDNAs were cloned into E. coli JM 109 using pGEM-T vector. Total 115 transformants were randomly selected and analysed by slot blot hybridization. Most of them were found to be expressed in higher level in Hypoxic condition than in Normoxic condition. Of them, 60 clones were sequenced. They were identified as 19 clones, since nucleotide sequence of 60 clones was identical. Nucleotide homology search of these clones showed no significant homology with known genes, whereas amino acid sequence homology revealed that they had some homology with known proteins. Northern hybridization analysis of 4 frequently appeared clones among 60 clones confirmed that they were expressed in higher level in Hypoxic condition and their mRNA sizes were approximately 0.9kb, 1.9kb, 1.9kb, 2.8kb, respectively.

한우의 간 조직에서 성장단계별로 발현하는 유전자의 분리

윤혜숙,구용범 인제대학교 1998 仁濟論叢 Vol.14 No.1

생명체에서 발현되어지는 여러 종류의 유전자들은 조직 특이적으로, 흑은 성장단계별로 다른 발현 양상을 보인다. 한우의 경우에서도 그 발현 양상이 다른 유전자가 있을 것으로 추정된 바, 한우의 간 조직을 이용하여 성장단계별로 그 발현 정도가 다른 유전자를 탐색하고자 하였다. 성장단계에 따른 유전자 발현의 차이는 생시, 6개월, 12개월, 24개월 된 한우의 간 조직에서 합성한 cDNA의 subtraction과 PCR 방법을 이용하여 탐색하였다. PCR로 증폭한 cDNA library에서 임의적으로 선택한 622개의 clone들을 slot-blot hybridization를 이용하여, 간 조직의 성장단계별로 차이가 나는 140개의 clone을 얻었으며, 140개의 clone 중 101개의 clone은 성장단계가 증가할수록 발현 양상이 점차적으로 증가하는 유전자인 반면, 39 개의 clone에서 얻은 유전자는 태어난 후 6 개월 이내에 급격히 발현이 증가하는 양상을 보였다. 점차적인 증가 양상을 보인 유전자들을 조사한 결과, 생체 내에서 유해한 free radical로부터 조직이나 세포 구조의 손상을 방지하는 역할을 하는 유전자들과 지방의 생합성 및 지방산이나 지방의 이동과 관련이 있는 유전자들인 것으로 생각되어진다. In many organisms, many genes are expressed differentially depending on developmental stages and ages. It was believed that some genes are expressed differentially in bovine liver tissue during growth. To analyzed the differentially expressed genes, cDNAs from bovine liver tissues of 0, 6, 12, 24 months old oxen were used for cDNA subtraction and PCR. 622 clones were randomly selected from the subtracted cDNA clones and were used for slot-blot hybridization to screen the clones showing differential expression. 140 clones out of 622 were found to exhibit different levels of hybridization signal to the cDNA probes prepared from liver tissues of different growth stages. Of 140 clones, 101 clones exhibited incremental expression during postnatal growth up to 24 months, whereas the 39 clones showed abrupt increase in expression within 6 months of age. It seems that some of the genes which showed gradual increase in expression during growth are related to removal of free radicals, and the others are related to biosynthesis or transport of lipids. Key words : cDNA subtraction, bovine liver, differential gene expression.

Penicillin G acylase 유전자의 구조와 발현기작에 관한 연구- I. E. coli ATCC 11105의 penicillin G acylase 유전자의 cloning-

김영창, 구용범, 오상진, 강현삼 忠北大學校 遺傳工學硏究所 1987 遺傳工學硏究 Vol.1 No.1

본문참고

Agrobacterium tumefaciens spheroplast의 연초엽육 Protoplast내의 도입에 관한 세포학적 연구

김정희,구용범,이기영 영남대학교 의과대학 1985 Yeungnam University Journal of Medicine Vol.2 No.1

Polyethlene glycol (PEG)처리에 의한 Agrobacterium tumefaciens spheroplast와 연초 엽육 protoplast의 상호작용을 연구하기 위하여, 효소적 방법으로 분리한 연초엽육 protoplast와 carbenicillin 및 lysozyme의 처리에 의해 제조된 Agrobacterium tumefaciens ATCC 15955 spheroplast를 섞어서 polyethylene glycol(PEG)및 high pH-high Ca²+ buffer를 처리한 후 시료를 취하여 전자현미경으로 관찰한 결과, spheroplast는 초기단계에서 protoplast membrance에 부착하고, 시간이 경과함에 따라 endocytosis에 의해 protoplast의 세포질 내부로 도입된 다음, 점차로 그 형체 (cell integrity)가 파괴되어 지는 것을 관찰 할 수 있었다. 이러한 관찰 결과로부터 spheroplast는 polyethylene glycol(PEG)에 의해 protoplast내부로 endocytosis되어짐을 알 수 있었다. Agrobacterium tumefaciens induces cancerous growths called crown galls at wound site on dicotyledonous plants. A large plasmid called Ti plasmid is responsible for virulence. Upon tumor induction, part of the plasmid, termed T-DNA, becomes integrated into plant genome and its genetic sequences are expressed. These properties allow Ti plasmids to be used as genevectors in plants. Several in vitro methods for the transfer of Ti plasmid into plant cell have been developed. One of them is the treatment of bacterial spheroplasts and plant protoplasts mixture with polyethylene glycol that is generally used as fusogen in cell-to-cell fusion. Several workers investigated the interaction of bacterial spheroplasts with plant protoplasts in the presence of polyethylene glycol and suggested that the interaction is not fusion but endocytosis. In this report we observed the interaction of Agrobacterium tumefaciens spheroplasts with Nicotiana tabacum protoplasts by electron microscope. Agrobacterium tumefaciens spheroplast and Nicotiana tabacum protoplasts were prepared and mixed in the presence of polyethylene glycol and high pH-high Ca²+ buffer. Than the interaction of the spheroplasts with the protoplasts was examined by transmission electron microscope. After the treatment of polyethylene glycol the spheroplasts adhered to the surface of the protoplasts and then they were engulfed by the protoplasts. After the high pH-high Ca²+ buffer treatment the engulfed spheroplasts lost their cell integrity. No fusion process was observed. Thus all these observations suggest that the introduction process of Agrobacterium tumefaciens spheroplasts into Nicotiana tabacum protoplasts with the aid of polyethylene glycol is endocytosis.

Pleurotus ostreatus 미토콘드리아의 7.2 kb 선상 플라스미드 DNA의 분석

윤혜숙,구용범 인제대학교 1998 仁濟論叢 Vol.14 No.2

Pleurotus ostreatus에서는 10.2 kb와 7.2 kb의 미토콘드리아 선상 플라스미드 DNA가 존재함이 발견되었다. 이 플라스미드 DNA의 양쪽 5´ -말단에는 단백질이 공유 결합되어있다고 알려져 있다. 최근에 P. ostreatus의 10.2 kb 미토콘드리아 선상 플라미드 DNA를 다른 곰팡이의 선상 플라스미드 DNA에 존재하는 open reading frame과 비교 분석한 결과, Podospora anserina의 Plasmid pAL2의 DNA polymerase 및 RNA polymerase coding regoin과 유사성이 있음이 확인되었다. 본 연구에서는 7.2 kb 선상 플라스미드 DNA를 Hind Ⅲ로 잘라서 얻은 2 조각의 절편(4.7 kb, 2.3 kb)을 클로닝하고 염기 서열을 분석하였다. 클로닝된 7 kb 절편에는 3개의 open reading frames(2982bp(993 a.a), 270bp(900 a.a), 771bp(256 a.a))이 존재함을 관찰하였다. 또한 이들의 open reading frame을 분석한 결과, DNA polymerase와 RNA polymerase coding region과 유사성이 있음을 확인하였다. Two linear plasmid-like DNAs, 10.2 kb and 7.2 kb were found in the mitochondria of P. ostreatus. They have covalently linked 5'-terminal proteins in both ends. Two continuous fragments of 4.7 kb and 2.3 kb from 7.2 kb DNA were cloned and sequenced. Two long open reading frames(ORF 1; 2982 bp, 993 a.a and ORF 2; 2703 bp, 900 a.a) and one short open reading frame(ORF 3; 771 bp, 256 a.a) were found in the 7.2 kb plasmid. The putative ORF 1 and ORF 2 have conserved motifs of DNA polymerases and RNA polymerases, respectively, while the ORF 3 has homologous regions with phosphatase and hypothetical protein from Plasmodium, and also with adhesine from Mycoplama.

한국산 Agrobacterium plasmid의 유전학적 성상에 관한 연구

김정희,정재규,구용범,이기영 영남대학교 의과대학 1984 Yeungnam University Journal of Medicine Vol.1 No.1

한국형 Agrobacterium tumefaciens의 분리 및 tumor inducing (Ti) Plasmid의 유전적 특성을 비교 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다. Agrobacterium균은 사과나무(A₁-A₃), 미류나무 (W₁-??), 은사씨나무(P₁-P₃) 및 장미(R₁)의 crown gall tumor에서 도합 13종을 분리 하였으며 각 군의 plasmid를 관찰한 결과 ATCC 15955보다 P₁ 및 A₂가 크기가 컸으며 W₂ ,W₃,?? 및 P₃는작았으며 각균의 tumor 유도는 해바라기에 ATCC 15955와 Korean type W₂(KW₂)을 접종한 것에서만 각각 접종 4주 및 6주만에 crown gall을 관찰하였다. 아울러 두 균종의 T₁plasmid(pT₁)를 정제하여 몇종의 제한효소를 처리 하였으며 pT₁ ATCC 15955와 pT₁KW₂는 EcoRⅠ처리로 25개 및 27개의 band를, HindⅢ로 23개와 21개, BamHⅠ으로 각 각 20개 및 HpaⅠ으로 12개 및 27개의 band를 관찰하였으며 크기는pT₁ ATCC15955가 200 kbases (kb)로 pT₁ KW₂가 87KB로 관찰되었다. 아울러 octopine은 W₁-?? 및 P₁-P₃균에 의한 tumor조직에 관찰 되었고 이들균을 octopine type균으로 사료 되었다. The soil bacterium Agrobacterium tumefaciens is a plant pathogen that causes crown gall tumors by infecting the wounded dicotyledonous plants and subsequent integration of bacterial DNA into plant nuclear DNA. Virulent A. tumefaciens strains harbor a large Ti (tumor-inducing) plasmid that carries genes essential for tumorigenesis. In the present study, 13 strains (Malus pumila Mill; ??, Populus monilifera; ??, Populus tomentiglandlosa; ?? and Rosa species; R₁) of Agrobacterium isolated in korean crown gall tumors and plasmids were observed in 6 strains (W₂, W₃, ??, P₁,P₃ and A₂). The test for crown gall tumor formation was resulted only in ATCC15955 and KW₂ strains inoculated into the stem of sun flower and the development was observed for 4 and 6 weeks after inoculation. Above two Ti plasmid (pTi) were purified by cesium chloride-ethidium bromide density gradient centrifugation and digested with restriction enzyme and fragments of pTiATCC 15955 and pTikw₂observed by EcoRI; 25&27, Hind Ⅲ; 23&21,BamH I; each 20 and Hpa I; 12&27, and sizes of pTiATCC15955 and and pTiKW₂calculated as 200 and 87 kbases Octopine was isolated from tumor tissue(?? and ??) and these strains confirmed as octopine type.