혈전용해효소의 경구투여에 의한 생체 내 작용

이영훈(Young-Hoon Lee),이성호(Sung-Ho Lee),박기훈(Ki-Hoon Park),최영주(Young-Ju Choi),이상원(Sang-Won Lee),김철호(Cheol-Ho Kim),조수정(Soo-Jeong Cho),갈상완(Sang-Wan Gal) 한국생물공학회 2006 KSBB Journal Vol.21 No.6

질소고정균의 성장과 질소고정력에 대한 osmoprotectant 의 영향

최영주,갈상완 ( Young Ju Choi,Sang Wan Gal ) 한국응용생명화학회 1998 Applied Biological Chemistry (Appl Biol Chem) Vol.41 No.1

The Rhizobium and Azospirillum spp. were isolated from the root nodules of several leguminous plants and rhizosphere of various paddy rice varieties. The growth of the nitrogen-fixing strains isolated was largely inhibited in yeast extract-mannitol medium (AMA) containing 0.6 M NaCl. In response to osmotic stress, the nitrogen-fixing strains accumulate intracellular free glutamate. The growth and nitrogenase activity of Rhizobium and Azospirillum were increased by addition of osmoprotectants such as proline, glycine betaine, and glutamate during salt stress. Glycine betaine was the most effective among exogenous osmoprotectants tested. In the absence of sodium chloride, nitrogenase activity seem to be slightly decreased by the presence of the proline or glycine betaine. These results revealed that nitrogenase activity was repressed by fixed nitrogens such as proline or glycine betaine.

참나무 목초액의 항균 및 항산화 활성과 일산화질소 합성 저해연구

정일선,김유정,갈상완,최영주,Jung, Il-Sun,Kim, Yu-Jung,Gal, Sang-Wan,Choi, Young-Ju 한국생명과학회 2007 생명과학회지 Vol.17 No.1

참나무 목초액은 예로부터 농축산업에 이용되어 왔으며 최근에는 항균 및 항산화 효과가 있는 것으로 밝혀지면서 목초액에 대한 과학적인 연구가 활발히 진행되고 있다. 참나무 목초액의 항균 및 항산화 활성과 면역기능에 미치는 영향을 조사하였다. 참나무 목초액의 항균활성은 식품 부패균 및 치주질환 원인균에 대하여 항균활성을 조사하였는데 목초액 $50{\mu}l$ 첨가시 대부분의 식품부패균 및 치주질환 원인균의 생육이 현저히 저해되었다. 참나무 목초액의 항산화력은 DPPH법에서 $20{\mu}l$ 첨가시 95%의 라디칼 소거능을 보였으며 SOD유사활성은 $50{\mu}l$ 첨가시 65%의 항산화력을 나타내었다. 참나무 목초액의 항염증효과는 세균의 LPS를 처리하여 유도된 RAW264.7 세포에서 조사되었는데 LPS를 처리하여 유도된 NO 활성을 현저히 감소(86%)시켰으며 이 농도에서 세포독성 없이 높은 면역 효과를 나타내었다. This study was carried out to investigate the biological effects oak wood vinegar. Antimicrobial activity was tested in five microbial species at the concentration of 5 to $50{\mu}l$ of oak wood vinegar by paper disc method. Growth of P. oleovoranse, P. vulgaris, E. coli, S. aureus and Prevotella intermedia was inhibited at a dose of as low as $50{\mu}l$ of oak wood vinegar. Antioxidant activities were measured by using DPPH radical scavenging and SOD-like activity. DPPH radical scavenging and SOD-like activities were 90% and 65% at the concentration of $25{\mu}l\;and\;50{\mu}l$ of oak wood vinegar, respectively. Stimulation of the macrophages RAW264.7 cells with lipopolysaccharide (LPS) resulted in increased production of nitric oxide (NO) in the medium. However, the oak wood vinegar showed marked inhibition of NO synthesis in a dose-dependent manner. This result suggest that oak wood vinegar plays significant role for activation of immune system in the pathogenesis of inflammatory diseases.

청각추출물의 항산화 및 일산화질소 합성 저해 연구

김유정,정일선,최인순,갈상완,최영주,Kim, Yu-Jung,Jung, Il-Sun,Choi, In-Soon,Gal, Sang-Wan,Choi, Young-Ju 한국생명과학회 2006 생명과학회지 Vol.16 No.5

청각은 녹조류로서 김치의 부재료로 널리 사용되는 것으로 청각 추출물이 젖산균의 생육 및 cellulase 활성에 미치는 영향과 항산화 및 면역기능에 미치는 영향을 조사하였다. 청각추출물이 젖산균의 생육에 미치는 영향은 김치의 중기이후 젖산 생성에 중요한 Lactobacillus plantarum KCTC 3105의 생육을 2배정도 촉진하였으며 과숙 김치의 경도유지에 중요한 cellulase의 활성을 약 60% 정도 저해하는 효과를 보였다. 청각추출물의 항산화력은 DPPH 방법이나 SOD 유사활성등에서 비슷한 항산화력을 나타내고 있으며 특히 ethyl acetate 층에서 높은 항산화력을 나타내었는데 이러한 결과는 청각에 존재한 phenolic compound가 관여하는 것으로 생각된다. 청각추출물의 항염증효과는 RAW264.7 세포에서 조사되었는데 특히 치주질환균에서 유도된 LPS를 처리하여 유도된 NO 활성을 현저히 감소시킴으로서 높은 항염증 효과를 나타내었으며 이러한 결과는 iNOS 활성에서도 유사한 결과를 나타내었다. This study was carried out to investigate the biological effects from Codium fragile. Methanol extract of Codium fragile increased two times at 2500 ㎍/ml the growth of Lactobacillus plantarum that associated with probiotic properties of lactic acid bacteria of Kimchi. Ethyl acetate extract of Codium fragile inhibited the cellulase activity up to approximately 60% at $2500\;{\mu}g/ml$. Methanol extract of Codium fragile was fractionated into several subfractions and their antioxidant activities were measured by using DPPH radical scavenging and SOD-like activity. Especially the antioxidative activity of ethyl acetate fraction was shown higher than that of other fractions and its fraction showed higher contents of total phenolic compounds, indicating the positive relationship between DPPH radical scavenging effect and total polyphenol content. Stimulation of the macrophages RAW264.7 cells with lipopolysaccharide (LPS) resulted in increased production of nitric oxide (NO) in the medium. However, the methanol extract of Codium fragile showed marked inhibition of NO synthesis in a dose-dependent manner. This result suggest that Codium fragile plays significant role for activation of immune system in the pathogenesis of inflammatory diseases.

포도와 오이즙액을 이용한 동충하초(Paecilomyces japonica) 균사체 배양액의 피부 주름개선효과

이영훈,최우식,박기훈,최영주,갈상완,Lee Young-Hoon,Choi U-Sic,Park Ki-Hoon,Choi Young-Ju,Gal Sang-Wan 한국생명과학회 2006 생명과학회지 Vol.16 No.3

포도와 오이즙액에 동충하초 균사체 배양액을 화장품으로서의 이용가능성을 조사하였다. 콜라겐 생성촉진 효과에서는 사람의 섬유아세포에서 시험물질 $0.1{\sim}0.5%$ 농도에서 콜라겐 생합성을 증가시키는 것을 관찰하여 동충하초 균사체 배양액은 적절한 농도에서 세포내 콜라겐 생성을 증가시키는 것으로 판단하였다. 포도와 오이즙액에 동충하초 균사체 배양액의 항산화효과에서는 항산화제인 Vit. C와 함께 SOD 활성능을 측정한 결과 동충하초 균사체 배양액이 0.01% 부터 1.0% 범위에서 농도의존적으로 SOD 활성을 증가시켜 0.1% 에서는 약 50% 정도 1.0% 에서는 90% 정도의 슈퍼옥사이드 라디칼을 소거시키는 것으로 나타났다. 항 혈액응고제로 알려진 퀘르세틴의 함량증가에서는 최초 포도와 오이즙액보다 배양 후의 농도가 약 15배 이상 증가하여 피부의 항 혈액응고에도 효과가 있을 것으로 판단되며, 이를 인체에 대한 자극시험을 실시한 결과 30명의 피검자 모두에게서 피부자극이 전혀 일어나지 않음을 확인하여 인체에 무해한 것으로 판단되었다. 따라서 포도와 오이즙액에 동충하초 균사체 배양액은 피부에 대한 부작용이 전혀 없으며 주름개선효과 및 항산화 활성을 갖는 기능성 화장재료로서의 이용 가치가 매우 높을 것으로 사료된다. The possibility of usage as cosmetic resource of the mycelial culture broth of P. japonica in the mixture of cucumber and grape extracts was investigated. In the effect of collagen synthesis promotion in human fibroblast cells, the culture broth of P. japonica of 0.1, 0.5 and 1.0% concentration increased the amount of collagen synthesis than that of control cells. The culture broth increased the SOD activity in the concentration dependant manner of 0.01% to 1.0% in the antioxydation activity test. About 90% of superoxide radical was eliminated by 0.5% concentration of the culture supernatant in the antioxydation test. Anticoagulant quercetin in the course of mycelial growth in the mixture of cucumber and grape extract was accumulated to 15 folds than that of pre-culture. In the skin safety test of the culture broth, there is no any skin damage signal in the tested 30 people. Taken together, we concluded that the culture broth of P. japonica in the mixture of grape and cucumber extracts can be used as a cosmetic resource.

뽕잎 추출물을 이용한 동충하초(Paecilomyces japonica) 균사체 배양액의 멜라닌 합성 억제 효과

박상상,류영배,이영훈,조용운,조수정,최영주,박기훈,갈상완,Park, Sang-Sang,Ryu, Young-Bae,Lee, Young-Hoon,Cho, Yong-Un,Cho, Soo-Jeong,Choi, Young-Ju,Park, Ki-Hoon,Gal, Sang-Wan 한국생명과학회 2007 생명과학회지 Vol.17 No.6

본 연구는 뽕잎 추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액의 in vivo, in vitro멜라닌 생성 억제 효과를 조사한 것이다. 뽕잎 추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액은 10~50%의 농도 의존적으로 시험관 내에서 멜라닌 합성관련 효소활성의 저해를 나타냈다. 뽕잎 추출물 자체는 mouse melanoma cell (B16BL6)에 대한 세포독성을 보였으며 IC$_{50}$%값이 약 7% 농도로 나타난 반면, 뽕잎 추출물을 이용한 동충하초 균사체배양액은 50% 농도에서도 어떠한 세포독성도 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다. 또한 B16BL6 mouse melanoma cell의 세포 내 멜라닌 생합성 억제에 대해서도 높은 활성을 나타내었다. 따라서, 뽕잎 추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액은 세포에 대한 독성이 전혀 없으며, 멜라닌 생합성 저해 작용이 우수하여 피부 미백용 화장료 조성물로서의 이용 가능성이 확인 되었다. This study was carried out to investigate the whitening effect of mycelial culture broth of P. japonica in the mulberry leaf extract. The culture broth inhibited melanin synthesis in vitro in the concentration dependent manner of 10 to 50%. The mulberry leaf extract itself has a cytotoxicity to the mouse melanoma cell, B16BL6 with the value of IC$_{50}$ of 7% concentration. But the culture broth of P. japonica in the mulberry leaf extract did not show any cytotoxicity up to 50%. Therefore, we concluded the mycelial culture broth of P. japonica in the extract of mulberry leaf can be used as a whitening cosmetic resource.

Bacillus subtilis BB-1으로부터 나토키나아제 유전자 크로닝 및 대량발현

이영훈,이성호,박기훈,최영주,정영기,갈상완,Lee Young-Hoon,Lee Sung-Ho,Park Ki-Hoon,Choi Young-Ju,Jeong Yong-Kee,Gal Sang-Wan 한국생명과학회 2006 생명과학회지 Vol.16 No.2

흑두청국으로부터 분리된 혈전용해력이 우수한 Bacillus subtilis BB-1(KFCC 11344P)으로부터 혈전용해효소 유전자를 PCR법에 의해 크로닝하였고 이를 BCF-1으로 명명하였다. BCF-1의 DNA 염기서열결정 결과 1,145 bp 크기의 혈전용해 효소로, 일본의 natto로부터 분리된 nattokinase 유전자와 99%의 상동성을 보임을 확인하였다. 혈전용해효소 유전자의 발현을 위하여 Bacillus 발현계인 Bacillus-E. coli의 shuttle vector인 pEB vector에 크로닝 하고 host로서 B. subtilis 168에 형질전환시켜 대량 발현시켰다. 생산된 혈전용해효소의 최 적활성 pH와 온도는 7.0과 $35^{\circ}C$로 확인되었다, 기질에 대한 분해양상을 조사한 결과 fibrin에서만 특이적으로 강한 분해가 일어났으며, skim milk에서 아주 약한 분해능을 보였으나 blood agar, gelatin, casein에서는 전혀 분해능을 보이지 않았다. 특히 blood agar plate에서 분해능이 없는 것으로 보아 혈액 내에서의 적혈구 파괴현상과 같은 부작용에 대한 위험을 배제할 수 있을 것으로 사료된다. BCF-1에 의해 생산된 혈전용해효소는 fibrin 특이적으로 활성을 나타냄을 확인할 수 있으며, 이는 임상적이나 산업적으로 적용하였을 때 부작용에 대한 위험적인 문제는 배제될 수 있으리라 생각된다. A fibrinolytic enzyme gene was isolated from Bacillus subtilis BB-1 by PCR method. Primers for PCR cloning were designed according to pre-identified gene for fibrinolytic enzymes from B. subtilis. The primer sequences were 5'-CGG ATC CGT GAG AGG CAA AAA GGT G-3' and 5'-TGA ATT CTT AAT GTG CTG CTG CTT GTC C-3' as concensus sequences of the fibrinolytic genes of Bacillus species. The PCR product was 1,145 bp and the sequence homology was 99% with nattokinase gene isolated from Japanese natto. The cloned fibrinolytic gene was reconstructed in Bacillus-E. coli shuttle vector, pEB for bulk-production. The fibrinolytic enzyme was purified by FPLC from the cloned B. subtilis 168. The optimum pH and temperature of the enzyme were 7.0 and $35^{\circ}C$, respectively. The fibrinolytic enzyme did not show any activity toward to skim milk, gelatin, casein and blood agar plate. The enzyme specific polyclonal antibody was prepared in rabbit for further assays such as detection of the gene expression in plant cells. This means that the enzyme may be used for health-care such as thrombosis without any hamful effects in the blood vessel.

흑두로 제조한 청국에서 분리된 Bacillus subtillus BB-1으로 부터 혈전용해효소 유전자 크로닝 및 특성규명

이영훈,이성호,전주미,김홍출,조용운,박기훈,최영주,갈상완,Lee Young-Hoon,Lee Sung-Ho,Jeon Ju-Mi,Kim Hong-Chul,Cho Yong-Un,Park Ki-Hoon,Choi Young-Ju,Gal Sang-Wan 한국생명과학회 2005 생명과학회지 Vol.15 No.4

흑두로 제조한 청국으로부터 혈전용해력이 우수한 균을 선발하여 동정하였으며, 그를 Bacillus subtilis BB-1로 명명하였다. 이 균은 혈전용해효소 isozyme을 적어도 5개이상 생성하는 균주로 확인되었다. 이 균으로부터 크로모좀을 분리하여 shot gun법으로 혈전용해효소 유전자를 크로닝하였으며, 이 유전자를 BSF-1이라 명명하였다. 이 유전자는 714개의 아미노산을 암호화하고 있으며 기존에 밝혀진 혈전용해효소 유전자와 상동성은 검출되지 않은 새로운 혈전용해효소 유전자였다. 혈전용해효소활성 최적 pH 및 온도는 5.0과 $35^{\circ}C$였다. 기질특이성은 적혈구 배지 또는 skim milk, gelatin등에 전혀 분해활성이 없었다. 이는 혈전만을 특이적으로 분해하는 기질특이성을 보였으며, 혈전분해효소로서의 이용가능성이 충분한 것으로 판단된다. A bacterium producing five fibrinolytic isozymes was isolated from black bean chung kuk. The bacterium was identified as Bacillus subtilis BB-1 by 16s rDNA sequence homology search. A gene out of five fibrinolytic genes in the Bacillus subtilis BB-1 was cloned by shot-gun method. A Cla I DNA fragment of B. subtilis BB-1 chromosome was cloned in to pBluescript II SK(-) and showed the fibrinolytic activity to bacterial cells. The Cla I DNA fragment was sequenced and the sequences did not show homology with gene for protease or fibrinolytic enzyme genes in other organisms. The Cla I DNA fragment was reduced to 2,142 bp by activity-guided PCR cloning method. The optimum pH and temperature of the enzyme were 5.0 and $35^{\circ}C$, respectively. Substrate specificity of the fibrinolytic enzyme was detected in skim milk, casein, gelatin and blood agar plates. The activity of the enzyme was not detected with these substrates. Taken together, this enzyme is a new fibrinolytic enzyme and may be used to prevent thrombosis and arteriosclerosis.

포도와 오이즙액을 이용한 동충하초(Paecilomyces japonica) 균사체 배양액의 미백효과

이영훈,박상상,이상원,이성호,박기훈,최영주,갈상완,Lee, Young-Hoon,Park, Sang-Sang,Lee, Sang-Won,Lee, Sung-Ho,Park, Ki-Hoon,Choi, Young-Ju,Gal, Sang-Wan 한국생명과학회 2006 생명과학회지 Vol.16 No.5

포도와 오이즙액에 동충하초 균사체 배양액의 미백화장품 원료로서의 이용가능성을 조사하였다. B16BL6 mouse melanoma cell에 동충하초 균사체 배양액을 배양기간 및 농도별로 처리했을 때, 15일 동안의 배양조건과 $50\;{\mu}l/ml$ (5%)의 농도로 처리하였을 때 멜라닌 생성억제 효과가 가장 높은 것을 확인하였다. In vitro tyrosinase 활성억제효과에서는 포도와 오이즙액에 동충하초 균사체 배양액을 10% 농도로 첨가시 50%의 멜라닌 생성 억제율을 보였으며, 30% 농도에서는 100% 억제를 확인하였다. 결과적으로 포도와 오이즙액에 동충하초 균사체 배양액은 멜라닌 생성의 주 효소인 tyrosinase의 작용을 억제함으로써 미백 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 또한 세포독성실험에서 포도, 오이즙액과 그 즙액에 동충하초 균사체 배양액을 각각의 농도로 B16BL6 mouse melanoma cell에 처리 한 결과 포도, 오이즙액의 5% 처리 시에는 50% 사멸, 9% 이상에서는 100% 세포가 사멸하는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 포도, 오이즙액에 동충하초 균사체를 배양한 배양액은 20% 까지 처리 시에도 세포독성이 나타나지 않는 것을 확인 하였다. 따라서 포도와 오이즙액에 동충하초 균사체를 배양한 배양액은 세포 독성이 없으며, 미백 효과가 뛰어난 것으로 미백화장품 원료로서 사용가능함을 확인하였다. This study was carried out to investigate the whitening effect of mycelial culture broth of P. japonica in the mixture of cucumber and grape extracts. In the inhibition test of melanin biosynthesis of melanoma cell, B16BL6, the culture broth of P. japonica more then $50\;{\mu}l/ml$ (5%) concentration inhibited the melanin biosynthesis of the cell entirely without cytotoxicity. More then 10 days incubation of P. japonica in the mixture was required to have the inhibition activity. In vitro inhibition test of melanin biosynthesis of the culture broth of P. japonica was investigated in the concentration dependent manner of 10% to 50%. 30% concentration of the culture broth inhibited completely tyrosinase activity. In the cytotoxicity test, cucumber and grape extract itself has a strong cytotoxicity to the melanoma cell, B16Bl6. The value of $IC_{50}$ of the cucumber and grape extracts against the melanoma cells was 5% concentration. However, the culture broth of P. japonica incubated in the cucumber and grape extracts did not show the cytotoxcity up to 20% against melanoma cell, B16BL6. Therefore, we concluded that the culture broth of P. japonica in the mixture of cucumber and grape extracts can be used as a whitening cosmetic resource.

상황버섯균사체배양액에 침지한 발아현미의 항산화 및 nitric oxide 합성저해에 관한 연구

정일선,김유정,최인순,최은영,신수화,갈상완,최영주,Jung, Il-Sun,Kim, Yu-Jung,Choi, In-Soon,Choi, Eun-Young,Shin, Su-Hwa,Gal, Sang-Wan,Choi, Young-Ju 한국생명과학회 2007 생명과학회지 Vol.17 No.8

현미와 먹기에 용이하고 영양적 가치를 높인 발아현미 및 발아현미에 상황버섯 균사체를 배양액을 침지한 상황버섯 발아현미의 항산화, 변역기능과 여러 가지 생리호적 기능을 하는 유리아미노산 함량을 비교하였다. 발아현미 및 상황버섯발아현미의 주요 유리아미노산은 pro, ile, leu, aromatic amino acid, GABA 및 lysine 등으로 현미에 비하여 발아과정에서 유리아미노산함량이 크게 증가 하는 것으로 나타났으며, 그 중에서도 상황버섯발아현미의 유리아미노산이 가장 높게 나타났다. 일반현미와 발아현미 및 상황버섯발아현미의 메탄올 추출물의 DPPH 소거능과 SOD 유사활성은 모든 시료에서 농도 의존적으로 증가하였으며, 특히 발아현미의 전자공여능 및 SOD 유사활성이 높게 나타났다. 상황버섯발아현미 추출물의 항산화력은 DPPH 법에서 5 mg/ml 농도에서 65% 이상의 라디칼 소거능을 보였으며, SOD 유사활성은 10 mg/ml 농도에서 약 70% 의 SOD 유사 활성을 나타내었다. 일반현미와 발아현미 및 상황버섯발아현미의 면역기능은 세균의 LPS를 처리하여 유도된 RAW264.7 세포에서 조사되었는데 LPS를 처리하여 유도된 NO 활성을 400 μg/ml 농도로 상황버섯발아현미 추출물을 첨가함으로써 약 80%까지 NO합성을 현저히 감소시켰으며, 이 농도에서 세포독성이 없는 것으로 MTT assay 에 의하여 확인하였다. This study investigated the effects on the biological activities of germinated brown rice soaked in mycelial culture broth of Phellinus linteus. The level of free amino acid was higher in the GBRP extract than those of BR and GBR. The major free amino acids were alanine, valine, isoleucine and methionine in both extracts. The level of ${\gamma}$-aminobutyric acid (GABA) was also increased significantly in the GBR and GBRP. Antioxidant activities of methanol extract of BR, GBR and GBRP were measured by using DPPH radical scavenging and SOD-like activity. Antioxidant activities showed the highest level of 83% and 76% when 100 mg/ml GBR and GBRP, respectively. Stimulation of the macrophages RAW264.7 cells with lipopolysaccharide (LPS) resulted in increased production of nitric oxide (NO) in the medium. However, the methanol extract of GBR and GBRP showed marked inhibition of NO synthesis in a does-dependant manner. These results showed that GBR and GBRP were significant role for activation of immune system in the pathogenesis of inflammatory diseases.