Molecular Genetic Analysis of Gene Mutations Associated with NDP-Related Retinopathy

송재신 서울대학교 대학원 2021 국내석사

Introduction: NDP-related retinopathy is a group of diseases characterized by visual impairment with various retinal abnormalities due to fibrous and vascular changes in the retina at birth, and is caused by deficits in the expression of Norrin protein due to an abnormality in the NDP gene. Congenital retinal diseases such as Norrie disease (ND), persistent fetal vasculature (PFV), familial exudative vitreoretinopathy (FEVR), retinopathy of prematurity (ROP), and Coats disease are diseases associated with these abnormalities of the NDP gene. This study was to investigate the methods to determine associated genes and the mechanism how the gene abnormalities lead to the corresponding phenotype. Materials and Methods: The basic principle of collecting studies of molecular genetic analysis of NDP-related retinopathy was to first divide by its disease type and search for papers to clarify the molecular genetic causes. A total of 41 papers were selected for phenotypic abnormalities caused by NDP gene abnormalities and their association with ND. Among them, a total of 7 papers related to the extraocular phenotype of ND were selected, and a total of 6 studies for genetic familial linkage analysis were selected. A total of 11 studies were referenced as papers on related genes of encoding membrane proteins in the Wnt signaling pathway. For molecular genetic analysis studies of NDP-related retinopathy other than ND, a total of 5 studies for PVF, 8 studies for FEVR, 6 studies for ROP, and 4 studies for Coats disease were selected. For each study, there were cases where the categories to be overlapped, and totally 65 studies were selected. Results: Molecular genetic analysis of the NDP gene started with sequencing commonly in the selected studies. If no pathogenic mutations were found in the sequencing, a deletion/duplicate analysis was additionally performed. Multi-gene panel containing NDP and other genes of interest was used to analyze to identify other genes that may affect the expression of the disease. Genetic linkage analysis was also conducted to understand the accurate clinical diagnosis in family members and the genetic relationship between affected family members. NDP gene, which is a key gene encoding the Norrin protein required for normal retinal vascular development, has been identified as the causative gene of ND. For PFV, mutations in the NDP and FZD4 genes have been reported, but in some cases these results were not reproducible, suggesting that various factors related to angiogenesis and development and other genes may be involved. For FEVR, genes related to the Wnt signaling pathway, NDP, FZD4, LRP5, and TSPAN12 mutations were reported and KIF11 and ZNF408 were also identified as genes associated with disease; suggesting the disease is related to a pathway that plays a major role in retinal angiogenesis. Likewise, for ROP, it has been reported that genetic mutations of NDP, FZD4 and LRP5 are indicated as associated genes. Coats disease has also been reported to be associated with genes including NDP, CRB1 and PANK2, but the main causative gene still needs further research. The pathogenic phenotype of the retina in NDP-related retinopathy and the non-retinal clinical phenotypes have variability within and among families, and many results have been reported on the relationship between the mutation patterns of the NDP gene and the phenotypes. Finally, a Norrin-deficient mouse model was used to study the disease etiology and gene products from a molecular genetic point of view, and the phenotype showed impaired retinal vascular development due to inadequate retinal vascular growth and abnormal persistence of the hyaloid vascular system. Conclusions: ND, PFV, FEVR, ROP, and Coats disease, which have been well known as distinct disease, are disease group that has a common point in that having a deficit in normal retinal vascular development associated with the mutation of NDP. Such molecular genetic studies of congenital retinal disease should continue to be carried out, and may play an important role in development of genetic treatments such as genome editing in the future. 서론: NDP 관련 망막병증은 NDP 유전자의 이상으로 인해 Norrin 단백질 발현에 문제가 생기게 되고, 이로 인해 출생 시 망막의 섬유성, 혈관성 변화로 인해 다양한 망막의 이상을 일으켜 시각 장애를 나타내는 질환이다. 노리에병, 잔류태아혈관, 가족삼출유리체망막병증, 미숙아망막병증, 코우츠병과 같은 선천 망막질환이 이러한 NDP 유전자의 이상과 관련이 있는 질환이다. 본 연구는 각 질환들을 일으키는 관련 유전자를 결정하는 분자유전학적 분석 방법과 유전자 이상이 그와 상응하는 표현형으로 발현되는 메커니즘을 조사하고자 한다. 방법: NDP 관련 망막병증의 분자유전학적 분석에 대한 연구들을 수집할 때 먼저 질환별로 나누어서 분자유전학적 연구 방법 및 결과에 대해 정리하였다. NDP 유전자의 이상으로 인한 비정상 표현형 및 노리에병과의 연관성에 대한 연구는 총 41편 선택되었고, 그 중 노리에병의 안구 외 표현형에 대한 연구가 7편, 유전 연관 연구에 대한 연구가 6편 포함되어 있었다. Wnt 신호전달경로의 구성이 되는 막단백질 및 암호화하는 유전자에 대한 연구는 11편 선택되었다. 노리에병 외의 NDP 관련 망막병증에 대한 연구로는 잔류태아혈관은 5편, 가족삼출유리체망막병증은 8편, 미숙아망막병증은 6편, 그리고 코우츠병은 4편의 관련 연구를 선택하였다. 각 연구는 상기 분류에서 겹치는 경우가 있었으며 총 65편의 연구가 선택되었다. 결과: NDP 유전자의 분자유전학적 분석은 염기서열 분석부터 시작되었다. NDP 관련 망막병증이 의심되는 환자에서 시행된 염기서열 분석에서 병원성 변이가 발견되지 않으면, 결실/중복 분석을 추가로 수행하였다. NDP 이외에도 질병의 발현에 영향을 미칠 수 있는 다른 유전자들을 알기 위해 NDP 및 다른 관심 유전자를 포함하는 다중 유전자 패널을 사용하여 분석하였다. NDP 관련 망막병증의 영향을 받은 가족 구성원의 정확한 임상진단과 가족의 유전적 관계를 이해하기 위해 유전적 연관분석도 시행되었다. 노리에병의 원인 유전자로는 정상 망막혈관 발생을 위해 필요한 Norrin 단백질을 암호화하는 핵심 유전자인 NDP 유전자가 밝혀졌다. 잔류태아혈관의 경우 NDP 및 FZD4 유전자의 돌연변이가 보고된 바 있으나, 어떤 경우에는 이런 결과가 재현되지 않아 혈관 형성 및 발달 관련 여러 요인과 다른 유전자가 관련될 수 있음을 시사한다. 가족삼출유리체망막병증은 Wnt 신호 경로와 관련된 NDP, FZD4, LRP5, TSPAN12를 포함하여 KIF11, ZNF408도 질환과 연관된 유전자로 밝혀졌으며, 망막혈관형성에 주요한 역할을 하는 경로와 연관되어 있다는 것을 알 수 있다. 미숙아망막병증도 마찬가지로 NDP, FZD4 및 LRP5의 유전자 변형이 질환의 발생과 연관이 되어있다는 것이 보고되었으며 코우츠병도 NDP를 비롯한 CRB1, PANK2 유전자도 질환과 관련이 있다고 보고된 바 있으나 아직 주요 원인유전자에 대해서는 추후 후속 연구가 필요하다. NDP 관련 망막병증의 망막의 병원성 표현형과 또 망막 외에도 나타나는 비망막성 임상적 표현형은 가족내, 그리고 가족간의 가변성이 있으며, NDP 유전자의 변이 양상 및 위치와 표현형간에 관계에 대해 많은 결과들이 보고되었다. 마지막으로 분자유전학적 관점에서의 질환의 병인론 및 유전자 산물에 대한 연구로 Norrin 결핍 마우스 모델이 사용되었고 표현형은 부적절한 망막 혈관 성장과 유리체 혈관계의 비정상적인 지속성으로 손상된 망막 혈관 발달을 보여주었다. 결론: 본 보고의 핵심은 그동안 우리가 잘 알고 있었던 노리에병, 잔류태아혈관, 가족삼출유리체망막병증, 미숙아망막병증, 코우츠병은 모두 정상적인 망막혈관 발생의 문제로 인해 생기는 질환들이고 이 문제는 NDP 유전자의 돌연변이와 관련이 있다는 공통점을 가진 질환군이라는 것이다. 추후 이러한 선천망막질환의 분자유전학적 연구들이 계속 진행되어 유전체 교정과 같은 치료가 실현되는데 중요한 단서를 제시해야 할 것이다.

Rat NDP kinase와 truncated NDP kinase (Nm23)/GST fusion protein의 효소 활성 및 생화학적 특성에 관관한 연구

장근혜 梨花女子大學校 大學院 1998 국내석사

Ethacrynic Acid Inhibits NDP and B7-H4 Expression Involved in Epithelial-Mesenchymal Transition of Lung Adenocarcinoma Cells

Yu, Lu 동국대학교 일반대학원 2023 국내박사

Chapter 1. Ethacrynic acid의 항암 역할 규명 연구. Ethacrynic acid (ECA)는 이뇨제이며 임상적으로 체액 과잉으로 인한 부종을 치료하는 데 사용된다. 그러나 ECA의 임상 적용은 낮은 생체이용률과 고용량 간 손상 및 청력 손실과 같은 부작용으로 인해 제한된다. 그럼에도 불구하고 ECA는 약물 재배치를 통해 항암제로 작용할 가능성이 있는 것으로 밝혀졌다. ECA는 다양한 메커니즘을 통해 증식, 세포사멸, 이동 및 침입, 혈관신생, 염증, 에너지 대사 및 증가된 성장 억제 인자와 같은 암 과정을 조절한다. 여기에서 우리는 항암제로 ECA를 연구할 수 있는 가능성에 대해 논의한다. Chapter 2. Ethacrynic acid은 NDP 유도한 WNT 신호의 하향 조절을 통해 폐암 세포의 상피-중간엽 전이(EMT)를 억제한다. 폐암은 암 환자의 주요 사망 원인 중 하나이다. 상피-중간엽 전이(EMT)는 폐암 진행에 중요한 역할을 한다. 따라서 폐암 치료를 위해서는 EMT를 억제하는 물질을 찾는 것이 중요한데, Ethacrynic acid (ECA)은 세포 이온의 흐름을 억제하고 항암 효과를 발휘하는 이뇨제이다. 그러나 폐암에서 ECA가 EMT과정에 미치는 영향은 아직 명확하지 않다. 이전의 연구에서, 페암 A549 세포주에서 SPC가 농도의존적으로 EMT과정, 그리고 이동 침윤 현상을 유도하는 것을 확인하였다. 이 현상에 NDP 유전자가 관여하고 있음을 밝혔다. 우리는 ECA가 H1299 폐암 세포주에서 sphingosylphosphorylcholine (SPC) 또는 TGF-β1 유도한 EMT를 억제하고, ECA가 SPC 유도한 Wnt 신호 전달 경로을 억제하는 것을 발견했다. 우리는 SPC/TGF-β1이 NDP [노리병 단백질; NDP]와 Wnt-2의 발현을 유도하고, ECA가 이들의 발현을 억제하는 것을 관찰했다. SPC 유도한 Wnt 활성화, EMT과정, 이동 및 침윤 현상은 NDP 과발현 (pNDP)에 의해 향상되는 것을 확인하였다. 따라서 NDP 발현은 폐암 예후에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 이를 통해, 우리의 결과는 ECA가 NDP 발현을 하향 조절하고 Wnt 활성화를 억제함으로써 폐암 세포에서 SPC 유도한 EMT과정를 억제한다는 것을 보여주었다. ECA는 폐암 치료를 위한 새로운 약물 후보가 될 수 있다. Chapter 3. Ethacrynic acid은 STAT3 경로를 억제함으로써 폐암 세포의 상피-간엽 전이에 관여하는 B7-H4 발현을 억제한다. 폐암은 발병률과 사망률이 높은 것이 특징이다. 암 사망의 90%는 전이에 의해 발생한다. 암세포에서 EMT 과정은 전이 과정의 전제 조건이다. Ethacrynic acid (ECA)은 폐암 세포에서 EMT 과정을 억제하는 루프(loop) 이뇨제이다. EMT는 종양 면역 미세 환경과 관련이 있다. 그러나 암종에서 면역 체크포인트 분자에 대한 ECA의 영향은 확인되지 않았다. 본 연구에서는 폐암세포에서 sphingosylphosphorylcholine(SPC)과 잘 알려진 EMT과정의 유도제인 TGF-β1이 B7-H4의 발현을 유도한다는 것을 밝혀내였다. 우리는 또한 SPC 유도한 EMT과정에서 B7-H4의 관여를 조사했다. B7-H4의 녹다운은 SPC 유도한 EMT과정, 이동 및 침윤 현상을 억제하는 것을 확인하였다. 반대로, B7-H4의 과발현은 폐암 세포의 EMT과정, 이동 및 침윤 현상를 강화시키는 것을 확인하였다. 그리고, ECA는 STAT3 활성화의 억제를 통해 SPC/TGF-β1 유도 B7-H4 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, ECA로 처리된 생쥐의 폐의 식민지화(colonization)를 억제하는 것을 확인하였다. ECA로 처리된 생쥐는 폐암 조직에서 CD4 양성 T세포도 증가시켰다. 이를 통해, 이러한 결과는 ECA가 STAT3 억제를 통해 B7-H4 발현을 억제하여 SPC/TGF-β1 유도한 EMT과정을 억제함을 시사한다. ECA는 B7-H4 양성 폐암환자에 대한 약물일 수 있다. Chapter 4. 결론. ECA는 다양한 암에 대한 항암 효과가 있다. 결론적으로, 우리의 연구 결과는 ECA가 STAT3 경로를 차단함으로써 B7-H4 발현을 억제하고, NDP 발현을 억제함으로써 WNT 신호 전달 경로의 활성화를 억제하여 EMT 과정과 폐암의 전이를 억제한다는 것을 의미한다. ECA는 폐암 환자들에게 암 치료제에 대한 비용 효율적인 새로운 치료법을 제공할 수 있다. Chapter 1. Role of Ethacrynic acid in cancers. Ethacrynic acid (ECA) is a diuretic that inhibits Na-K-2Cl cotransporter (NKCC2) present in the thick ascending loop of Henle and muculo dens, and is clinically used for the treatment of oedema caused by excessive body fluid. However, the clinical use of ECA is limited by its low bioavailability and side effects, such as liver damage and hearing loss at high doses. Despite this, ECA has been found to have potential as an anti-cancer agent through drug repositioning. ECA regulates hallmark cancer processes such as proliferation, apoptosis, migration and invasion, angiogenesis, inflammation, energy metabolism and increased growth inhibitory factors through various mechanisms. Here, I discuss the potential of ECA to be investigated as an anti-cancer drug. Chapter 2. Ethacrynic acid suppresses epithelial-mesenchymal transition of lung cancer cells via downregulating of NDP-induced Wnt signaling. Lung cancer is one of the key reasons for death in cancer patients. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) plays an important role in lung cancer progression. Therefore, find substances that inhibit EMT for lung cancer treatment is crucial. Ethacrynic acid (ECA) is a diuretic that inhibits cellular ion flux and exerts anticancer effects. However, the effects of ECA on EMT in lung cancer remain unclear. I found that ECA inhibited sphingosylphosphorylcholine (SPC) or TGF-β1-induced EMT in H1299 lung cancer cells, and ECA inhibited SPC-induced Wnt signaling. I observed that SPC/TGF-β1 induces the expression of NDP [Norrie disease protein; NDP] and Wnt-2, whereas ECA suppressed their expression. SPC-induced Wnt activation, EMT, migration, and invasion were enhanced by NDP overexpression (pRNA). Accordingly, NDP expression may influence lung cancer prognosis. My results revealed that ECA inhibited SPC-induced EMT in lung cancer cells by downregulating NDP expression and inhibiting Wnt activation. Therefore, ECA might be a new drug candidate for lung cancer treatment. Chapter 3. Ethacrynic acid suppresses B7-H4 expression involved in epithelial-mesenchymal transition of lung adenocarcinoma cells via inhibiting STAT3 pathway. Lung cancer is characterized by high incidence and mortality. 90% of cancer deaths are caused by metastases. The epithelial-mesenchymal transition (EMT) process in cancer cells is a prerequisite for the metastatic process. Ethacrynic acid (ECA) is a loop diuretic that inhibits the EMT process in lung cancer cells. EMT has been related to the tumor immunemicroenvironment. However, the effect of ECA on immune checkpoint molecules in the context of cancer has not been fully identified. In the present study, I found that sphingosylphosphorylcholine (SPC) and TGF-β1, a well-known EMT inducer, induced the expression of B7-H4 in lung cancer cells. I also investigated the involvement of B7-H4 in the SPC-induced EMT process. Knockdown of B7-H4 suppressed SPC-induced EMT, while B7-H4 overexpression enhanced EMT of lung cancer cells. ECA inhibited SPC/TGF-β1-induced B7-H4 expression via suppression of STAT3 activation. Moreover, ECA inhibits the colonization of mice lung by tail vein-injected LLC1 cells. ECA-treated mice increased the CD4-positive T cells in lung tumor tissues. These results suggested that ECA inhibits B7-H4 expression via STAT3 inhibition, leading to SPC/TGF-β1-induced EMT. Therefore, ECA might be an immune oncological drug for B7-H4-positive cancer, especially lung cancer. Chapter 4. Conclusion. ECA has anti-cancer effects on a variety of cancers. In conclusion, our findings imply that ECA suppresses B7-H4 expression by blocking the STAT3 pathway and suppresses the activation of the WNT signalling pathway by downregulating NDP expression, thereby inhibiting the EMT process and metastasis in lung cancer. ECA could provide lung cancer patients with cost-effective new therapy against cancer drugs.

Performance Improvement for Advanced Neighbor Discovery Process in Bluetooth Low Energy 5.0-enabled IoT Networks

산고양 아주대학교 2020 국내박사

The neighbor discovery process (NDP) plays a key role in BLE-enabled applications. However, when a massive number of BLE devices are involved in the NDP, signal collisions become severer, which degrade the NDP performance seriously. To solve the problem, BLE 5.0 specifies some extended features such as advanced NDP (ANDP). A-NDP uses more channels and add an auxiliary process to decrease the signal collision rate. The previous works on the performance models for the NDP have focused on the basic NDP (B-NDP). Though some works considered the performance evaluations on A-NDP, they have done on simulations or testbed-based experiments. Likewise, so far, the performance analysis for A-NDP has been insufficient, and the performance optimization scheme is necessary. Therefore, firstly, we propose an analytical model to evaluate A-NDP performances such as the signal collision probability, the discovery delay, the energy consumption and so on in this dissertation using Chinese Reminder theorem (CRT). With the proposed analysis model, the performances of A-NDP are analyzed from the viewpoint of various operational environments for BLE-enabled IoT services, and compared to those of B-NDP with extended features of Bluetooth 5.0. Besides, it showed that A-NDP is not always better than B-NDP, and we discuss the operational conditions where A-NDP or B-NDP operate effectively, respectively. The simulation results show that the performance of the A-NDP can be improved according the adjustment of BLE parameters. Secondly, based on the analytical model of A-NDP, we analyze the transmission rate of A-NDP, where the transmission rate is the successful transmission times per second, and propose an optimization model to maximize the transmission rate by adjusting BLE parameters. The simulation results show that the proposed optimization model achieves maximal transmission while maintains lower energy consumption. At last, we propose an improved A-NDP to overcome the shortage of A-NDP and further improve its performance. In the proposed scheme, we modify the auxiliary process and packet transmission mechanism of the A-NDP, and employs a new parameter, which is used to adjust the signal collision. According the adjustment of this parameter, the optimal performance of the proposed scheme can be achieved.

Establishment of cost-effective synthesis of bioactive glyco-epitopes by sugar nucleotide cycling and their anti-adhesive application

유수인 연세대학교 대학원 2012 국내박사

Various oligosaccharides including galactooligosaccharide have been well-known to promote the growth of Bifidobacteria in the large gut of humans due to its indigestibility in the digestive tract. Thus, the bioactive oligosaccharides would have a potential as a prebiotic substance for promoting gut health. Also, these oligosaccharides may directly inhibit infections by enteric pathogens due to their ability to act as structural mimics of the pathogen binding sites that coat the surface of gastrointestinal epithelial cells. The aim of the present study was to investigate that establishment of cost-effective synthesis of bioactive oligosaccharide by a sugar nucleotide cycling (SNC) with repetitive batch technique and their inhibition of adherence of pathogens and also an increase of the adherence of bifidobacteria to the intestinal epithelial cell surface. The trehalose synthase (TreT) from Pyrococcus horikoshii represented reversible catalysis in alternative synthesis of trehalose and nucleoside 5'-diphosphate-glucose (NDP-Glc), depending on the substrates involved. TreT from P. horikoshii had differential preferences on NDP-Glc as a donor for trehalose synthesis, in which guanosine 5'-diphosphate (GDP)-Glc was the most favored in terms of reaction specificity, kcat/Km. Uridine 5'-diphosphate (UDP)- and adenosine 5'-diphosphate (ADP)-Glcs were employed with less preferences. This enzyme reversely cleaved trehalose to transfer the glucosyl moiety to various NDPs, efficiently producing NDP-Glcs. Although ADP-Glc was the least favorable donor, the counterpart, ADP, was the most favorable acceptor for the reverse synthesis of NDP-Glc in kcat/Km. GDP and UDP were less preferred, compared to ADP. In a batch reaction of 12 h, the molar yield of NDP-Glc per NDP used was decreased approximately in the order of ADP-Glc > GDP-Glc > cytidine 5'-diphosphate (CDP)-Glc or UDPGlc. The overall productivity of the enzyme was largely improved in a gram scale for NDP-Glcs using repetitive batch reactions with enzyme recycling. Thus, it is suggested that TreT from P. horikoshii may be useful for the regeneration of NDP-Glc from NDP, especially for ADP-Glc from ADP, with trehalose as a glucose resource. Mutagenesis of the putative catalytic residues provide a molecular basis for understanding the synthetic mechanism of trehalose, or the nucleotide sugar in reverse reaction of the TreT, in extremophiles that may have important industrial implications. Next, Efficient production of bioactive oligosaccharide from inexpensive starting materials by a sugar nucleotide cycling (SNC) with a three-enzyme using trehalose synthase, UDP-glucose-4-epimerase (EC5.1.3.2), and α-1,3-galactosyltransferase (EC2.4.1.38) or α-1,4-galactosyltransferase and their recombinant E. coli whole cells has been established. We have the confirmed that the reuse of the three native enzymes with the repetitive batch technique increases enzyme productivity and decreases production cost. Two species of Bifidobacteria and three kinds of harmful bacteria have been tested in vitro and have been compared for the growth with the addition of commercial trehalose, galactooligosaccharide, lactose, lactulose, raffinose and the bioactive oligosaccharides. As expected, α-Gal epitope I (GalE I) and globotriose showed a positive promotion (0-10%) and α -Gal epitope II (GalE II) and α -Gal epitope III (GalE III) showed a positive promotion (0-20%) on the growth of B. bifidum and GalE II and GalE III showed a positive promotion (0-10%) and globotriose showed a positive promotion (0-20%) on the growth of B. longum as compared to that for the control and no growth-stimulating effect for the harmful bacteria used. Thus, bioactive oligosaccharides would have a potential as a prebiotic substance for promoting gut health. Also, these oligosaccharides may directly inhibit infections by enteric pathogens due to their ability to act as structural mimics of the pathogen binding sites that coat the surface of gastrointestinal epithelial cells. In this study, the ability of commercial prebiotics to inhibit attachment of microcolony-forming enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) was investigated. The adherence of EPEC strain EO127: K63(B8) on Caco-2 cell, in the presence of mannose, lactulose, lactose, globotriose, and α-Gal epitope series was determined by cultural enumeration and microscopy. α-Gal epitope series reduced the adherence of EPEC was from 64 to 76%. GalE III exhibited the greatest adherence inhibition Caco-2 cell. The adherence of bifidobacteria to Caco-2 cell was increased from 1.7 to 3 times. GalE III exhibited the greatest adherence Caco-2 cell. The above all result, α-Gal epitope series have more greater ability to reduce the number of bacteria and increase the number of bifidobacteria on Caco-2 cell than globotriose. To obtain a better understanding and confirm interaction between bacteria cell surfaces and α-Gal epitope series, the adsorption enthalpies of α-Gal epitope series with cell surfaces were assessed using isothemal titration calorimetry. The E.coli with GalE III adhered faster than the E.coli with globotriose. Thus, GalE III showed bifidogenicity as compared to trehalose and other typical sugars employed and α-Gal epitope series more greater ability to reduce the number of bacteria and increase the number of bifidobacteria per microcolony than globotriose. The present study suggested that α-Gal epitope series could be an effective and multifunctional sugar substitute for prebiotic efficacy in the food industry. Also, α-Gal epitope series may have anti-adhesive activity and directly inhibit the adherence of pathogens to the epithelial cell surface and also increase the adherence of bifidobacteria to the intestinal epithelial cell surface. Thus, this α-Gal epitope series can be used for promoting gut health.

Structural and functional studies of LRSAM1 E3 ubiquitin ligase in xenophagy

국용부 Graduate School, Korea University 2018 국내석사

Highly efficient tandem PHOLEDs with lithium-doped BPhen/NDP-9-doped TAPC as a charge generation layer

Park, Wonhyeok Sungkyunkwan University 2022 국내박사

The development of large-area organic light-emitting diode (OLED) displays requires highly efficient tandem device architecture and easily processable charge generation layer (CGL) with low voltage drop and high optical transparency. In this work, we investigated and applied doped organic n-CGL/p-CGL using thermal vacuum deposition in tandem OLED devices. A doping concentration of 1.0 wt.% for Li in 4,7-Diphenyl-1,10-phenanthroline (BPhen) was optimal for n-CGL with 8 wt.% for 2-(7-dicyanomethylene-1,3,4,5,6,8,9,10-octafluoro-7H-pyrene-2-ylidene)-malononitrile (NDP-9)-doped N,N-bis(4-methylphenyl)benzenamine (TAPC) as a p-CGL. Maximum luminous efficiencies of 42.5 and 63.4 cd/A and a current density for 4,000-cd/m2 target luminance values of 11.2 and 6.5 mA/cm2 were demonstrated for double-stack and triple-stack tandem blue phosphorescent OLED devices, respectively. Implementing these highly efficient tandem device structures will improve the overall lifetime by lowering the operating current density at the target luminance. 유기발광 다이오드(organic light-emitting diode)를 기반으로 한 대면적 디스플레이 개발을 위해서는 낮은 전압 강하(voltage drop) 특성과 높은 광학적 투명도(optical transparency)를 가진 전하 생성층(charge generation layer) 그리고 이러한 특성의 전하 생성층을 적용한 고효율 탠덤(tandem) 발광 소자의 구현이 필수적이다. 본 연구에서는 열 진공 증착(thermal vacuum deposition) 원리를 이용한 유기 박막 증착 공정을 통해 n-CGL/p-CGL 구조의 전하 생성층을 구현 및 최적화하고 그 특성을 평가했다. 청색 인광 유기발광 다이오드 단일 소자의 최대 효율은 22.5 cd/A를 나타냈고 4,000 cd/m2 목표 휘도에서의 전류 밀도는 28.5 mA/cm2를 나타냈다. 이중 스택(stack)과 삼중 스택의 청색 인광 유기발광 다이오드 소자들은 각각 42.5 cd/A 및 63.4 cd/A의 최대 효율을 나타냈으며, 이는 단일 소자 최대 효율 대비 약 1.9 배, 2.8 배 향상된 수치이다. 또한 전류 밀도는 11.2 mA/cm2 및 6.5 mA/cm2로 나타났다

인간 태반의 NDP kinase (Nm23)와 변이된 NDP kinase(Nm23-H2)의 기능 및 생화학적 성질에 관한 연구

송은주 이화여자대학교 대학원 1998 국내석사

Nucleoside diphosphate (NDP) kinase는 nucleoside-5'-triphosphate (NTP)의 말단 인산기를 nucleoside-5'-diphosphate (NDP)로 이동시켜 주는 효소로 아래와 같은 ping-pong mechanism을 통해 일어나며 반응 중간체로 phosphohistidine을 포함한다. N_(1)TP + E ↔ N_(1)DP + E-P N_(2)DP + E-P ↔ N_(2)TP + E NDP kinase의 주된 작용은 NTP를 공급해주어 생체 내에서 필요한 NTP pool의 유지로 생각하였으나 최근 들어 암전이 억제 유전자인 nm23 gene product와 동일하다는 것이 밝혀져 관심이 크게 증가되고 있다. Human NDP kinase는 17 kDa의 polypeptide chain A, B로 이루어져 있으며 각각 nm23-H1, nm23-H2 gene product와 동일하다. Nm23-H1은 암전이 억제 인자로 작용하며 Nm23-H2는 c-myc protooncogene의 nuclease-sensitive element에 결합하여 transcription을 활성화시키는 단백질인 PuF와 동일하다는 것이 밝혀졌다. NDP kinase는 이러한 작용 이외에도 cell proliferation과 differentiation을 조절하며 G-protein과 연관되어 signal transduction에도 관여하는 것으로 알려져 있으나 정확한 기능과 기전에 대해서는 자세히 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 ATP-agarose affinity column chromatography를 사용하여 인간 태반의 cytosol에서 native form의 NDP kinase를 정제하였고 다른 native form인 인간 적혈구에서 정제한 NDP kinase와 association 되어있는 형태, size, 효소의 안정성 등 생화학적 특성을 비교하였다. 또한, 인간 태반을 cytosol, membrane, nucleus로 분획하여 각각의 분획에 존재하는 NDP kinase의 생화학적 특성에 대해 알아보았다. NDP kinase와 다른 단백질들의 관계를 살펴보기 위하여 cytosol, membrane nucleus 분획이 NDP kinase의 효소 활성과 자가 인산화에 미치는 영향을 살펴보았는데 membrane 분획에 의해서 NDP kinase의 자가 인산화가 5배 이상 증가하여 ion-exchange chromatography를 통하여 그 요소를 분리하기 위하여 노력하였다. 인간 태반의 NDP kinase에 관한 연구 이외에도 NDP kinase가 DNA에 결합할 때 중요하게 작용하는 부분을 알기 위해 3 종류의 Nm23-H2 mutant protein인 R34G, N69H, K135L을 만들어 효소의 기본적인 성질을 확인하였고 electrophoretic mobility shift assay (EMSA)를 통해 c-myc promoter에 결합하는 정도를 비교 분석하였다. 연구 결과에 따르면 같은 인간에 존재하는 NDP kinase라도 Nm23-H1과 Nm23-H2의 association 형태와 효소의 안정성 등의 성질이 다름을 알 수 있었고 cytosol, membrane, nucleus의 각 분획에 모두 NDP kinase가 존재하며 특히 membrane 중에는 NDP kinase의 자가 인산화를 증가시키는 요소가 존재함을 확인할 수 있었다. 또한 Nm23-H2 mutant protein을 이용해 DNA binding에 있어서 C-terminal이 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다. NDP kinase의 다양한 기능과 구조, 다른 단백질들과의 연관성 등에 대해서 더 많은 연구가 이루어져야 될 것이다. Nucleoside diphosphate (NDP) kinase catalyzes the transfer of the terminal phosphate group of the nucleoside triphosphate (NTP) to the corresponding NDP and has ping-pong mechanism and involves a phosphohistidine as an intermediate of the enzyme. N_(1)TP + E ↔ N_(1)DP + E-P N_(2)DP + E-P ↔ N_(2)TP + E The primary role of NDP kinase in the cell was considered as the maintenance of a pool of nucleoside triphosphate required for the biosynthesis. Recently, the interest of NDP kinase was increased due to their identification as the product of nm23, a putative metastasis suppressor gene. Human NDP kinase is composed of two subunits of 17 kDa polypeptide chain A, B, which are the products of nm23-H1 and nm23-H2. Nm23-H1 acts as a suppressor of metastasis. Nm23-H2 is shown to be identical to PuF, a protein that binds the nuclease-sensitive element on the promoter of c-myc protooncogene and activates the transcription of c-myc in vitro. Also, NDP kinase was suggested having roles in cell proliferation, differentiation and signal transduction associated with G-protein. However, the mechanism in multifunctions of NDP kinase was not illustrated. In this study, at first, we purified native NDP kinase from human placenta using ATP-agarose affinity column chromatography and compared with human erythrocyte NDP kinase on the biological characteristics, for example, the native conformation, molecular weight and stability. Secondly, cytosol, membrane and nucleus from placenta were fractionated. And we investigated the biochemical characteristics of NDP kinase in cytosol, membrane and nucleus. To find out the relationship between NDP kinase and other proteins in cellular fraction, autophosphorylation and enzyme activity of NDP kinase were measured in cellular fractions. Autophosphorylation of NDP kinase was increased more than 5 times by membrane fraction. We tried to isolate autophosphorylation-activating factors of NDP kinase in membrane fraction. Membrane fraction were fractionated by ion-exchange chromatography and about 60 kDa of protein was purified. Beyond human placenta NDP kinase, for identifying the residues responsible to DNA binding properties of Nm23-H2, Nm23-H2 mutant proteins, R34G, N69H and K135L were purified and examined their enzymatic characteristics. The DNA binding properties of Nm23-H2 mutant proteins were investigated with electrophoretic mobility shift assay (EMSA) using c-myc promoter. In conclusion, native conformation, stabilities on placenta NDP kinase and erythrocyte NDP kinase were different though they are in the same species. NDP kinase is distributed in the cytosol, membrane and nucleus. NDP kinase-associated autophosphorylation activating factor exists in membrane. And C-terminal of NDP kinase is important in DNA binding.

인간 NDP kinase (NM23)의 효소 활성 및 기능에 관한 연구

김선영 梨花女子大學校 大學院 1996 국내석사

세포밖 NDP kinase (Nm23)와 sentrin의 생화학적 성질 및 기능에 관한 연구

오현정 이화여자대학교 2000 국내석사

Nucleoside diphosphate (NDP) kinase는 nucleoside-5' -triphosphate (NTP)의 말단 인산기를 nucleoside-5' -diphosphate (NDP)로 이동시켜 주는 효소로 세포내에서 중요한 역할은 NTP를 공급해 주어 생체내에서 필요한 NTP pool을 유지시키는 것으로 생각되어져 왔다. 그러나 최근들어 NDP kinase가 nm23의 gene product인 Nm23과 동일하다는 것이 밝혀짐에 따라 관심이 크게 증가되고 있고 또한 cell proliferation, differentiation, development, metastasis, apoptosis 등의 다양한 생체기능이 있는 것으로 알려지고 있다. Human N에 kinase는 NDPK-A (Nm23-H1)와 NDPK-B (Nm23-H2)로 구성되어 있음이 밝혀졌는데, NDPK-A (Nm23-H1)는 암전이 억제 인자로 작용하고 NDPK-B (Nm23-H2)는 c-myc oncogene promoter에 nuclease-sensitive element에 결합하여 transcription을 활성화시키는 PuF와 동일하다는 것이 확인되었고, 최근에는 새로운 NDPK gene인 DR-nm23, nm23-H4, nm23-H5, nm23-H6등이 더 발견되어졌다. NDPK (Nm23)는 세포내 cytosol과 핵에 분포하는 것으로 알려져 있는데, 세포밖에서 mouse myeloid leukemia M1 세포의 분화 억제 인자로 작용함이 밝혀지면서 세포밖의 분포가 제기되어졌고, 세포밖으로 분비되어진 NDPK(Nm23)이 세포밖에서 구체적으로 어떤 작용을 하는지에 대해서는 아직 밝혀져 있지 않다. 본 실험에서는 크게 두가지 부분에서 Nm23에 대한 연구를 실시하였다. 첫째, 세포내에서 serum starvation, heat shock등과 같은 stress에 대한 Nm23의 영향을 알아보기 위하여 Nm23이 과발현된 유방암 세포 P57을 control인 K10과 비교하여 실험하였다. K10과 P57에 heat shock을 가한 후에 회복시키면서 각 시점에서의 단백질 합성 양상의 변화와 SAPK/JNK의 활성화에 대한 영향을 알아보았고, 또한 성장인자의 공급을 차단시킨 serum starvation 상태에서 K10, P57 세포내 단백질 합성 pattern의 변화를 2D SDS-PAGE로 비교하여 변화된 단백질들을 MALDI-TOF-MS를 이용하여 확인하였다. 둘째, serum starvation과 같은 stress에 의해 Nm23 단백질이 hsp70과 함께 세포밖에 존재함을 확인하였으며 이렇게 세포밖으로 분비되어져 나온 Nm23을 순수 분리 정제하여 세포내에 존재하는 Nm23 단백질과 구조 및 효소 활성 등의 생화학적 성질에서 어떤 차이점을 가지는지 비교하여 관찰하였고, 세포밖에 존재하는 Nm23 단백질이 세포의 성장과 motility에 미치는 영향 등을 관찰하여 세포밖에서는 Nm23 단백질이 가지는 기능을 규명하고자 하였다. Yeast two-hybrid상에서 Nm23과 결합하는 단백질로 알려진 sentrin은 101개 amino acid를 지닌 ubiquitin-like protein으로서, Fas/APO-1과 tumor necrosis factor receptor 1의 death domain과 작용하여 anti-Fas/APO-1 혹은 TNF가 야기하는 세포의 죽음으로부터 세포를 보호하는 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. Setrin은 ubiquitin과 18% 동일하고 48% 유사한 ubiquitin domain (residues 22-97)을 지니고 있어서 ubiquitination pathway와 유사한 방법으로 target protein에 conjugation하는 것으로 알려져 있는데 이 때 E1, E2, E3로 구성된 복합적인 효소 반응을 필요로 하고 그 중에서 특히 E2 enzyme인 Ubc9이 sentrinization pathway에서 중요한 conjugating enzyme으로 작용하고 있음이 밝혀졌다. Sentrin에 의해 modification되는 주요한 target substrate로 현재까지 밝혀진 것은 RanGAP1, IκBα, PML 등이 있는데, 더 많은 target molecule들을 밝혀내는데 관심이 집중되어지고 있다. 본 실험에서는, recombinant 단백질인 sentrin을 발현시켜 분리 정제한 후 sentrin polyclonal antibody를 제작하여 다양한 조직과 세포내에서 단백질 수준에서 sentrin의 발현과 분포 정도를 알아보았다. 또한, 본 실험실에서 확보하고 있는 인간 태반의 cytosol, membrane, nucleus 분획내에 존재하는 여러 요소들이 sentrin에 어떤 변화를 주는지 관찰하고 이에 대한 nm23 단백질의 영향을 알아보고자 하였다. 세포내에서 sentrin이 다른 target 단백질들에 conjugation하는데 중요한 E2 conjugating enzyme인 ubc9을 recombinant 단백질로 분리 정제하여 in vitro 상에서 sentrin과 ubc9의 interaction을 알아보고 wild-type cell lysate에 존재하는 다양한 다른 단백질들을 sentrinizaion시킬 때 ubc9의 직접적인 연관성을 살펴보고 이 때 nm23 단백질이 어떠한 영향을 미치는지 밝혀내고자 하였다. 앞으로는 sentrin과 ubc9의 transfection assay를 통하여 in vivo 상에서 ubc9에 의해 sentrinization되는 target 단백질들을 찾아내고 이러한 target 단백질의 성질과 기능에 sentrin이 어떠한 역할을 하는지에 대한 연구가 계속 진행될 예정이다. Nucleoside diphosphate (NDP) kinase catalyzes the transfer of the terminal phosphate group of the nucleoside triphosphate (NTP) to the corresponding N에 and the primary role of N에 kinase in the cell was considered as the maintenance of a pool of nucleoside triphosphate required for the biosynthesis. Recently, the interest of N에 kinase was increased due to their identification as the product of nm23, a putative metastasis suppressor gene. Also, protein Nm23 has been recognized to have a multifunctional roles in cell proliferation, differentiation, development, metastasis and apoptosis etc. In humans, two NDPKs have been identified as NDPK-A (Nm23-H1) and NDPK-B (Nm23-H2). NDPK-A acts as a suppressor of the metastasis of come tumor types and NDPK-B was shown to be identical to PuF, a protein that binds to a nuclease-sensitive element in the promoter of c-myc oncogene and activates the transcription of the c-myc oncogene. In vitro, Human NDPK was also identified as a differentiation inhibitory factor of myeloid leukemia M1 cells. Very recently, new NDPK genes, DR-Nm23, nm23-H4, nm23-H5 and nm23-H6 have been identified. In this study, at first, control K10 and nm23-transfected cell line P57 were examined to investigate the effect of Nm23 for the stress such as serum starvation and heat shock. In K10 and P57 cells, immediate inhibition and recovery after a few hours of protein synthesis were shown by heat shock and SAPK/JNK activation was measured. Also, during serum starvation, the change of cellular protein synthesis patterns of K10, P57 were compared using 2D SDS-PAGE and the alteration of protein expression was identified by applying MALDI-TOF-MS. Secondly, extracellular Nm 23 and hsp70 were secreted by serum starvation and extracellular Nm23 purified from P57 conditioned media were characterized in terms of enzymatic activity and structural properties as compared with other various cytosolic Nm23. The biological function of extracellular Nm23 in cell proliferation, cell motility was investigated and further studies are performing to characterize physiological roles of extracellular Nm23. Sentrin, a protein binding to Nm23 in a yeast two-hybrid screen is a 101-amino acid ubiquitin-like protein that protects cells against both anti-Fas and tumor necrosis factor induced cell death. Sentrin contains an ubiquitin domain (residues 22-97) that is 18% identical and 48% similar to ubiquitin. Sentrin can be conjugated to other proteins in a manner analogous to protein ubiquitination. Ubc9 appears to be a key conjugating enzyme for the sentrinization pathway. Recent data on the modification of proteins by sentrin focuses on three major substrates, RanGAP1, PML, IκBα and other protein substrates for sentrin modifications are investigated. In this study, recombinant sentrin was overexpressed and purified. We produced sentrin polyclonal antibody and determine the distribution of sentrin in various tissues and the subcellualr localization in whole cell, membrance, nucleus fraction. Also, modificaion of sentrin in placenta cytosol, membrance, nucleus fractionand nm23-H1,-H2 effects were monitored. We purified recombinant Ubc9 a key conjugating enzyme for the sentrinization pathway. In vitro, we study the interaction between sentrin and ubc9, the direct requirement for ubc9 in sentrinization to other proteins in wild-type cell lysate and the effects of nm23. Next, we will have transfection assay with sentrin or ubc9 and investigate target proteins to be sentrinized, the modification function of target protein by sentrin.