Understanding meta-epigenomics and environmental microbiome through genome-resolved metagenomics

성훈제 중앙대학교 대학원 2022 국내박사

The importance of environmental microbiomes is well-recognized today; however, the genomes of numerous microorganisms remain unknown. Advances in DNA-sequencing and data-processing technologies have greatly improved microbiome research and enabled elucidation of the genomes of numerous microorganisms through culture-independent molecular approaches. Genomic reconstruction of environmental microbes through shotgun metagenomics has provided key insights into many aspects of microbial ecology and expanded the microbial phylogenetic tree. Moreover, genome-resolved metagenomics has allowed us to functionally characterize microbial communities and phylogenetically classify them at the species and strain levels. However, recovering a complete genome from metagenomics is still challenging, and wrongly binned MAGs (metagenome-assembled genomes) are occasionally inadvertently constructed from contigs of multiple species, leading to severe scientific misinterpretation. In this thesis, I attempted to reduce the contamination of MAGs via an iterative clustering method named Additional Clustering Refiner (ACR). DNA methylation in prokaryotes is involved in defense against phages and modulates other cellular processes, such as cell cycle regulation. To date, studies on prokaryotic methylation systems have mostly been centered on culturable microorganisms, resulting in a lack of understanding of DNA–methylation systems from the perspective of microbial ecology. Direct quantitation of the DNA methylation in environmental microorganisms has been limited due to the lack of genome references. Nevertheless, improvements in genome recovery from metagenomic data have enabled direct assessment of the distribution patterns of several microbial epigenetic marks in the ocean microbiome across all domains of life. Furthermore, the genome-wide epigenetic analysis of Pelagibacter has suggested that GANTC, a DNA methyltransferase target motif, is related to the cell cycle and is affected by environmental conditions. In addition, I found that the epigenetic state of Pelagibacter in a nutrient deficient ocean environment is different from that in laboratory conditions. These results indicate that the epigenetic status of an organism in the natural environment can be inferred from genome-wide DNA–methylation analysis, and in the near future, meta-epigenomics may be applied as a new method of interpreting a microbiome. Antibiotics that are overused in aquaculture can cause the spread of antibiotic resistance among pathogenic bacteria and ultimately pose a severe threat to human health. However, determining the hosts of antibiotic-resistance genes (ARGs) is challenging, and thus environmental ARG progression cannot be easily characterized. I could overcome these difficulties by characterizing resistome distributions through genome-resolved metagenomics, whereby I could investigate the environmental risk factors in shrimp farming. I found that resistome diversity is higher in shrimp farms than in coastal waters, and the resistome composition in a farm depended on the farming stage. In particular, the tetracycline-resistance gene was mainly detected at the early post-larval stage regardless of the individual farm. The metagenome-assembled genomes of Vibrio spp. were dominant at this stage and harbored tet34, which is known to confer resistance to oxytetracycline. These observations imply that specific pathogens and resistance genes become abundant due to the influence of the chemical products (antibiotics, fungicides, and feed additives) used in the farms during the larval stage of the shrimp. These anthropogenic effects lead to gene transfer of resistance genes and emergence of opportunistic pathogens, which pose risks to public health and aquatic organisms. Thus, chemical products should be prudently used in aquatic farms, which should be frequently screened for the emergence of opportunistic pathogens, and strategies for the management of any such pathogen should be developed. Improving the genomic context of unknown environmental microbial species has helped expand our knowledge of the limited traditional culture-based microbial ecology. Through this, the work presented in this thesis has been successfully applied to study the unidentified microbial DNA methylation systems and the ARG–Host relationship, which have yet to be studied from a genomic perspective. Continued advances in DNA sequencing will help in directly obtaining more complete genomes in the near future, which is expected to broaden the scope of untried studies in terms of microbial ecology. 환경 마이크로바이옴의 중요성은 잘 알려져 있지만 수많은 미생물의 유전체는 아직 알려지지 않고 있다. DNA 시퀀싱 및 데이터 처리 기술의 발전은 미생물 군집 연구를 크게 향상시켰고 미생물의 배양 없이 수많은 미생물의 유전체를 해석할 수 있게 되었다. 샷건 메타지노믹스를 통한 환경 미생물 유전체의 재구성은 미생물 생태학의 여러 측면에 대한 핵심 통찰력을 제공하며 알려지지 않았던 미생물 계통수를 확장해오고 있다. 이는 유전체 해석 메타지노믹스라고 부르며 미생물 군집을 기능적으로 특성화하고 종 및 균주 수준에서 계통 발생학적으로 정확히 분류할 수 있게 도와준다. 하지만 메타지노믹스에서 완전한 미생물 유전체를 복구하는 것은 여전히 어려운 일이며 잘못 비닝 된 메타지놈–조립 유전체들은 때때로 여러 종의 유전체 서열들로 구성되어 연구자들에게 잘못된 해석을 주기도 한다. 본 논문에서는 ACR (Additional Clustering Refiner)이라는 반복적 클러스터링 방법을 통해 이러한 문제를 해결하려 한다. 원핵생물에서의 DNA 메틸화는 주로 외부 바이러스의 침입을 방어하기 위한 기전으로 알려져 있으며 세포주기 및 전사체 조절과 같은 다양한 세포 활동에도 영향을 준다. 지금까지 원핵생물의 DNA 메틸화에 관한 연구는 배양이 가능한 개체에서만 연구가 되어왔으며 이는 미생물 생태 관점에서 원핵생물 DNA 메틸화의 이해를 돕기에는 부족하였다. 또한 실제 환경에서 미생물의 DNA 메틸화를 직접 측정하기에는 레퍼런스로 이용될 수 있는 미생물 유전체의 결핍으로 인한 제한이 있었다. 따라서 본 연구에서는 생명의 3역 분류체계에 속한 다양한 해양 미생물의 유전체를 조립하였으며 이들의 후성유전학적 표시 패턴의 분포를 환경시료를 통해 직접 확인할 수 있었다. 실제 환경에서 전유전체 DNA 메틸화는 미생물 개체의 후성유전체학 상태를 나타내며 Pelagibacter의 전유전체 DNA 메틸화 분석을 통해 GANTC 모티프가 Pelagibacter의 세포주기와 연관이 있으며 환경의 상태에 따라 달라질 수 있음을 밝혀 내었다. 더욱이 영양 결핍 상태인 실제 해양 환경에서의 Pelagibacter의 후성 유전 상태가 영양이 풍부한 배양 상태의 후성 유전 상태와 다름을 발견하였다. 본 연구는 처음으로 비배양법을 통한 후성유전체분석을 시도하였으며 이를 바탕으로 메타 후성유전학적 접근이 마이크로바이옴을 해석하는 새로운 시각으로 적용될 수 있음을 기대한다. 양식업에서 대량으로 사용되는 항생제는 병원성 세균 간 항생제 내성의 전파를 일으킬 수 있으며 결국 인류 보건을 위협하는 요인으로 여겨진다. 그러나 비배양법으로 항생제 내성 유전자의 균주를 찾기에는 어려움이 있기에 환경에서 항생제 내성 유전자의 전파를 모니터링하기에 제한적인 부분으로 작용한다. 메타지놈–조립 유전체를 통한 내성체 (resistome)의 분포를 확인하는 것은 이러한 점을 해결하며 본 연구의 새우 양식 환경에서 환경 위험 요소를 파악하는데 큰 도움을 주었다. 새우 양식 환경의 내성체의 다양성은 인근 해역보다 높았으며 양식 단계에 따라 내성체의 분포가 달랐다. 특히 양식장 지역에 상관없이 테트라사이클린 내성 유전자가 새우 유생 단계일 때 주로 발견되었다. 또한 이 시점의 양식장 샘플에서 Vibrio spp.가 우점 하였으며 이들 Vibrio 메타지놈–조립 유전체 에서는 옥시테트라사이클린에 내성을 보이는 tet34 유전자가 내포됨을 확인하였다. 이 결과로 새우 양식에서 가장 중요한 단계인 유생 단계에서 새우 유병률을 줄이기 위해 사용되는 각종 화학물질 (항생제, 항진균제 및 사료첨가물)의 영향이 특정 병원균 및 내성 유전자의 우점을 이끌었다고 추론된다. 이로써 인간활동에 따른 영향이 내성 유전자 및 기회성 병원균의 전파를 일으킬 수 있으며 인류 보건 및 해양 생물의 잠재적인 위험 요인이 될 수 있기에 주의를 요한다. 환경 시료로부터 직접 미생물 종의 유전체를 재구성하는 것은 전통적인 배양법 기반의 미생물 생태학에 대한 제한된 지식을 확장하는 데 도움이 되었다. 이를 통해 본 논문에서 제시한 연구는 아직까지 유전체적 관점에서 연구되지 않은 미확인 미생물 DNA 메틸화 시스템과 내성체–숙주 관계 연구에 성공적으로 적용되었다. DNA 시퀀서의 지속적인 발전은 가까운 장래에 보다 완전한 미생물 유전체를 직접 얻는 데 도움이 될 것이며, 본 연구논문과 같이 미생물 생태학 측면에서 시도되지 않았던 연구의 범위를 넓힐 수 있을 것으로 예상한다.

Development of method for improving accuracy of metagenomic pathogen identification using multiple databases

양지훈 Graduate School, Yonsei University 2020 국내박사

환경 내 존재하는 병원성 미생물의 검출은 미생물 위험 평가에서 매우 중요한 단계 중 하나이다. 그러나 병원성 미생물을 확인하기 위하여 현재 사용되고 있는 방법은 미생물 다양성이 높은 환경 미생물 군집 내 병원성 미생물을 확인하고 병원성 미생물과 공생 미생물을 구별하는 능력에 한계를 가지고 있다. 이 연구에서는 현재 사용되고 있는 방법론의 한계를 극복하기 위하여 다양한 병원성 미생물 데이터베이스의 검출 결과를 조합하여 활용하는 개선된 메타게놈 기반 병원성 미생물 검출 방법이 제안되었다. 다수의 데이터베이스의 검출 결과에 대한 포괄적인 접근을 통해 잠재적 병원성 미생물을 확인하였고, 하나의 염기서열을 병원성 미생물로 진단하는데 사용된 데이터베이스 수에 따라 8개의 각기 다른 그룹으로 분류되었다. 메타게놈 내 병원성 미생물의 상대 빈도와 앞서 분류한 각 그룹의 분포 간의 상관 관계를 기반으로 메타게놈 기반 병원성 미생물 식별 지수(MPII)를 계산하는 방정식이 제안되었다. 포함된 병원성 미생물의 종류와 상대 빈도를 알고 있는 555개의 인공 메타게놈을 사용하여 제안 된 방법과 기존 방법의 병원성 미생물 식별 정확도를 비교하였으며, 다중선형회귀 모델을 사용하여 MPII 계산 방정식을 도출하였다. 가상의 메타게놈으로부터 도출한 관계식의 실제 환경 메타게놈으로의 적용 가능성을 평가하기 위하여 70개의 실제 환경 메타게놈과 생물학적 정화 공법에 활용되는 12개의 미생물 제재의 MPII 분석이 수행되었다. 다양한 병원성 미생물 데이터베이스로부터 얻은 병원성 미생물 검출 결과를 조합함으로써 병원성 미생물의 검출 정확도가 개선되는 것이 확인되었다. 제안된 접근법을 실제 환경 메타게놈에 적용한 결과, 활성 슬러지 메타게놈의 MPII가 다른 환경과 비교하여 높게 나타났으며, 각기 다른 환경으로부터 유래된 메타게놈의 MPII가 통계적으로 구별됨을 확인하였다(p<0.05). 미생물 제재 메타게놈의 MPII 분석 결과, 분해 대상 물질에 따라 통계적으로 구분되는 값을 가진다는 것을 확인하였으며, 미생물 제재를 획득하기 위하여 수행되는 선택배양이 MPII의 증가에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 본 연구에서 제안한 방법론이 보다 정확한 메타게놈 내 병원성 미생물 식별을 가능하게 한다는 것을 의미한다. The identification of pathogens in the environment is critical for microbial risk assessment. However, conventional and current methods for pathogen identification have limited ability to identify pathogens from highly diverse environmental bacterial communities and differentiate between pathogens and commensal bacteria. In this study, an improved metagenomic pathogen identification approach was suggested using a combination of pathogen identification results of multiple pathogen-associated databases to resolve the limitations of current methodologies. By a comprehensive approach to the pathogen identification results of multiple databases, potential bacterial pathogens were identified from metagenomes, and the identification results were classified into eight groups according to the number of databases for identifying single raw metagenomic sequences. Based on the correlation between the abundance of pathogen and distribution of each group in the metagenome, an equation for calculating the metagenomic pathogen identification index (MPII) was proposed. The 555 artificial metagenomes were used to compare the identification accuracy of the suggested method and derive an MPII calculation equation. The application of the equation to actual environmental metagenomes was conducted using 70 actual environmental metagenomes and 12 metagenomes of microbial consortia for bioremediation. It was found that the pathogen identification accuracy was improved by using a combination of pathogen identification results obtained from multiple pathogen-associated databases. When the suggested approach was applied to actual environmental metagenomes, the activated sludge metagenomes showed higher MPIIs than other environments, and MPIIs could distinguishable among different environments (p<0.05). From the MPII calculation results using microbial consortia metagenomes, MPIIs represented statistically different according to the target contaminants, and it was found that selective cultivation affected to increase of MPII. These results indicated that the suggested methodology allows for more accurate pathogen identification with metagenomes.

메타지노믹스 분석을 통한 정상인과 치주질환자 간 구강내 미생물 비교

김연태 원광대학교 일반대학원 2021 국내박사

Purpose: 본 연구의 목적은 메타지노믹스 분석을 통하여 정상인과 치주질환 이환군에 대한 구강 내 타액, 치은연상 치태 그리고 치은연하 치태로부터 미생물 유전체를 추출하고, 각 군별 샘플 내 존재하는 미생물 군집을 비교 분석함으로써 치은연하 치태와 비교하여 타액과 치은연상 치태의 미생물 군집 차이를 알아보는 것이다. Materials and methods: 총 20명(정상군 10명, 치주질환 이환군 10명)이 연구에 참여하였다. 정상군과 치주질환 이환군 모두에서 타액, 치은연상 치태 샘플을 채취하였으며, 추가로 치주질환 이환군에서는 가장 깊은 깊이를 보이는 치주낭에서 치은연하 치태 샘플을 채취하였다. 각 샘플에서 DNA 추출 후, 16S rRNA 유전자 상의 V3-V4 초가변영역을 대상으로 polymerase chain reaction(PCR) 증폭 및 정제하고 차세대 염기서열 분석장비를 이용해 메타지놈 시퀀싱 및 생물정보학적 분석이 수행되었다. Results: 구강내 미생물의 알파 다양성 비교에서 정상과 치주질환 이환군을 비교하였을 때, 치은연상 치태 샘플과 타액 샘플 모두 풍요도(richness)와 균등도(evenness)에서 유의한 차이를 보이지 않았으나 상대적으로 타액 샘플에서 차이가 나는 경향을 보였다. 채취 위치에 따른 분석에서는 치은연상 치태 샘플에 비해 타액 샘플에서 유의하게 높은 값을 보였다. 베타 다양성 분석에서는 치은연하 샘플이 치주질환 이환군의 클러스터링 양상과 유사함을 보였다. 상대적 미생물 풍부도 분석(bacterial relative abundance analysis)에서 치주질환 이환군에 비해 정상군이 상대적으로 떨어지는 경향성을 보였으며, 특정 병원성 균주(Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Prevotella intermedia)에 대해 치은연상 치태 샘플은 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않는 반면, 타액 샘플에서는 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다. 또한 타액 샘플은 치은연하 치태 샘플과 유사한 분석 양상을 보였다. Conclusion: 본 연구의 한계 내에서 치주질환 이환군은 정상군에 비해 높은 알파 다양성 추정치를 보였고, 베타 다양성 분석에서는 치은연하 샘플이 치주질환 이환군의 클러스터링 추정 양상과 유사함을 보였다. 또한 상대적 미생물 풍부도 분석에서 샘플 채취 위치에 따른 문(phylum) 수준 및 특정 병원성 균주의 변화 양상을 비교하였을 때, 치은연상 치태 샘플에 비해 타액 샘플이 치은연하 샘플과 유사한 양상을 보였다. Purpose: The purpose of this study is to compare and analyze microbial communities through the metagenomic analysis via microbial genome extraction from the saliva, supra-gingival plaque, and sub-gingival plaque of both healthy and periodontal disease group. Materials and methods: A total of 20 subjects (healthy subjects: 10 and periodontitis subjects: 10) were recruited. In both healthy and periodontitis groups, samples of saliva and supra-gingival plaque were collected, and in the group with periodontal disease. Additionally, in the periodontitis group, subgingival plaque samples were collected from the deepest periodontal pocket. After DNA extraction from each sample, polymerase chain reaction (PCR) amplification was performed on the V3-V4 hypervariable region on the 16S rRNA gene, followed by metagenome sequencing and bioinformatics analysis. Results: When comparing the group with healthy group and periodontal disease group of the alpha-diversity, saliva samples demonstrated comparably larger difference of bacterial diversity than supra-gingival plaque samples, even though both supra-gingival plaque and saliva samples did not show significant differences in richness and evenness of bacterial communities. According to sampling sites, we observed a significantly higher value in saliva sample than in supra-gingival plaque sample. In our beta-diversity analysis, subgingival plaque sample exhibited clustering pattern that is similar to that of periodontitis group. Bacterial richness analysis in species level indicated relatively lower richness of bacteria in healthy group than in periodontitis group. Especially, for specific pathogenic species (Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Prevotella intermedia), statistically significant difference in bacterial richness was observed in saliva samples, whereas supra-gingival calculus samples yielded no meaningful difference. Moreover, saliva exhibited similar relativistic richness of bacterial communities as that of subgingival calculus samples. Conclusion: Within the limitation of this research, periodontitis group demonstrated increased richness and diversity of bacterial communities compared to healthy group. Comparison of variation of Phylum level species and specific pathogenic bacterial specie showed that saliva samples better represent tendency observed in sub-gingival plaque samples than supra-gingival plaque samples.

Integrative analysis of prokaryotic DNA methylation associated with adaptive antibiotic resistance in the gut microbiome

오한나 중앙대학교 대학원 2023 국내박사

Recent overuse and misuse have contributed to the spread of antibiotic resistance among pathogenic bacteria bringing with it an ever-escalating threat to human health. When bacteria are subjected to increasingly subinhibitory concentrations of an antibiotic, they develop adaptive resistance to that antibiotic. The resistance which develops when bacteria grow in the presence of nonlethal concentrations of antibiotics could be the consequence of changes in the epigenetic landscape of the bacterial genome. DNA methylation in prokaryotes is involved in the defense system against phages while also regulating other cellular processes, such as gene expression. Changes in DNA methylation profiles regulate phase variation in bacteria and lead to the regulation of the expression of antibiotic resistance genes or other genes within their genome. Due to technological limitations, research into prokaryotic DNA methylation has focused on culturable microorganisms. As a result, the methylation systems of many unculturable microorganisms in the environment cannot be easily understood making it difficult to characterize the genome-level methylation patterns of bacteria. Genomic reconstruction of the microbiome in the environment by means of shotgun metagenomics, including short- and long-read sequencers, has facilitated genome-wide functional profiling and provided key information based on the microbial phylogenetic tree. For integrative analysis based on multi-omics approaches, amplicon sequencing, random shotgun metagenomics, meta-transcriptomics, and meta-epigenomics were employed in order to better understand how the rat gut microbiome responds to antibiotic stress and how DNA methylation is associated with the development of adaptive antibiotic resistance. First, amplicon sequencing revealed the dysbiosis in the gut microbes of rats which had been exposed to clindamycin targeting 23S rRNA in the 50S subunit of the ribosome. Over the course of three replicated experiments, it was observed that clindamycin induced decreased clindamycin-sensitive gut microbes, decreased microbial diversity, and disrupted microbial interaction, resulted in the less weight of rats. Next, rats were grouped into 5 groups, namely base, control, clindamycin, amoxicillin, and ciprofloxacin. This permitted identification, using metagenomics and meta-transcriptomics, of distinct changes in the rat gut microbiome under different antibiotics, which inhibit bacterial growth by different mechanisms. Both metagenome and meta-transcriptome showed that ciprofloxacin did not produce significant changes in microbial diversity or microbial community, as compared to the base and the control. Both amoxicillin and clindamycin were characterized by decreases in the relative abundances of Firmicutes, increases in Proteobacteria, and decreased gut microbial diversity. Similarly, clindamycin increased the population of E. coli and Proteobacteria bacterium CAG-139 neither of which were anaerobic bacteria susceptible to clindamycin. Meanwhile, amoxicillin increased E. coli. In both the metagenome and meta-transcriptome, ciprofloxacin increased the population of Akkermansia muciniphila, which is known to have antibiotic resistance to ciprofloxacin. It was found that in response to antibiotic exposure, gut bacteria regulated those genes which confer antibiotic resistance. Notably, the upregulation of fatty acid-related pathways, such as fatty acid synthesis and palmitoleate synthesis, which are known to be components of the prokaryotic defense mechanism, was identified in the amoxicillin and clindamycin groups as compared to the base and the control. As well as the upregulation of antibiotic resistance genes, multiple stress response genes, and biofilm regulator were observed in the amoxicillin and clindamycin groups. Additionally, DNA cytosine methyltransferases and DNA adenine methylases were also overexpressed. Only a few differentially expressed genes (DEGs) were not identified in the ciprofloxacin groups, as compared to amoxicillin and clindamycin. However, the abundance of S-adenosyl-L-methionine (SAM) biosynthesis, a common co-substrate involved in methyl group transfers, was higher than the base and the control. At both DNA and RNA levels, the target bacteria were depleted due to antibiotic stress, and the resistant bacteria survived with their genes demonstrating the potential for conferring antibiotics. Thus, hints regarding methylation and antibiotic resistance through methylases upregulation were obtained. To facilitate genome-centric DNA methylation analysis on both culturable and unculturable gut microbes, metagenome-assembled genomes (MAGs) and meta-epigenomics were employed. Various sequencing platforms, such as Illumina, Nanopore, and PacBio, were used to obtain high-quality MAGs. Then, assembly, binning, and refinement tools were processed, resulting in 481 MAGs from 33 rat gut microbiome data. Likewise, it was found that MAGs assigned to bacteria susceptible to antibiotics were depleted and diversity decreased under the three antibiotic stresses – amoxicillin, clindamycin, and ciprofloxacin. CARD-based antibiotic resistance genes (ARGs) annotation showed distinct ARGs composition of amoxicillin and clindamycin groups, although the dominance of ARGs corresponding to each antibiotic was found not to be consistent. When the ARGs retention of the top abundant MAGs was analyzed in each antibiotic group, those MAGs assigned to E. coli, and Terrisporobacter mayombei were found to be abundant in the clindamycin treatment group, which have many ARGs in their genome. In the case of ciprofloxacin groups, there were a total of four Enterenecus-assigned MAGs, one with 12 ARGs in its genome and one with zero. When MAGs with a high number of DNA methyltransferases in their genome were found, several MAGs with high abundance in each antibiotic group were identified. Notably, methyltransferases and restriction endonuclease with a recognition site of 6mA were found to be dominant. Therefore, to elucidate the relationship between DNA methylation and antibiotic resistance, genome-centric DNA methylation pattern observation focused on DNA adenine methylation. The amoxicillin-sensitive bacteria, Enterococcus faecalis (bin.21), showed both high abundance and high methylation frequency, with over 60% of the genome, upon amoxicillin exposure. Overexpression of beta-lactam-inducible penicillin-binding protein (pbp), which regulates affinity for amoxicillin, was observed, with the amoxicillin resistance of E. faecalis, by means of gene regulation by methylation, confirmed. In the case of Enterenecus, a Candidatus bacterium, a total of four MAGs were identified, all with a high relative abundance and high methylation frequency upon exposure to ciprofloxacin. Of the four MAGs, one MAG (bin.375) had no ARGs detected in its genome, while as many as 48 methylases were found in the other MAG (bin.374). Genome-centric DNA methylation analysis on Enterenecus (bin.375) revealed more than 90% of the genome to be methylated, and DNA gyrase and topoisomerase, which are targets of ciprofloxacin, were likewise methylated. These results do indicate that epigenetic regulation of gene expression plays a role in antimicrobial resistance. In this study, the genomes of culturable and unculturable bacteria in the rat gut microbiome were obtained by using diverse sequencing platforms, and MAGs with multi-omics approach was analyzed. The work presented in this thesis shows 6mA methylation leads to better survival under antibiotic stress. The identification of antibiotic resistance acquired by means of DNA methylation in sensitive or candidate bacteria, in addition to previously known means of antibiotic resistance, suggests that multi-omics approaches might be a key way to elucidate the mechanisms of antibiotic resistance, which is a growing problem worldwide. 장내 미생물 생태계는 장내에서 미생물 상호 작용의 균형을 이루고 있으며, 이들의 유전자와 대사산물은 호스트의 건강과 관련하여 중요하다고 여겨진다. 스트레스, 항생제, 수술 등 장내 미생물 군집의 균형에 영향을 미칠 수 있는 요인은 많으며, 이는 미생물 다양성 감소를 특징으로 하는 dysbiosis로 이어질 수 있다. 최근 항생제의 오남용과 남용은 병원성 박테리아의 항생제 내성 확산에 기여했으며 궁극적으로 인류 건강에 심각한 위협이 되고 있다. 박테리아는 치명적이지 않은 농도의 항생제 스트레스 하에서 적응성 항생제 내성을 갖게 될 수 있으며, 이는 박테리아 유전체의 후성유전학적 환경이 변화한 결과로 설명된다. 원핵생물의 후성유전학적 특성인 DNA 메틸화는 박테리오파지에 대한 방어 체계에 관여하고 유전자 발현과 같은 다른 세포 과정을 조절한다고 알려져 있으며, DNA 메틸화 프로파일의 변화는 박테리아의 상 변이를 조절하고 유전체 내 유전자의 발현 조절이 가능하다. 기술의 한계로 인해 원핵생물 DNA 메틸화는 배양 가능한 미생물에 집중되어 왔다. 그 결과, 환경에 존재하는 많은 배양 불가능한 미생물의 메틸화 시스템을 쉽게 이해할 수 없으며 박테리아 지놈수준에서의 메틸화 패턴을 특성화하기 어렵다. 최근 short-read시퀀서와 long-read 시퀀서 등 샷건 메타지놈과 관련된 다양한 기술의 발전으로 메타지놈-조립 유전체를 만들어 유전체 전반의 기능 프로파일링을 수행하고 미생물 계통수 기반의 핵심 정보를 제공할 수 있게 되었다. 본 연구에서는 멀티 오믹스 접근법에 기반한 통합 분석으로 쥐 장내 미생물이 항생제 스트레스에 어떻게 반응하는지, DNA 메틸화가 적응성 항생제 내성 발달과 어떻게 연관되는지 더 잘 이해하기 위해 앰플리콘 시퀀싱, 랜덤 샷건 메타지놈, 메타 전사체학 및 메타 후성유전체학이 사용되었다. 먼저, 앰플리콘 시퀀싱을 통해 리보솜의 50S 서브유닛에 있는 23S rRNA를 표적으로 하는 클린다마이신에 노출된 쥐에게서 장내 미생물 불균형(dysbiosis)이 관찰되었다. 세 번의 반복 실험을 통해 클린다마이신은 클린다마이신에 민감한 장내 미생물과 미생물 다양성을 감소시켰고, 미생물 상호 작용을 방해하여 쥐의 체중이 감소시켰다. 다음으로 쥐를 기준 그룹(baseline), 대조군(control), 클린다마이신, 아목시실린, 시프로플록사신 등 5개 그룹으로 분류했다. 이를 통해 메타유전학과 메타전사체학을 사용하여 서로 다른 메커니즘으로 박테리아 성장을 억제하는 다양한 항생제에 따른 쥐의 장내 미생물군집의 뚜렷한 변화를 확인하였다. 메타유전체와 메타전사체 모두 시프로플록사신은 기본 및 대조군과 비교했을 때 미생물 다양성이나 미생물 군집에 큰 변화를 일으키지 않는 것으로 나타났다. 아목시실린과 클린다마이신은 모두 Firmicutes의 상대적 풍부도(abundance)를 감소시키고 Proteobacteria의 abundance를 증가시키며 장내 미생물 다양성을 감소시켰다. 속 수준에서 클린다마이신은 클린다마이신에 취약한 혐기성 박테리아를 감소시키고, Escherichia coli와 Proteobacteria bacterium CAG-139의 abundance를 증가시켰다. 반면 아목시실린은 E. coli를 증가시켰다. 메타유전체와 메타전사체 모두에서 시프로플록사신은 시프로플록사신에 항생제 내성을 가진 것으로 알려진 Akkermansia muciniphila의 abundance가 높았다. 항생제 스트레스에 반응하여서는 장내 세균이 항생제 내성 유전자(ARG)의 발현을 조절하는 것으로 확인되었다. 특히, 아목시실린과 클린다마이신 그룹에서 원핵생물 방어 메커니즘의 구성 요소로 알려진 지방산 합성 및 팔미톨레산염 합성과 같은 지방산 관련 경로의 과발현이 확인되었다. 아목시실린과 클린다마이신 투여군에서는 항생제 내성 유전자, 여러 스트레스 반응 유전자, 바이오필름 조절 유전자 등이 과발현되었다. 또한 DNA cytosine 메틸전달효소와 DNA adenine 메틸화 효소도 과발현되었다. 아목시실린과 클린다마이신에 비해 시프로플록사신 그룹에서는 차별적으로 발현되는 유전자(DEG)가 많이 확인되지 않았다. 그러나 메틸기 이동에 관여하는 일반적인 공동 기질인 S-아데노실-L-메티오닌(SAM) 생합성의 abundance는 모든 항생제 그룹에서 염기 및 대조군보다 높았다. DNA와 RNA 수준 모두에서 항생제 스트레스로 인해 표적 박테리아의 abundance가 감소하고, 내성 박테리아는 항생제 내성 유전자의 발현을 조절하는 것으로 확인되었다. 이를 통해 메틸화 효소 상향 조절을 통한 메틸화 및 항생제 내성에 대한 힌트를 얻었다. 다음으로 배양 가능한 장내 미생물과 배양 불가능한 장내 미생물 모두에 대한 지놈 중심 DNA 메틸화 분석을 용이하게 하기 위해 메타지놈 조립 지놈(MAG)과 메타 후성유전체학이 사용되었다. High-quality MAG을 확보하기 위해 Illumina, Oxford Nanopore Technologies, PacBio등 다양한 시퀀싱 플랫폼을 사용하였고, 쥐 장내 미생물로부터 481개의 메타지놈-조립 유전체를 재구성하였다. 그 결과, 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 아목시실린, 클린다마이신, 시프로플록사신 등 세 가지 항생제 스트레스 하에서 해당 항생제에 취약한 미생물로 분류되는 MAG이 감소하고 장내 미생물 다양성이 감소하는 것으로 나타났다. ARG는 아목시실린과 클린다마이신 그룹에서 높은 abundance를 보였으나, 각 항생제 그룹에 해당하는 ARG의 우세성은 일관되지 않은 것으로 나타났다. 각 항생제 그룹에서 가장 많이 존재하는 MAG의 ARG 보유량을 분석한 결과, E. coli, Terrisporobacter mayombei 등이 클린다마이신 처리 그룹에서 유전체 내에 ARG를 많이 보유한 것으로 나타났다. 시프로플록사신 처리 그룹의 경우, 총 4개의 MAG이 Enterenecus로 분류되었는데, 한 MAG은 유전체 내에 12개의 ARGs를 보유한 반면, 다른 MAG은 유전체 내에 ARG가 하나도 발견되지 않았다. 유전체 내 DNA 메틸전달효소 수가 많은 MAG을 분석한 결과, 각 항생제 그룹에서 높은 수의 DNA 메틸전달효소를 가지는 MAG이 여러 개 확인되었다. 특히 DNA 메틸전달효소 중에서도 인식 부위가 6mA인 메틸전달효소와 제한 엔도뉴클레아제가 우세한 것으로 나타났다. 따라서 DNA 메틸화와 항생제 내성의 관계를 규명하기 위해 DNA 아데닌 메틸화에 초점을 맞춘 유전체 중심의 DNA 메틸화 패턴 관찰을 진행했다. 아목시실린에 민감한 박테리아인 Enterococcus faecalis(bin.21)는 아목시실린 노출에도 높은 abundance를 보이고, 유전체의 60% 이상에서 높은 메틸화 빈도를 보였다. 아목시실린에 대한 affinity를 조절하는 베타락탐 유도성 페니실린 결합 단백질(pbp)의 과발현이 관찰되었다. 따라서, 메틸화에 의한 유전자 조절을 통해 E. faecalis의 아목시실린 내성이 확인되었다. 칸디다투스균인 Enterenecus 경우 총 4개의 MAG이 확인되었는데, 모두 시프로플록사신 스트레스에도 높은 abundance와 메틸화 빈도가 확인되었다. 4개의 MAG 중 하나의 MAG(bin.375)의 유전체에서는 ARG가 검출되지 않았고, 다른 MAG(bin.374)에서는 48개의 메틸전달효소가 발견되었다. Enterenecus(bin.375)에 대한 유전체 중심 DNA 메틸화 분석 결과, 유전체의 90% 이상이 메틸화된 것으로 나타났으며, 시프로플록사신의 표적이 되는 DNA 자이라아제와 토포이소머라제 역시 마찬가지로 메틸화된 것으로 나타났다. 이러한 결과는 유전자 발현의 후성유전학적 조절이 항생제 내성에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 이 연구에서는 다양한 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 쥐 장내 미생물 군집에서 배양 가능한 박테리아와 배양 불가능한 박테리아의 지놈을 확보하였고, 멀티 오믹스 접근으로 MAG을 분석하였다. 항생제 스트레스 하에서 6mA 메틸화를 통한 유전자 발현 조절이 항생제 내성에 관여한다는 새로운 증거를 제안할 수 있으며, 기존에 알려진 항생제 내성 기작 외에도 민감성 또는 병원균 후보 박테리아에게서 DNA 메틸화를 통해 획득한 항생제 내성을 확인한 것은 멀티 오믹스 접근법이 전 세계적으로 문제가 되고 있는 항생제 내성의 메커니즘을 규명하는 데 중요한 방법이 될 수 있음을 시사한다.

메타지노믹스 기법을 이용한 수질정화용 흙공의 미생물 군집 변화 분석

박건석 경북대학교 대학원 2013 국내석사

To improve the stream water quality, different methods are employed which involve physical, chemical and biological processes. Recently people use soil ball with effective microbes for stream water quality improvement. However, the pH of these soil balls is acidic (around pH 4.0) which are not suitable for diverse microbes’ growth. As well the soil balls are not hard enough and quickly dissociate under the stream water. In order to overcome this problem, various materials were added to increase the strength as well pH of soil balls. As a result the hardness of soil balls of pH 7.54 was increased almost three folds in comparison with pH 4.48 of the soil balls. Additionally microbial community was determined from soil ball’s whole metagenomic DNA using personal genome machine (Ion Torrent). The raw data were analyzed through the MG-RAST server. The microbial community of pH 4.48 sample was represented by 96.1% Bacteria, 2.7% Eukaryota, and 1% Archaea while the pH 7.54 sample was represented by 71.4% Bacteria, 27.9% Eukaryota, and 0.2% Viruses. Especially in comparison to pH 4.48 sample the Eukaryotic community diversity increased highly in pH 7.54 sample. These results suggest that our method is effective by increasing the stability of soil balls as well change in community from prokaryotes to eukaryotes which may improve the small stream water quality

다중 메타오믹스 분석 기반 한국 된장 메주와 된장의 발효 특성 연구

한동민 중앙대학교 대학원 2024 국내박사

한국의 전통 콩 발효 식품은 주변 환경에서 유래된 복잡한 미생물 군집에 의한 발효과정을 통해 제조된다. 한국의 전통 콩 발효 식품의 대사 특성과 발효 특성을 밝히기 위해 메타오믹스 분석을 활용하여 대표적인 한국의 콩 발효 식품인 된장 메주와 된장을 분석하였다. 가장 먼저 이전 연구에서 된장의 재료인 된장 메주의 주요 발효 세균으로 밝혀진 Bacillus와 유산균에 대한 발효 특성을 밝히기 위해 Aspergillus oryzae와 Bacillus velezensis (BDM) 또는 A. oryzae와 Leuconostoc mesenteroides (LDM)를 접종한 두 종류의 된장 메주를 제조하고 다양한 특성을 분석하였다. 그 결과 된장 메주의 대사체 함량에 영향을 주는 된장 메주 내 효소활성 수준과 Aspergillus 종의 풍부도는 된장 메주에 접종한 세균인 Bacillus와 Leuconostoc의 고유한 특성과 관련되어 있음이 밝혀졌다. 추가로 된장 메주의 주요한 발효 곰팡이 A. oryzae와 식중독을 일으키는 것으로 알려진 A. flavus 종들의 계통학적, 유전체적, 대사적 특성을 분석하고 비교하였다. A. oryzae와 A. flavus의 유전체는 계통학적 분석과 아플라톡신 생합성 유전자군의 유무로는 서로 명확하게 구분되지 않았으며, A. oryzae와 A. flavus 균주는 매우 유사한 대사적 특성을 보유하고 있었다. 이러한 결과는 두 곰팡이 종이 실제로는 동일한 종에 속해 있을 수 있음을 시사한다. 된장 메주의 주요 발효 곰팡이 A. oryzae의 된장 메주 발효 시의 발효 특성을 조사하기 위해 A. oryzae와 B. velezensis를 접종한 된장 메주를 제조하고 45일의 발효 기간 동안 A. oryzae의 전사체를 분석하였으며, A. oryzae의 바이오매스 분해 및 탄소 화합물 대사 유전자와 이차 대사산물 생합성 유전자는 발효 단계에 따른 다양한 발현량을 나타내었다. 마지막 된장 메주 연구에서는 자연 발효된 된장 메주를 제조하고 발효 기간 동안 된장 메주의 내 바이오매스의 양과 대사물질의 농도 및 된장 메주 마이크로바이옴의 메타지놈(metagenome)과 메타트랜스크립톰 (metatranscriptome)을 분석하였다. 미생물 억제제를 처리한 된장 메주에서는 바이오매스의 분해와 대사물질의 생성이 거의 일어나지 않았으며 이를 통해 된장 메주의 발효가 주로 미생물 활동을 통해 이루어 진다는 사실을 확인하였다. 메타지놈 분석을 통해 Aspergillus, Bacillus, Enterococcus종들을 된장 메주의 주요 발효 미생물로 식별하였으며, 해당 미생물종들의 고품질 유전체에 메타트랜스크립톰 염기서열을 매핑(mapping)하여 해당 미생물종들이 가진 유전자의 전사 발현을 분석하였다. 또한 된장 메주 우점 미생물의 탄수화물, 지질, 단백질 분해 경로 및 유리당과 아미노산 대사 경로를 재구성하였다. 분석 결과 각 미생물은 발효 기간에 따른 대사 유전자의 전사 패턴의 변화를 보였으며 발효 기간 동안 각자 다른 대사 작용을 수행하였다. 마지막으로, 된장의 일반적인 발효 특성을 조사하기 위해 열한 개의 다른 지역에서 수급한 된장 메주를 비롯한 된장의 재료들을 사용하여 열한 종의 된장을 제조하고 발효 기간 동안의 된장 내 세균 및 곰팡이 군집과 대사물질 프로파일을 분석하였으며, Spearman 상관관계 분석을 통해 된장 발효에서 향미 성분의 생산에 중요한 역할을 수행할 것으로 예상되는 일부 미생물을 확인하였다. Korean traditional fermented soybean foods undergo fermentation involving a complex microbial community derived from the surrounding environment. To understand the metabolic and fermentative features of Korean fermented soybean foods, multi-metaomics approaches were employed to analyze doenjang-meju and doenjang. To investigate the fermentative characteristics of Bacillus and lactic acid bacteria, key bacterial microbes known to be involved in doenjang-meju fermentation, we prepared and analyzed two sets of doenjang-meju inoculated with either Aspergillus oryzae and Bacillus velezensis (BDM) or A. oryzae and Leuconostoc mesenteroides (LDM). The enzyme activity profiles and Aspergillus abundance related to metabolite contents, were associated with the characteristics of Leuconostoc and Bacillus. Comprehensive phylogenetic, genomic, and metabolic characteristics of A. oryzae, the key fungal microbe in doenjang-meju, and A. flavus, a well-known food poisoning fungus, were investigated and compared. Phylogenetic analyses and aflatoxin biosynthesis gene cluster profiles did not reveal clear differentiation between A. oryzae and A. flavus genomes. Furthermore, A. oryzae and A. flavus strains displayed remarkably similar metabolic features. These findings underscore the phylogenetic, genomic, and metabolic homogeneity of A. oryzae and A. flavus, potentially suggesting their membership within the same species. To investigate the fermentative features of A. oryzae in doenjang-meju, a doenjang-meju set inoculated with both A. oryzae and B. velezensis was prepared, and the transcriptomes of A. oryzae were analyzed over a 45-day fermentation period. Genes related to biomass decomposition, carbon compound metabolism, and secondary metabolite biosynthesis displayed unique and different transcriptional expression patterns and levels, contingent on the specific gene and fermentation stage. To investigate the metabolic features of doenjang-meju, spontaneously fermented doenjang-meju bricks were prepared, and the amounts of biomasses, concentrations of metabolites, metagenomes, and metatranscriptomes were analyzed during fermentation periods. Amounts of biomasses and metabolites in doenjang-meju with microbial inhibitors revealed that biomasses degradation and metabolite generation of doenjang-meju mainly occur through microbial activity. Through taxonomic profiling of metagenome reads, Aspergillus, Bacillus, and Enterococcus were identified as the major microorganisms in doenjang-meju, and their transcriptional expression of genes was analyzed by mapping the metatranscriptome reads to their high-quality genomes. Metabolic pathways utilized by predominant microorganisms in doenjang-meju for the degradation of carbohydrate, lipid, and protein biomasses, as well as the metabolism of free sugars and amino acids, were reconstructed. Each microorganism exhibited distinct peaks of activity during specific fermentation stages, and contributed unique roles during fermentation period. Finally, to investigate the general fermentation features of doenjang, eleven batches of doenjang-meju were prepared, and their bacterial and fungal communities, as well as metabolites, were analyzed during fermentation. Spearman correlation analyses suggested certain microbes that may play important roles in the production of flavor compounds during fermentation.

Microbial Function of Denitrification on Nitrous Oxide Production in Nitrogen-Rich Wastewater Treatment : 고농도 질소폐수 처리 공정 내 N2O 생성에 관한 미생물학적 탈질 기능 연구

Lee, Jangho 연세대학교 일반대학원 2016 국내박사

주요 온실가스인N2O는 고농도 질소 폐수 처리를 위한 생물학적 질소 저감 공정(BNR) 내 탈질 기작을 통해 발생한다. BNR 공정 종류에 따라서N2O 생성율이 다르나, 고농도 질소 폐수처리 BNR공정 별 N2O 생성에 대한 미생물학적 기능 정보는 제한적이다. 본 논문에서는 기능성 미생물 메타지노믹스를 이용하여, 고농도 질소 폐수처리를 위한 BNR 공정(질산화, 종속영양 탈질화, 조류-박테리아 공정)에서의 N2O 생성 및 미생물 군집 특성에 대한 연구를 수행하였다. 호기성 생물막 공정 (MABfR)을 이용한 빈영양성 질산화 조건에서 성장한 군집의 유전체를 DNA 수준의 Shotgun 메타지놈 시퀀싱한 결과, nosZ 를 가지고 있는 않은 독립영양 및 종속영양 탈질 미생물이 증가함이 N2O 증가의 원인임을 확인하였다. 종속영양 탈질화 공정에서의 탄소 (acetate) 농도를 변화한 실험 조건에서 성장한 미생물 군집을 RNA 기반으로 탈질 유전자 메타지놈 시퀀싱을 이용하여 분석한 결과, 탄소 기질이 부족한 조건에서 N2O발생이 증가하였고, 이 N2O 증가는 nosZ를 보유하지 않고, norB 의 활성을 띄는Acidovorax 가 선택적으로 우점화 됨에 기인한 것으로 파악되었다. N2O 무발생 조류 단일 균주 (Selenastrum gracile UTEX325)와 nosZ 없는 박테리아 단일 균주 (Prosthecobacter algae EBTL04T)를 혼합 배양한 결과 N2O 생성이 앞에서 언급된 박테리아 군집제재들의 경우보다 현격하게 감소하였다. 탄소기질노출 정도와 미생물 군집에 따라서 N2O 발생에 크게 영향을 줄 수 있음을 본 연구의 결과로 알 수 있었고, 이는 온실가스인 N2O 발생을 감소하기 위해서는 탄소기질농도의 운전조건과 적절한 미생물 군집제재의 선정이 중요함을 시사한다. Nitrous oxide (N2O) is known as a major greenhouse, and it is highly produced during denitrification pathways in biological nitrogen removal (BNR) processes for nitrogen-rich wastewater treatment. N2O production could differ depending upon different BNR processes. However, little is known about microbial functional roles in N2O production of different BNR processes, especially for nitrogen-rich wastewater treatment. In this dissertation, N2O production and its bacterial population dynamics in BNR processes (i.e., nitrification, heterotrophic denitrification, and algal-bacterial process) for nitrogen-rich wastewater treatment were explored using functional microbial metagenomics. Shotgun metagenomic DNA sequencing of N2O producing microbial communities under oligotrophic nitrifying conditions in membrane-aerated biofilm reactors (MABfRs) revealed that N2O production increased with increased growth of autotrophic and heterotrophic denitrifiers lacking nosZ. RNA-level functional gene-targeted microbiome analyses of N2O producing heterotrophic denitrifying communities under fluctuating organic carbon substrate (acetate) exposure conditions showed that high N2O production occurred at carbon substrate limiting condition, and suggested that the predominance of PHB (polyhydroxybutyrate) utilizing Acidovorax expressing norB and lacking nosZ may have resulted in the high N2O production. A co-culture of an algal isolate (Selenastrum gracile UTEX325) exhibiting no N2O production and a bacterium isolate (Prosthecobacter algae EBTL04T) growing onto algal metabolites having no nosZ gene resulted in much lower N2O production than the bacterial denitrification cases mentioned above. The different N2O production depending upon the carbon exposure conditions and bacterial population dynamics in the BNR processes provide implications on the importance of carbon sufficient exposure conditions and optimal selection of microbial communities in term of mitigation of greenhouse gas emission from nitrogen rich wastewater treatment.

Comparison of oral microbiota in patients with medication-related osteonecrosis of the jaw through oral microbiome analysis

김헌영 Graduate School, Yonsei University 2023 국내박사

ABSTRACT Comparison of oral microbiota in patients with medication-related osteonecrosis of the jaw through oral microbiome analysis Heon-Young Kim Department of Dentistry The Graduate School, Yonsei University (Directed by Professor Young-Soo Jung) Medication-related osteonecrosis of the jaw (MRONJ), which occurs due to drugs like antiresorptive agents, was first introduced in 2003 and is one of the most severe complications reported over the past 20 years. The prevalence of MRONJ has increased due to an increase in the number of patients receiving oral or intravenous bisphosphonates, receptor activator of nuclear factors κB ligand inhibitors, or drugs with antiangiogenic effects. However, the etiology of MRONJ has not been fully understood. No disease-causing markers have been identified, and a single model that explains the macroscopic and microscopic morphological changes in MRONJ has not been possible. Recently, oral bacteria have been suggested to play an important role in the pathogenesis of MRONJ. The purpose of this study was to identify the oral microbiome in MRONJ. Fifteen patients who had confirmed MRONJ and visited the Department of Oral and Maxillofacial Surgery at Yonsei University Dental Hospital between 2021 and 2022 were recruited for this experiment. Samples from the affected and non-affected sides of patients diagnosed with MRONJ were collected. The composition and enumeration of the microbial community were analyzed, and diversity was compared to verity the ecological changes in groups using a next-generation sequencing-based 16S metagenomic analysis. The following results were obtained. 1. Although there was no significant difference in bacterial types between the non-affected and affected areas, we observed variations in the composition and coefficient in the microbiome analysis, which was performed at the phylum, genus, and species levels. 2. The identified microorganisms included many species known to cause periodontitis, gingival disease, and root canal infections. It can be inferred that MRONJ may occur due to various factors rather than being solely attributed to specific microorganisms. Understanding the interactions and functional aspects among these microorganisms may contribute to our comprehending of the etiology of MRONJ. 3. Addressing these limitations through larger-scale studies will further clarify the importance of oral bacteria in the pathogenesis of MRONJ and facilitate the development of effective therapeutic interventions for patients with MRONJ.

Microbial function of denitrification on nitrous oxide production in nitrogen-rich wastewater treatment

이장호 Graduate School, Yonsei University 2016 국내박사